海洋環境暴露下生物膜對微塑料的理化性質和環境行為影響研究進展

李大圳，章宇晴，付茜茜，馮丹，趙媛媛，俞花美，鄧惠，葛成軍

1.海南省農林環境過程與生態調控重點實驗室，海口 570228

2.海口市環境毒理學重點實驗室，海口 570228

3.海南大學生態與環境學院，海口 570228

塑料污染、氣候變暖、臭氧損耗和海洋酸化是當前亟需關注的全球重要環境問題[1]。塑料制品的大量使用和無序處置使得每年約有1 000萬t塑料進入海洋，預計到2050年全球的海洋塑料垃圾將會超過海洋中魚類的數量[2]。一般定義粒徑或大小<5 mm的塑料為微塑料[3]。環境中微塑料的來源分為2類：一類由海洋塑料經波浪、風化和降解等作用的分解產生；另一類是目的性生產的塑料微球和洗衣廢水中的纖維等[4-5]。微塑料本身含有壬基酚和溴化阻燃劑等內分泌干擾物和致癌物[6-7]，同時由于其高比表面積和疏水性，微塑料易吸附重金屬、多環芳烴、多氯聯苯和雙酚A等污染物，且微塑料-污染物復合體可被海洋生物誤食，導致海洋生物的腸道堵塞和病理損害的雙重毒性作用[7-10]。隨后，微塑料及其吸附的污染物能夠通過食物鏈富集，最終危害人體健康[11-13]。

因微塑料具有比表面積大、難降解和較強的吸附能力等特性，其可作為微生物的保護性和營養性載體，給微生物提供穩定的棲居環境和豐富的營養底質[14-15]。微生物能在微塑料表面迅速寄居并大量生長繁殖，形成一個由異養菌、自養菌和共生體等組成的多樣化微生物群落，稱之為“plastisphere”(塑料圈)[14]。近年，越來越多的研究表明生物膜與微塑料的互作對海洋環境的影響不容小覷。微塑料作為一種獨特的生態位點，可以改變微生物群落結構，影響微生物功能(如對碳和氮的獲取和循環)[16-17]。同時由于微塑料的保護和載體作用，其表面附著的微生物群落及吸附的污染物在海洋中的穩定性得以增強，并易造成更加嚴重的潛在生態風險[15,18]。另外，微塑料生物膜上極易寄居一些致病菌落。例如，Vir?ek等[19]首次從暴露于北亞得里亞海的微塑料上鑒定出致病性魚類細菌殺鮭氣單胞菌；Wu等[20]在微塑料圈中檢測到2種潛在人類病原體(Pseudomonasmonteilii和Pseudomonasmendocina)和一種植物病原體(Pseudomonassyringae)，而在自然基質上形成的生物膜中未檢測到致病菌。

生物膜的形成能夠顯著改變微塑料的理化特性，進而影響其環境歸趨。例如，生物膜的形成改變了微塑料的表面官能團和疏水性能，進而增強其對水環境中痕量金屬、有機污染物的吸附能力[21-22]。同時附膜后的微塑料，其外觀、氣味和味道都更像食物，更易被海洋動物攝食[23]。近年來，微塑料逐漸成為環境領域的熱點話題，相關研究成果也不斷產出和豐富。目前關于微塑料的綜述主要側重于其本身在環境中的賦存特征、生態毒性和環境行為方面，并未對影響其在環境中遷移和歸趨的環境因素進行系統歸納[24]。因此，本文從微生物的角度，綜述了海洋環境中微生物的定殖對微塑料微觀形貌、晶體結構、密度和疏水性等理化性質的影響，并進一步討論了生物膜的形成對其沉降、吸附等環境行為的影響及其機理，對科學地評價微塑料的長期環境效應、預測微塑料的生態風險具有重要意義。

1 生物膜的形成對微塑料理化性質影響(Effects of biofilm formation on physicochemical properties of microplastics)

隨著微生物的定殖，微塑料的理化性質逐漸發生改變，主要表現在其密度增大、粒徑減小、疏水性降低、粗糙度增大、結晶度降低、微觀形貌及表面電荷發生變化等[25-28]。測定微塑料理化性質的方法如圖1所示。

1.1 微塑料表觀形貌的改變

微塑料表觀形貌的改變表現在其形貌破碎、粒徑減小、顏色變黃、粗糙度和比表面積增大。陳濤[29]、Brandon等[30]和Li等[31]采用原位暴露實驗，發現暴露于近海環境下聚乙烯(polyethylene,PE)、聚丙烯(polypropylene,PP)等微塑料的表面形貌存在破碎現象，其粒徑也顯著減小，這主要歸因于海洋環境中的物理碰撞、機械摩擦和光氧化等作用[32]。同時微塑料的顏色變黃[29]，可能是由于藻類和微生物在基質表面的附著。SEM的結果(圖2(a)和圖2(b))也證實微塑料表面定殖有棒狀、絲狀、球形、柵欄狀、盒狀、螺旋狀的細菌以及藻類和蟲類等生物[14,33-37]。由于微生物的附著，微塑料的表面變得粗糙，并產生孔隙和折痕[31,38](圖2(c))。這些產生的孔隙、折痕結構和黏附在微塑料表面的微生物分泌物一起使得微塑料的粗糙度和比表面積增大[14]。此外，Zettler等[14]和Reisser等[37]通過SEM觀察發現微塑料表面具有符合微生物形狀的凹坑和凹槽(圖2(d))，表明生物膜上的微生物可能對微塑料降解起到重要作用。基于此，前人開展了大量關于海洋環境下微塑料降解菌的研究[27,39-43]。例如，Harshvardhan和Jha[40]研究發現KocuriapalustrisM16、BacilluspumilusM27和BacillussubtilisH1584均能使PE發生生物降解，且在30 d內PE的質量損失分別為1%、1.5%和1.75%。塑料降解菌的存在促使微塑料自身的理化性質發生變化，如形狀改變、質量及分子量減小、粗糙度增大、疏水性降低、結晶度和官能團變化等[37,39-40,44-46]，其環境行為也隨之發生改變，但微塑料降解所帶來的新的環境效應還難以有效界定。同時需要加強關于從自然環境中篩選和鑒定微塑料降解能力強的降解菌的研究，這對微塑料在海洋中的風險防控具有重要意義。

圖2 微塑料表面SEM圖注：(a)微塑料表面豐富的微生物群落[35]；(b)形態各異的微生物[37]；(c)微塑料表面的孔隙和折痕[31]；(d)微塑料表面符合微生物形狀的凹坑和凹槽[37]。Fig.2 SEM images of the surface morphology of microplasticsNote:(a) Abundant microbial communities on the surface of microplastics[35];(b) Microorganisms with various shapes[37]; (c) Pore and creases on the surface of microplastics[31];(d) Pits and grooves on the surface of microplastics due to microorganism adhesions[37].

1.2 生物膜的表面成分和立體結構

前人利用掃描電鏡-能譜儀對微塑料附著生物膜的表面成分進行了深入探究。Leiser等[47]研究發現孵育PE微塑料的籠壁生物膜主要由水(約占生物膜質量的77%)、有機物質(約2%)和無機成分(約21%)組成(鑒于籠壁生物膜和PE表面生物膜的相似性，可外推至微塑料顆粒)。微塑料表面生物膜中含量最多的元素是碳，其次是氧，然后是硅、鋁和鐵，其余元素如鈣、氯、鉀、鎂、錳、鈉、磷、硫和鈦的含量最少[48-49]。激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(laser scanning confocal microscopy,LSCM)的結果表明，隨著暴露時間的延長，微塑料表面的生物膜不斷增厚[29,34]。如圖3所示[50-51]，在暴露初期，生物膜內以活細胞為主，隨著暴露時間的延長，活菌大量繁殖，并開始產生少量死細胞，產生的死細胞又逐漸失去黏附能力，從基質上脫落[29,33]，同時產生蛋白質、多糖等胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)。生物膜表面EPS的含量隨著暴露時間的增加而不斷升高[29,34,52]。鑒于EPS能夠顯著影響微生物在微塑料上的定殖及生物膜的形成，進而影響微塑料的環境行為[53-54]，因此研究微塑料表面生物膜EPS對微塑料及共污染物環境行為的影響具有重要意義，但目前此方面的研究還極為少見。

圖3 微塑料表面生物膜的形成過程Fig. 3 Succession of biofilm on microplastic surface

1.3 微塑料表面生物膜的群落結構

前人采用宏基因組學技術對微塑料上的微生物進行了鑒定，發現在生物膜形成初期，以α-變形菌綱和γ-變形菌綱為主的微生物率先大量定殖[55-56]，后逐漸形成以變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)，假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、紅細菌科(Rhodobacteraceae)和赤桿菌科(Erythrobacteraceae)，芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)為優勢菌的生物膜群落結構[31,57-61]。隨后藻類開始大量附著(包括硅藻門、綠藻門和藍藻門等)，并逐漸占據生物膜的主要空間[47,62-64]。附著的微生物能夠有效聯系微塑料表面的生物和非生物過程，如對碳的利用，參與氮磷循環等，進而影響微塑料在海洋環境中的命運[65-67]。因此微塑料上微生物介導的生物地球化學循環過程值得深入研究和討論。另外，研究證明生物膜中鞘翅目(Coleoptera)中的部分成員(如赤桿菌科(Erythrobacteraceae)和紅桿菌屬(Erythrobacillus))以及優勢門厚壁菌門能夠降解芳香烴和鹵代烴類污染物[68-69]，而芽孢桿菌屬(Bacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、節桿菌屬(Arthrobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)具有降解塑料基質的潛力[28,39,69]，因此未來可能需要更多的研究探討微塑料表面微生物對吸附污染物和基質本身的降解。同時在微塑料表面生物膜中也發現了Arcobacterspp.、Colwelliaspp.、Escherichiaspp.和Pseudomonasspp.等潛在致病菌屬及有害硅藻物種[69]。但微塑料表面定殖的致病菌的來源和特征解析，以及其對微塑料在海洋中的生態毒性影響，還亟待研究。

1.4 微塑料表面官能團和晶體結構的改變

1.5 微塑料其他性質的改變

生物膜的附著會導致微塑料密度增大，從而易在水體中沉降[25,29,36,76]。但是張晨捷等[36]在海岸帶環境對低密度聚乙烯(low density polyethylene,LDPE)的研究表明，長時間的暴露后微塑料的密度反而會減小，其原因可能是非生物因素和生物因素的共同作用導致微塑料表面發生風化，聚合物鏈斷裂。因而暴露于水體的微塑料可能會由于密度的變化而發生反復的沉降和再懸浮行為。Lobelle和Cunliffe[25]、陳濤[29]和Tu等[34]的研究顯示，隨著暴露時間的增加，生物膜逐漸形成，而形成于微塑料表面的親水性生物膜降低了微塑料的疏水性。另外，Wang等[77]的研究表明，附著的生物膜降低了微塑料表面的Zeta電位。微塑料這些性質的改變進一步影響微塑料表面微生物的定殖及其環境行為，但目前對于三者間的關系還有待深入研究。

1.6 微生物定殖的影響因素

影響微生物定殖的因素主要表現在3個方面：基質自身結構和性質[35,68,78]、環境條件(暴露時間[25,29,34]、營養物質[59,79]、鹽度[55,58-59,79]、季節變化[63,74,80]、地理位置[80]、溫度[81]、光照[68]、pH[71])和其他化學因素(如表面活性劑[68]、溶解性有機碳[82]、抗生素和金屬[78])。

1.6.1 微塑料自身結構和性質

微塑料的疏水性、粗糙度是影響微生物群落結構的重要因素[35]，而其形狀、粒徑等性質對微生物群落影響不大[68]。較低的疏水性，較高的粗糙度和比表面積往往使微塑料表面含有豐富的生物量，因為其為微生物在微塑料表面的定殖提供更多的接觸位點[83]。因此，在相同暴露時間下，PE表面生物膜密度最高[83-84]。

1.6.2 環境條件

與微塑料類型相比，環境因素更能夠影響微生物的定殖[31,85]。生物膜密度通常隨著暴露時間、營養物質含量(總氮和總磷)的增加而增加，隨著暴露深度和鹽度的增加而降低[25,29,34,79,86]。季節不同，微塑料表面微生物群落結構也顯著不同，且從冬季到夏季，微塑料上附著生物膜厚度不斷增加[63,87]，微生物群落的季節性變化可能與溫度和光照有關，因為在適宜溫度范圍內，較高的溫度會增加細胞代謝，促進微生物繁殖，微生物群落結構也更豐富[80-81]。而光照對微生物定殖的影響主要表現在3點：光照使得微塑料氧化分解后，其表面變得更粗糙，具有更多的孔、裂紋和凹槽，能夠提供微生物更多的附著位點[68]；部分微生物能夠利用微塑料分解釋放的烷烴、烯烴、酮、醛和醇等小分子產物進行自身的分解代謝[88-92]；微塑料被光氧化分解后易形成一些羰基、酯基、乙烯基和羥基等極性官能團并導致其疏水性的降低，促進其與微生物的接觸[71,74,93]。溫度和光照對微生物定殖的影響也解釋了為什么隨著暴露深度的增加，微塑料表面生物膜密度降低[86]。相較于基質自身結構，環境因素對微塑料上微生物定殖的影響更為強烈，但是目前關于各環境因子對微生物定殖的影響強弱、各環境因子之間對其定殖的協同作用還有待于研究。

1.6.3 其他化學因素

在實際環境中一些化學因素的存在對微生物定殖的影響不容忽視，因為其可能直接影響到微塑料的生態毒性。例如，表面活性劑的存在能夠降低微塑料表面的疏水性，促進微生物對微塑料的接觸，同時潛在病原菌更傾向于在含有表面活性劑的微塑料上定殖[68]；抗生素和金屬的存在能顯著降低微塑料上細菌群落結構的豐富度，且多種抗生素的復合污染會導致更強的抑制作用，同時抗生素和金屬的存在還可能會促進攜帶抗生素抗性基因和金屬抗性基因的細菌大量繁殖[78]。但目前對微塑料表面攜帶抗性基因的微生物的相關研究還比較缺乏，其給海洋環境帶來的新的生態效應還有待探究。

2 生物膜的形成對微塑料環境行為的影響(Effects of biofilm formation on environmental behavior of microplastics)

微生物在微塑料表面大量繁殖改變了微塑料的理化性質，進而影響其沉降行為和吸附行為。圖4展示了海洋環境下附著生物膜前后微塑料環境行為的改變。

圖4 海洋環境下附著生物膜前后微塑料的環境行為改變注：紅色和綠色箭頭分別表示微塑料對有機污染物和重金屬的吸附機理。Fig.4 Environmental behavior of microplastics before and after biofilm attachment in the marine environmentNote:The red and green arrows represent the adsorption mechanism of organic pollutants and heavy metals by microplastics respectively.

2.1 沉降行為

PE、PP和PS等密度較低的微塑料在海洋水體中以分散或懸浮固體顆粒的形式存在[94]，但是聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)、PET和聚酰胺(polyamide,PA)等相較于海水密度更大的微塑料，則會沉降于海洋沉積物中[7,54,95]。研究表明生物膜形成增大了微塑料密度，使原本漂浮在海面和懸浮在海水中密度較輕的微塑料發生沉降作用[25,63,85,96-97]。且微塑料比表面積越大，生物膜形成速度越快，微塑料的沉降行為越快發生[97]。當微塑料下沉至一定深度時，由于微塑料表面生物膜得不到足夠的營養物質和光照，又會逐漸脫落，微塑料又重新浮出水面漂浮[97]。沉降使得原本漂浮在海面易受到光降解的微塑料變得不易降解。

關于生物膜對微塑料沉降遷移行為的影響，學界已開展了一定研究。例如，Kooi等[98]設計了一個數學模型來模擬海洋環境中生物膜及其他環境因素對微塑料垂直遷移行為的影響，為微塑料在海洋中遷移的模型化探究提供了一個開端。Kaiser等[62]研究發現由于生物膜的形成，在河口和大西洋水中暴露2周的PS的沉降速度較原始顆粒分別增加了5%和6%。Leiser等[47]的研究顯示在富營養化水庫中暴露29 d后，約10%～15%的PE由于生物膜的形成而失去浮力下沉。進而學者對其沉降機理進行了探究，發現生物膜促進微塑料沉降的機理主要表現在4個方面：生物膜中富含的CaCO3等無機和有機物質增大了微塑料密度[47,63]；生物膜表面定殖的硅藻等藻類有助于微塑料形成團聚體，從而促進沉降[99-100]；生物膜的存在能夠降低微塑料表面電荷，從而使得其沉降遷移行為更易發生[101]；微生物分泌的EPS有助于微塑料顆粒的沉降[101]。但目前對于生物因素介導下微塑料在海洋中的遷移行為探究還缺乏一個整體的系統認知，相關模擬計算和理論機制探究還極為缺乏。

2.2 吸附行為

吸附有機、無機營養物質及部分環境污染物后的微塑料能夠快速吸引微生物定殖到其表面，形成生物膜[76]。形成的生物膜又能夠進一步改變微塑料的吸附特性。前人對微塑料吸附行為的研究集中在重金屬和有機污染物2個方面，且研究表明，與吸附有機污染物相比，生物膜的形成對微塑料吸附重金屬的影響更大[102]。表1總結了海洋環境下微塑料的吸附行為及其機理。

表1 海洋環境下微塑料的吸附行為及其機理分析Table 1 Adsorption behavior and mechanism of microplastics in the marine environment

續表1地點Location微塑料Microplastics污染物Pollutant吸附機理Adsorption mechanism參考文獻References印度馬納爾灣珊瑚礁生態系統The coral reef ecosystem in the Gulf of Mannar, India微塑料MicroplasticsZn、Hg、Cd、Pb和Ni等Zn、Hg、Cd、Pb and Ni, et al.靜電吸附、絡合反應Electrostatic adsorption, complexation[64]室內Indoor原始和附膜PEVirgin and biofilm-developed PECu、四環素Cu、tetracycline靜電吸附、絡合反應、表面擴散Electrostatic adsorption, complexation, surface diffusion[21]富營養化湖泊和城市水庫The eutrophic urban lake and the reservoirPSCo、Ni、Cu、Zn、Cd、Ag絡合反應Complexation[48]

2.2.1 生物膜的形成對微塑料吸附重金屬的影響

重金屬陽離子或其絡合物可以通過靜電作用和絡合反應直接吸附到原始微塑料表面的帶電點位或中性區域[21,38,105]，但其吸附效果并不明顯。前人的研究已表明暴露于海洋環境中的微塑料可從海水或沉積物介質中吸附Hg2+、Cd2+等重金屬離子[64,102,112]，且微塑料表面生物膜有助于重金屬在微塑料上的富集[48,113]。例如，Johansen等[49]在南太平洋的一項研究表明未附膜的PP對核素134Cs和85Sr的吸附量僅為附膜PP的1.0%～1.6%。生物膜形成后，重金屬在微塑料上的吸附擴散由顆粒表面擴散機制轉變為膜擴散機制[18,21,48,77]。同時生物膜中含有的可電離基團(氨基、羥基、羰基、羧基、磷酰基、酮基和苯基)增強了微塑料與重金屬離子的親和力，并與重金屬發生強絡合反應，由此增強了微塑料的吸附能力[48,77,105,114]。而研究表明強絡合反應是生物膜提高微塑料對重金屬吸附能力的首要原因[21,38,48,106]。Wang等[21]通過密度泛函理論對生物膜與Cu2+之間的絡合反應進行了深入探究，發現生物膜成分中的1,2-二甲基酯上的第12位O原子和第19位O原子，2,4二甲基-7,8-苯并喹啉中的第21位N原子和1,2-苯二甲酸1-(2-乙基己基)酯中的第41位O原子可能是與Cu2+發生絡合反應的結合位點。此外，生物膜與微塑料的互作能夠影響如菌毛、鞭毛一類的微生物表面結構，從而調節生物膜分泌的具有粘性的EPS，改變微塑料的吸附能力[99,114]。

2.2.2 生物膜的形成對微塑料吸附有機污染物的影響

馬麗娜[100]、張凱娜[110]、宋歡[111]、石雙雙[115]、Guo和Wang[116]、Li等[117]研究了暴露于海水環境中微塑料對有機污染物的吸附機理，發現微塑料在海洋環境中主要通過與疏水性污染物的疏水相互作用、分子間范德華力、微孔填充機制、氫鍵和靜電相互作用等方式吸附污染物。另外，Li等[117]和Xu等[118]發現由于π-π鍵和范德華力相互作用，PS對有機污染物的吸附能力較PE和PP更大。與原始微塑料相比，暴露于海洋環境中的微塑料對污染物具有更高的親和力[9,104]，這主要歸因于微塑料表面生物膜的形成[21,85]。生物膜的形成增大了微塑料的比表面積，提高了污染物的有效擴散面積并提供了更多的吸附位點[21]。另外，由于生物膜內含有大量極性基團，微塑料與污染物之間存在極性相互作用。同時一些極性化學鍵如π-π鍵、氫鍵也可以與污染物相互作用從而增強微塑料對污染物的吸附[111,119-120]。另外，由于生物膜的形成使微塑料帶上電荷，微塑料則可以通過靜電力吸附帶電荷的有機污染物[77,120]。因此生物膜充當了微塑料吸附污染物真正的活性層[85]。

綜上，生物膜的形成能夠改變微塑料的表面電荷、粗糙度、孔隙率、親水性和極性官能團，從而改變微塑料的吸附能力。生物膜形成前后，污染物在微塑料表面主要的擴散機制分別是顆粒表面擴散和膜擴散[21]。附著生物膜的微塑料對重金屬的吸附主要依靠絡合反應，而對有機污染物的吸附主要依靠靜電相互作用和氫鍵、π-π鍵等化學鍵。此外，生物膜分泌的粘性EPS也參與了微塑料對污染物的吸附，其能與重金屬離子發生絡合反應，與有機污染物通過氫鍵和靜電力相互作用[77,121]。但是目前關于生物膜的形成對微塑料吸附行為的影響，特別是微米、納米尺度的微塑料的吸附效應及其與微生物的互作研究、生物膜介導的微塑料解吸行為以及與污染物的共遷移行為相關探究較為缺乏，亟待更加深入系統的研究。

3 結語與展望(Conclusions and perspectives)

鑒于海洋環境中(微)塑料污染問題日益嚴重，開展關于微塑料在該系統中的環境行為和生態風險研究的意義重大。本文主要綜述了海洋環境下微生物群落的定殖對微塑料的理化性質和環境行為的影響。從生物膜角度探討微塑料在海洋環境中的環境效應，可為微塑料的海洋風險評估提供借鑒，具有現實意義。但是目前學界關于微生物與微塑料的互作研究還存在以下問題，尚需深入研究。

(1)當前學界多關注大洋和普通近海環境中微塑料污染問題，但在紅樹林區、海草床和珊瑚礁區等特殊海洋生態系統中微塑料的賦存及生態效應方面的研究還明顯不足，其中的很多科學問題仍不清楚。

(2)由于生物膜的附著增加了微塑料的密度，進入海洋中的微塑料會發生沉降作用，并在沉積物區域積累。因此，明確海洋底層沉積物中微塑料的遷移行為是迫切需要解決的問題。

(3)鑒于生物膜的形成可影響微塑料的表面性質，未來需要加強微塑料與微生物互作關系方面的研究，特別是形成生物膜后微生物和其他因素的共降解作用對微塑料難降解特性的改變和微塑料作為致病菌或抗性基因傳播的工具。

(4)目前的研究多偏重于原始微塑料顆粒對污染物環境行為和生物有效性等的研究，對自然暴露后微塑料與污染物的界面微觀作用機制研究仍處于初始階段，尚未形成較為系統的應用理論基礎。此外，附膜后微塑料與污染物的復合作用對海洋生物的毒性效應也較為匱乏。