磷酸三丁酯的生物毒性效應研究進展

張金鳳，逯南南，侯書國，孫韶華，賈瑞寶,*，武道吉,#

1.山東省城市供排水水質監測中心，濟南 250100

2.山東建筑大學，濟南 250101

有機磷酸酯(organophosphorus esters,OPEs)是一類含有有機基團的磷酸衍生物，分為鹵代磷酸酯、芳基磷酸酯和烷基磷酸酯三大類，因取代基不同而導致物理化學性質差異很大[1]。OPEs生產工藝簡單、價格低廉，在殺蟲劑、除草劑、消泡劑和增塑劑等方面應用廣泛。因其卓越的阻燃性能，OPEs被添加到塑料、家具、包裝、電子設備和建筑材料中，成為一類重要的有機磷阻燃劑(organophosphate flame retardants,OPFRs)[2]。隨著多溴聯苯醚等傳統溴代阻燃劑被限制使用并逐步淘汰，OPFRs成為其替代品，然而OPFRs并非完全安全[3]。OPFRs主要以物理方式進行添加，容易通過產品揮發、磨損或泄露釋放到周圍環境中[4]。OPFRs對生態系統和人類健康具有潛在不利影響，其生態風險已引起世界各國的廣泛關注[5]。已有研究表明，OPFRs對多種生物產生毒性，如神經毒性、生殖發育毒性和致畸致癌毒性等，這些研究主要集中在氯代OPFRs和芳基OPFRs[6-8]。

磷酸三丁酯(tributyl phosphate,TBP)是一種無色、無臭的液體，包括磷酸三正丁酯(TnBP)和磷酸三異丁酯(TiBP)2種異構體，其主要性質如表1所示。TBP脂溶性高，易與有機質結合，熱穩定性高，阻燃效果好，是一種應用比較廣泛的烷基OPFR[2]。在工業上常用作包裝材料增塑劑、水泥砂漿消泡劑及金屬離子萃取劑等[9-11]，也是液壓油、潤滑油、傳動液和機油的重要組成成分[12]。研究發現，TBP廣泛存在于多種環境介質中，并具有長距離傳輸性[13]，在土壤[14-15]、沉積物[16-17]、飲用水[18]、地下水[16,19]、河流湖泊[20]甚至在人跡稀少的高原冰川積雪[21]和北極海水[13]中被檢出。TBP容易揮發進入大氣，許多大氣細顆粒物PM2.5樣本中檢出TnBP和TiBP[22-23]，檢出率甚至在90%以上，2種異構體存在相同的來源、性質和排放途徑[24]。TBP通過吸入、飲食攝入或皮膚接觸等途徑進入生物體，進行遷移和富集，進而危害生態系統[25-26]。

表1 磷酸三丁酯(TBP)的性質Table 1 Properties of tributyl phosphate (TBP)

作為一種烷基OPE，TBP的生物毒性及潛在的生態風險逐漸成為人們關注的焦點。本文總結了TBP的生物富集、毒性效應和作用機制，提出了當前該領域中存在的問題和建議，同時展望了生物毒性評價的發展趨勢，為全面評估其生態風險提供依據。

1 TBP在生物體內的蓄積與代謝(Accumulation and metabolism of TBP in organisms)

TBP可在生物體內發生蓄積和代謝，在生物體內的含量與其物理化學性質、當地污染水平和生物富集能力密切相關[27]。生物富集因子(bioconcentration factor,BCF)和生物-沉積物富集因子(biota-sediment accumulation factor,BSAF)用來表示有機化合物在生物體內富集作用的大小，是評估生物累積性的重要指標。

1.1 TBP在植物體內的蓄積

TBP通過污水、污泥或大氣沉降進入農田，被植物吸收，并在植物體內蓄積[28]。陳陽等[21]對四川省海螺溝景區的9種植物進行了檢測，發現TnBP的檢出率為100%。與其他植物相比，虎耳草、七筋姑和水竹葉中TnBP的含量較高，最高檢出量(162.4 ng·g-1)出現在水竹葉中。重慶地區的蔬菜樣品中同樣檢出了TnBP和TiBP，檢出范圍分別為2.66～39.9 ng·g-1和1.18～9.55 ng·g-1[29]。研究表明，不同植物對TBP的富集能力不同，胡蘿卜根部BCF為0.37～4.6，大麥根部BCF為1.18～1.39，牛尾草葉片和胡蘿卜葉片部位的BCF均<1.2，而3種植物的種子均未檢出TBP，因此TBP易進入植物的可食部位[28,30]。在水稻稻田的環境介質(包括大氣、降塵、雨水、灌溉水、水稻土和林地土)及稻米中均檢出了TnBP和TiBP，檢出率為75%～100%，2種異構體在稻米中的檢出濃度均值分別為0.08 ng·g-1(TnBP)和0.17 ng·g-1(TiBP)。隨著植株的生長，水稻根系不斷從水體中吸收TnBP和TiBP，導致其含量升高，生物積累能力逐漸增強[31]。

1.2 TBP在動物體內的蓄積

TBP可在多種動物體內蓄積，在環境介質中的濃度影響其在生物體內的濃度水平[32]。在重慶地區多種動物的肌肉中檢出TnBP和TiBP，占總OPEs濃度的66.9%，是主要的OPEs污染單體，與室外空氣和水體中兩者的污染水平密切相關[29]。在我國珠江入海口魚體肌肉中測得TnBP的最高含量為2 946 ng·g-1(以脂質量計)[33]，高于菲律賓馬尼拉灣海魚樣品中TnBP的最高檢出量(590 ng·g-1，以脂質量計)[34]，這與當地水域TnBP的污染情況相吻合。

在不同生物體內TBP的含量與分布都具有差異。TnBP通過皮膚接觸進入蚯蚓體內，在腸道和腦神經節中積累，并隨著暴露濃度的升高含量逐漸增多[35]。Liu等[36]研究了TnBP在黑斑蛙和牛蛙體內的分布情況，發現肝臟中TnBP的含量高于腎臟、小腸和心臟，這種差異與性別有關，而牛蛙的肺中未檢出TnBP。He等[29]發現魚體肌肉中TnBP的平均濃度(487 ng·g-1，以脂質量計)高于雞、豬和牛，而TiBP在牛肌肉中的濃度最高(135 ng·g-1，以脂質量計)。TnBP在斑馬魚的卵、腦和肝臟等器官中積累，濃度與組織中的脂肪含量顯著相關(r2=0.94，P<0.01)[37]。日本沼蝦、鯽魚、鯪魚、胡鯰和黑魚體內TnBP的檢出率為100%，在胡鯰、鯪魚和鯽魚中TnBP約占總OPFRs濃度的50%～66%，濃度與魚體肌肉中的脂肪含量也呈明顯的相關性(r2=0.79，P<0.01)，BCF和BSAF分別為20～228和0.066～0.162[27,38]。對稀有鮈鯽來說，卵巢對TnBP的攝取速度比其他器官快，富集程度高，BCF為23.74～27.73[39]。我國北京多條河流中的淡水魚(麥穗魚、鯽魚和泥鰍)體內TnBP的濃度為64.4～449 ng·g-1(以脂質量計)，其中肝臟中的含量最高，其次為肌肉、腸道、腎臟和卵巢，BCF平均為173[38]。鄧旭[32]發現鯰魚肌肉中TnBP的含量(31.9 ng·g-1，以濕質量計)高于草魚(23.1 ng·g-1)和鯽魚(23.9 ng·g-1)，而鯰魚肝臟中TnBP的含量(584.1 ng·g-1)高于腮(329.7 ng·g-1)和腎臟(268.3 ng·g-1)。在我國成都錦江河魚體中TnBP和TiBP主要富集在肌肉、鰓和內臟中，含量依次降低[16]。在韓國洛東江的鯽魚中全部檢出了TnBP，其中肝臟中的含量最高(2.02～3.53 ng·g-1)，在肌肉、肝臟和性腺中BCF介于為5.99×104～1.40×105之間，BSAF介于20.5～48.7之間[40]。而Liu等[27]研究結果與之不同，鯽魚對TBP的BCF和BSAF分別為120和0.151。在鳥類和哺乳動物中也發現類似的分布規律。在我國廣東電子垃圾拆解區雞鴨等家禽的肌肉樣品中檢出了TnBP，含量為11.7～281 ng·g-1(以脂質量計)[33]。Li等[41]對澳大利亞多個地區收集的雞蛋進行了分析，發現在蛋黃和蛋清中TBP的檢出率分別為46%和59%。在北美銀鷗的蛋黃中TnBP的檢出率約為25%，蛋清中則未檢出[42]。陳敏等[43]發現TnBP在小鼠器官中的含量依次為腎臟>脾臟>肺>心臟>肝臟。

動物的發育階段、體型和體質量對TBP蓄積能力的影響不同。Sundkvist等[44]發現大型鱸魚體內TnBP的含量明顯高于小型鱸魚。鯽魚肌肉中TnBP的含量隨著魚體的生長而增加(P<0.05)，當雌魚生長到最大體型后TnBP的濃度反而發生下降，說明隨著雌魚生殖系統的成熟TnBP逐漸從肌肉遷移至性腺[40]。另有研究表明，三峽庫區多種魚類的肌肉中TnBP與TiBP的平均含量分別為(336±227) ng·g-1(以脂質量計)和(81.8±87.8) ng·g-1(以脂質量計)，與魚體大小、體質量和脂肪含量并無顯著相關性(P>0.05)[45]。

TBP的生物富集平衡時間與生物以及組織類型有關。在斑馬魚暴露試驗中，前3 d TnBP在魚體內的濃度快速升高，4～12 d持續增加，第14天左右達到穩定狀態[37]。TnBP在稀有鮈鯽體內的變化規律與之類似，前4 d TnBP的濃度逐漸增高，低濃度組(10 μg·L-1)于第8天濃度達到最高后趨于穩定，高濃度組(100 μg·L-1)于第15天濃度達到平衡狀態[39]。當錦鯉暴露于TnBP(100 μg·L-1和500 μg·L-1)時，肌肉中TnBP的濃度于第3天達到最高，分別為(5.2±0.5) ng·g-1(以濕質量計)和(35.5±1.2) ng·g-1(以濕質量計)，隨后稍有降低，直至第14天趨于穩定，分別為5.4 ng·g-1(以濕質量計)和33.3 ng·g-1(以濕質量計)；而腮和腎臟中TnBP的濃度在第5天達到最大，第14天趨于穩定[32]。陳敏等[43]發現TnBP-d27在小鼠心臟、肝臟與肺的富集濃度最高時間點為12 h，而腎臟與脾臟的富集濃度最高點分別為24 h和36 h。

TBP暴露濃度不同導致生物體內BCF產生差異。蚯蚓暴露于低劑量TBP(10 mg·kg-1)時BCF為0.062～0.204，而在高劑量組(50 mg·kg-1)中BCF為0.018～0.090[46]。在低濃度(35 μg·L-1)和高濃度(191 μg·L-1)TnBP處理條件下，斑馬魚各個組織的BCFlw平均值分別介于305.5～507.5和221.2～395.0之間[37]。錦鯉對不同濃度TnBP的富集能力不同，低濃度(100 μg·L-1)時BCF為31±10，高濃度(500 μg·L-1)時BCF為28±8[32]。

1.3 TBP在人體內的蓄積

血清、尿液、乳汁、羊水或胎盤等樣品可用于檢測TBP及其代謝產物磷酸二丁酯(DBP)，以反映TBP在人體中的蓄積水平[47-50]。我國國內多個地區的人血清樣本中檢出了TnBP，檢出率和濃度存在差異[47,51-52]。渤海灣地區居民的血清中TnBP和TiBP的檢出率分別為11.2%和25.8%，最高值分別為184 ng·g-1和59.4 ng·g-1(以脂質量計)，并且男性血清中TiBP濃度高于女性[53]。多項研究表明，人尿液中檢出DBP的濃度中位數介于0.11～3.5 ng·mL-1之間[54-56]。張曉華等[48]發現我國多地人群尿液中DnBP的檢出率為66%，中位數為0.84 ng·mL-1，其中深圳人群尿液中DnBP約占總OPFRs濃度的42%。青少年人群(12～15歲)尿液中DBP的檢出率超過99%，中位數為1.49 ng·mg-1[26]。挪威兒童尿液中DnBP檢出率約為15%[57]，低于德國兒童尿液中DBP的檢出率(71%)[58]。生活在電子垃圾拆解地區的孕婦尿液和羊水樣本中TnBP檢出率為93%，DBP的濃度比本地區普通成年人高3倍～5倍[59]，約13%孕婦每日攝入量超過了TnBP參考劑量(2 400 ng·kg-1·d-1)[49]。在人體胎盤中TnBP的檢出率為46%，濃度為ND～100 ng·g-1(以脂質量計)，其中在電子垃圾拆解區母親胎盤中TnBP濃度偏高[26,50]。在胚胎絨毛膜絨毛樣品中TBP的含量(18.8 ng·g-1) (以干質量計)高于孕婦蛻膜樣本(10.8 ng·g-1) (以干質量計)[60]。在瑞典多個地區的母乳樣品中TnBP的平均含量為12 ng·g-1(以脂質量計)[44]，高于來自日本、菲律賓和越南的母乳樣品(分別為0.39、1.5和2.0 ng·g-1)[61]。澳大利亞0～5歲兒童的尿液中全部檢出了DBP，其濃度隨年齡增長而下降，但未檢出TBP，兒童對應的母乳中TBP含量為0.26～2.1 ng·mL-1，表明嬰幼兒體內高濃度的DBP主要來源于母乳喂養[62]。

1.4 TBP在生物體內的代謝轉化

污染物進入生物體后發生代謝或降解，生成相應的代謝產物[63]。研究發現，無光照條件下TBP在pH 7～11的水溶液中持續35 d不會發生降解[64]。在蚯蚓-土壤生態系統中，蚯蚓能夠顯著加快TBP的降解，主要由蚯蚓的腸道微生物和土壤中的微生物來完成[65]。肝臟是TnBP發生代謝的主要部位，發生氧化(羥基化)、脫烷基、磷酸化、羧酸化以及與硫酸酯結合等反應，生成極性、親水的代謝物，Ⅰ相代謝產物主要有羥基化TBP(TBP-OH，有2種異構體)、脫烷基的二酯產物DBP和羧酸化TBP，Ⅱ相代謝產物主要有乙醇-DBP、硫酸化的乙醇-DBP、磷酸化的TBP-OH(有2種異構體)[46]。另外DBP繼續脫烷基形成磷酸單丁酯(MBP)[66]，葡萄糖醛酸轉移酶可催化TBP-OH與葡萄糖醛酸結合[37]。研究發現，在長時間暴露情況下TBP更易發生羥基化和磷酸化，而不是發生水解和羧酸化[46]。這些代謝物通過肝膽系統釋放到腸道，導致腸道中代謝物的濃度高于肝臟，最終經泌尿系統排出體外[67]。在鯽魚[68]、銀鷗[69]和大鼠[66]等肝臟微粒體以及大鼠肝癌細胞H4ⅡE[70]中TBP被迅速代謝。TBP的代謝速度與物種有關，在人體、魚類和鳥類中代謝速度呈遞減趨勢[42,68-69]。在不同生物中TBP向代謝產物的轉化率不同。在斑馬魚體內TnBP向DnBP的代謝轉化率為3.4%[67]，在麥穗魚、鯽魚和泥鰍等魚體內TnBP向DnBP的轉化率約為30%[38]。鯽魚肝臟微粒體中TBP-OH比DBP產生速度更快，TBP向兩者的轉化率分別為43.1%和12.9%[68]。在銀鷗肝臟微粒體中約14%的TBP轉化為DBP[69]。Sasaki等[71]發現大鼠肝臟微粒體中的雙功能氧化酶(MFO)將TBP氧化為TBP-OH，進而生成TBP-(OH)2和DBP。細胞色素P450同工酶CYP3A4和CYP1A1也參與TBP的氧化過程[68,70]。此外，一種沼澤紅假單胞菌的重組膜結合蛋白CYP201A2能夠催化TBP降解過程的初始步驟[72]。

基于1H-NMR的代謝組學分析，DBP和N-乙酰-(S-3-羥丁基)-L-半胱氨酸是區分TBP是否染毒的重要生物標志物，TBP-OH、內源性2-酮戊二酸、苯甲酸鹽、延胡索酸、葫蘆巴堿和順式烏頭酸也可作為生物標志物進行檢測，以反映生物體的負荷及主要暴露途徑[73-75]。

由此可見，TBP可在多種生物體內蓄積，其組織分布、含量和富集規律不盡相同[32]。通過對不同生物的研究發現，BCF介于0.018～1.40×105之間，說明生物種類對TBP的富集程度不同(表2)。這種差異主要與以下因素有關。(1)TBP較高的親脂性使其在血液與組織中進行分配，進而影響生物富集能力[37]。有學者認為TBP通過被動運輸和主動累積進行富集，其中主動累積是決定TBP分布的主要方式[39,42]。(2)不同器官的脂肪與蛋白質含量不同，TBP趨向富集于脂肪含量高的組織如肝臟、腦和卵[27,32]。(3)生物發育階段、體質量和體型對TBP生物富集與放大效應的影響并不一致[40,44-45]，可能的原因是動物體內存在代謝途徑，改變了隨動物生長而產生的富集與放大效應[45]。(4)攝食習性會影響生物富集能力。食肉性為主的魚類(如鯰魚)比以植物為主的雜食性魚類(如草魚)攝取更多TnBP，表現為隨營養級升高而增高的趨勢[27,45]，TiBP則表現出相反的趨勢[45]。Liu等[27]發現淡水食物網中TnBP的營養放大因子(TMF)僅為0.57，表明發生了營養稀釋。在荷蘭西斯凱爾特河口的水層食物網和總食物網(底棲和水層)中同樣發現TBP的營養稀釋效應[76]。TBP在不同食物鏈(網)的生物放大效應需要進一步探討。(5)代謝和排泄能夠影響TBP的富集程度。在稀有鮈鯽[39]、錦鯉[32]、斑馬魚[37]、虹鱒魚[77]和金魚[77]等魚體內TnBP的代謝半衰期分別為0.6～2.0 d、1.4 h、4.8～6.2 h、58 h和100 h，說明在體內停留時間較短，有利于排出。當代謝速度大于富集速度時，TBP濃度降低，富集能力逐漸減弱，這也是導致TBP在水生食物鏈(網)中沒有出現明顯生物放大效應的原因之一[27,44]。(6)環境介質中污染物的濃度和暴露途徑對生物富集效果也有一定的影響[78]。

表2 不同生物對磷酸三丁酯的生物富集效應Table 2 Bioaccumulation effect of various organisms for tributyl phosphate

2 TBP的生物毒性(Biological toxicity of TBP)

OPFRs對生物體具有毒性效應，主要表現為急性毒性、生殖與發育毒性、器官毒性、神經毒性以及致畸致癌致突變等方面[79]。在毒性研究中，通常用半數致死濃度或劑量(LC50/LD50)、半數抑制濃度(IC50)、半數效應濃度或劑量(EC50/ED50)和未觀察到損傷的作用濃度或劑量(NOEC/NOEL)等指標來表征污染物毒性作用的強弱。

2.1 急性毒性

許多研究利用不同的受試對象來檢測TBP的急性毒性效應。姜丹等[80]以青海弧菌Q67發光菌為受試生物，結合微孔板高通量檢測技術，得到TBP的EC50為109 μmol·L-1。大腸桿菌暴露于TBP 90 min后菌體數量下降明顯，經計算IC20為205.6 μmol·L-1[81]。TBP(50 μg·L-1)染毒48 h導致蛋白核小球藻細胞壁嚴重變形，群體數量明顯減少，抑制率約17.9%[82]。TBP(≥0.2 mg·L-1)顯著抑制三角褐指藻生長，TBP濃度越高其抑制作用越強[83]，所得EC50值與Song等[84]的結果不同，可能是三角褐指藻的接種密度和培養條件不同所致。TnBP(1 mg·L-1和6 mg·L-1)能夠干擾褶皺臂尾輪蟲群體的生長，24 h急性毒性的LC50為12.45 mg·L-1[85]。大型溞暴露于TBP 48 h死亡率隨濃度升高而增大，EC50為12 mg·L-1(或45 μmol·L-1)[86]。利用濾紙片接觸法進行蚯蚓的急性暴露試驗，測得TBP對掘穴環爪蚓和赤子愛勝蚓的LD50(48 h)分別為3.3 μg·cm-2和20.232 μg·cm-2[46,87]。杜仲坤[8]以斑馬魚胚胎和成體為受試動物研究TBP的急性毒性作用，以卵凝結和心跳作為致死性指標，得到胚胎和成體的LC50分別為7.815 mg·L-1和7.152 mg·L-1(96 h)。SD大鼠通過灌胃方式進行急性暴露試驗，在高劑量組(1 000 mg·kg-1TBP)中雄性大鼠的平均體質量較對照組出現明顯下降[88]。體外實驗結果表明，TBP能夠抑制大鼠肝癌細胞株H4ⅡE和大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞的生長，細胞存活率下降，IC50分別為177.6 μmol·L-1(48 h)[70]和338.09 μmol·L-1(24 h)[89]。TBP(200 μmol·L-1)染毒24 h人肺癌細胞A549和結腸腺癌細胞Caco-2的存活率分別下降14.2%和21.1%[90]。此外TBP還能抑制人肝癌細胞HepG2的增殖，IC50為299 μmol·L-1(48 h)[91]。美國政府工業衛生專家協會(ACGIH)將TBP列為中度毒性物質，對人體的致死量為0.5～5 g·kg-1(以體質量計)[92]。

2.2 生殖與發育毒性

污染物發揮生殖與發育的毒性作用主要表現為個體發育遲緩或發育不足，生殖器官或細胞的形態和功能異常[63]。研究發現，TnBP(6 mg·L-1)對褶皺臂尾輪蟲的生殖系統表現出一定的毒性[85]。斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的TBP(25、125、625和3 125 μg·L-1)5 d，胚胎發育基本不受影響，胚胎孵化率、孵化時間、畸形率、體長和心率等沒有發生明顯變化[93]。TBP(3 125 μg·L-1，14 d)可導致青鳉魚胚胎孵化率顯著降低，孵化時間延長，畸形率升高，心率下降[93]。Müller等[94]對小鼠2-細胞期胚胎的發育情況進行了研究，發現5 μmol·L-1TBP染毒18 h對胚胎無明顯毒性，細胞增殖也未受到影響。當濃度增大到15～40 μmol·L-1時，約50%～90%植入胚胎的發育和細胞增殖受到不同程度的影響，但TBP并未誘導胚胎細胞出現微核。2代CD大鼠通過自由飲食方式染毒TBP(200、700和3 000 mg·kg-1)，生殖器官、懷孕和泌乳均未受到明顯影響[95]。Wistar大鼠在妊娠7～17 d后進行TBP(800 mg·kg-1·d-1)染毒，所有懷孕大鼠死亡[96]。TBP(0.14 mL·kg-1·d-1和0.42 mL·kg-1·d-1)連續灌胃14 d導致SD大鼠的曲細精管出現退行性病變，出現不同程度的精子生成缺乏癥狀，少數精管內可見巨細胞及核固縮的細胞[97]。由此可見，TBP對多種動物的生殖系統與胚胎發育具有潛在的危害。

2.3 器官毒性

TBP通過不同途徑進入生物體后，經過血液運輸進入組織器官，產生一定的器官毒性，如肝臟毒性、腎臟毒性和腸毒性等[87,98-99]。在人工土壤中蚯蚓暴露于環境相關或更高濃度的TnBP(0.1、1和10 mg·kg-1)14 d后，體質量增加，致死率<5%[35]。TnBP進入蚯蚓的消化道，嚴重影響腸道的結構和功能，破壞小腸上皮細胞的緊密連接和滲透平衡，抑制蛋白酶體的活性，纖維素酶活性明顯升高，精氨酸含量下降，干擾腸道對營養的吸收[35]，消化道出現明顯的劑量反應性降解，腸壁變細，腸腔擴張，腸道微生物菌群發生改變，易發生炎癥[87]。在亞慢性毒性(325 mg·kg-1·d-1灌胃3個月)暴露試驗中，SD大鼠的體質量增長率明顯下降，并出現個體死亡[88]。TBP(0.42 mL·kg-1·d-1)導致SD大鼠肝臟系數變大，其他器官如腦、心臟、腎臟和肺等臟器系數無明顯變化，血液指標和生化指標的變化與性別有關，雌性大鼠中平均紅細胞血紅蛋白量與濃度均下降，甘油三酯和淀粉酶升高，而雄性大鼠中血液指標未發生明顯變化，膽固醇、淀粉酶、膽紅素、血尿素氮和尿素含量升高[97]。Wistar雄性大鼠飲食攝入TBP 9～10周，腦、肝臟和腎臟等臟器系數變大，肝臟出現損傷，低劑量組(質量分數為0.5%的TBP)大鼠血液指標未發生變化，高劑量組(質量分數為1%的TBP)大鼠血液中總蛋白、膽固醇和尿素氮含量升高，凝血時間延長，谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和堿性磷酸酶含量下降，血清和肝臟中的膽堿酯酶活性無明顯變化，而大腦中膽堿酯酶活性升高[98,100]。采用氣管滴注方式進行TBP染毒28 d，Wistar大鼠支氣管肺泡灌洗液中總蛋白量和總細胞數明顯增高，引起肺部損傷[101]。經長時間(24個月)喂養，SD大鼠的尿路和膀胱上皮組織出現明顯的再生性增生，局部組織出現炎癥、潰瘍和壞死[99,102]，膀胱增生的發生率和嚴重程度與TBP劑量密切相關[95]。另有研究表明，CD-1小鼠長期攝入TBP(18個月)，生存率、血液和尿液等參數均未發生顯著變化，體質量增長率下降，肝臟腫大[103]。因此對于嚙齒類動物而言，TBP對肝臟、肺和腎臟等器官造成明顯的損傷。

2.4 神經毒性

由于TBP與有機磷農藥的結構類似，其神經毒性效應受到許多研究者的關注。膽堿酯酶和神經病靶酯酶(NTE)的變化以及神經功能的改變用來表征污染物的神經毒性效應[104]。乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性與基因表達變化趨勢之間的差異與AChE的補償機制有關[105]。研究發現，TBP抑制AChE和丁酰膽堿酯酶(BuChE)的活性，從而表現出一定的神經毒性[106]。TnBP導致蚯蚓腦神經節中Ca2+-ATPase和Na+/K+-ATPase活性下降，Ca2+和Na+濃度升高，干擾滲透壓平衡，加快興奮性神經遞質谷氨酸的傳遞，對神經造成損傷[65,87]。斑馬魚幼魚和青鳉魚幼魚暴露于TBP(3 125 μg·L-1)時，自由游泳速度明顯變慢，在光周期刺激實驗中移動速度降低，說明TBP能夠影響運動神經功能[93]。斑馬魚中與神經發育相關的多個基因表達下降，AChE活性未發生顯著變化[107]，而青鳉魚中AChE活性明顯升高[93]。亞致死劑量的TBP(1 500 mg·kg-1)導致母雞血漿中BuChE活性升高2倍～3倍，而NTE和AChE的活性沒有發生變化，TBP未損傷神經功能[108]。采用一次性肌肉注射法染毒TBP(1 000 mg·kg-1)后6 d左右母雞腰髓前角神經元數量減少，出現肌無力和共濟失調等進行性神經疾病的典型癥狀[109]。體外細胞實驗結果顯示，TnBP通過抑制大鼠PC12細胞中AChE的活性來影響神經元的分化[89]。SD大鼠暴露于TBP后唾液分泌增加，刺激反應時間延長，活動能力和前肢握力均下降[88]。Laham等[110]發現TBP(0.42 mL·kg-1·d-1，14 d)影響SD雄性大鼠的外周神經系統，尾神經傳導速度降低，并伴有坐骨神經形態學改變，無髓纖維中的施萬細胞突起收縮，但未發現神經細胞軸突變性。

2.5 致畸、致癌及致突變性

在已有的研究中，TBP對不同生物表現的致畸、致癌和致突變效應不同。TnBP對非洲爪蟾胚胎具有潛在的致畸作用[111]。蚯蚓在慢性暴露(TnBP 10 mg·kg-1和50 mg·kg-1，28 d)試驗中沒有出現任何身體變形或畸形[46]。孕期Wistar大鼠通過口服進行TBP染毒，與對照組相比死胎數量和仔鼠體質量均無顯著差異，畸形發生率沒有明顯升高，因此Noda等[96]認為TBP對大鼠未表現出明顯的致畸作用。

SD大鼠飲食攝入TBP(700 mg·kg-1和3 000 mg·kg-1)，膀胱出現乳頭狀或結節狀腫瘤，具有明顯的劑量依賴性，在遺傳基因毒性試驗中結果為陰性，表明腫瘤由非遺傳毒性機制誘發[75]。Arnold等[102]發現SD大鼠尿路上皮組織出現腫瘤，并且雄性比雌性更易發生。CD-1小鼠體內出現了肝臟腫瘤[103]。因此，1998年ACGIH將TBP列為動物致癌物[112]。

2.6 其他毒性

除上述毒性效應外，TBP對特定環境中的高暴露人群具有一定的健康風險。在生產或使用TBP的環境中工人出現惡心、頭痛及呼吸道刺激等癥狀[92]，約5.56%的工人出現煩躁、精神不振和嗜睡等不適癥，而常規體檢結果如內科、皮膚、五官、血常規、尿常規、肺通氣和胸部透視等與對照組相比沒有顯著差異[113]。另有研究發現，TBP與過敏性鼻炎和哮喘等疾病的流行呈顯著相關性[114]。

3 TBP的毒性作用機制(Toxic mechanisms of TBP)

體內外實驗結果已證實，TBP通過誘導氧化應激、干擾細胞代謝、干擾內分泌以及誘導細胞死亡等機制發揮其毒性作用[84,115-116]。

3.1 誘導氧化應激

污染物進入生物體后，細胞激活應激反應，抗氧化酶和熱休克蛋白(Hsp)可作為環境污染與生物預防的早期預警信號[117-118]。TBP導致多種生物(如藻類[82-83]、輪蟲[85]、河蜆[115]、蚯蚓[87]、斑馬魚[119]和大鼠[101]等)體內產生活性氧(ROS)，誘導氧化應激，抗氧化酶和應激蛋白出現不同程度的變化。Krivoshiev等[81]對大腸桿菌(E.coliSF1和GC4436菌株)的應激基因譜進行分析，發現TBP(300 μmol·L-1)誘導多種應激蛋白如過氧化氫酶(CAT)-過氧化物酶Ⅰ(由KatG基因編碼)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH，由zwf基因編碼)和分子伴侶ClpB等基因表達上調，這種變化與TnBP的濃度呈正比。在蛋白核小球藻和三角褐指藻中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平升高[82-83]。褶皺臂尾輪蟲細胞中MDA和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性升高，線粒體的形態與功能出現異常[85]。河蜆暴露于TBP(20 μg·L-1和200 μg·L-1)28 d，消化腺中CAT、SOD和MDA水平下降，Hsp40、Hsp60和Hsp70的mRNA水平降低，同時多異源抗性系統abcc1和abcb1基因表達發生改變來阻止異源物質進入體內[115]。Wistar大鼠肺組織勻漿中SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和GR的活性明顯降低，而MDA水平升高[101]。體外細胞的實驗結果表明，在大鼠肝癌細胞株H4ⅡE中參與氧化還原反應和生物代謝的酶如gpx1、gr、cat、谷胱甘肽-S-轉移酶A2(gsta2)和細胞色素cyp1a1的基因表達上調，GPx、谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)、乙氧基-異吩唑酮脫乙基酶(EROD)和甲氧基-異吩唑酮脫甲基酶(MROD)的活性顯著增強[70]。TBP還會導致HepG2和A549細胞產生過量ROS，氧化還原平衡發生紊亂[90-91]。

3.2 干擾細胞代謝

細胞內產生的氧化應激導致物質代謝和能量代謝受到干擾，影響脂質、核苷酸以及RNA的代謝過程[85]。TBP導致蛋白核小球藻細胞壁嚴重變形，抑制葉綠素合成和光合作用效率，類囊體片層結構松散甚至消失。分子對接(molecular docking)技術表明TBP能夠與脂質運載蛋白相結合，因此Chu等[82]認為TBP對微藻的毒性與脂質運載蛋白有關。三角褐指藻光合效率下降，與糖酵解、脂肪酸的生物合成及β氧化相關的基因表達發生變化[84]。Zhang等[85]通過代謝組學分析，發現褶皺臂尾輪蟲暴露于TnBP(6 mg·L-1)時有583個代謝物出現差異，其中398個代謝物升高，主要涉及氨基酸生物合成、核苷酸降解、氨酰-tRNA生物合成和脂質代謝等過程。TBP干擾斑馬魚肝臟細胞的正常代謝，使能量代謝受阻，乙酸、膽堿、谷氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸以及乙酰肉堿含量顯著降低[8]。錦鯉肝臟中乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)活性升高，羧酸酯酶(CESE)活性降低，而AChE、GST和磷酸三酯酶(PTE)沒有發生明顯的變化[37]。TBP改變小鼠血漿和肝臟中的內源性代謝產物，影響不飽和脂肪酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸的代謝以及腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白(ABC轉運蛋白)等代謝通路，短時間暴露還能破壞小鼠肝臟細胞的尿素循環，抑制細胞色素CYP3A11和CYP2B10的活性[120]。大鼠尿液中的代謝物(包括苯甲酸鹽、尿素和葫蘆巴堿等)以及三羧酸循環的代謝物(包括檸檬酸、順式烏頭酸、反式烏頭酸、2-酮戊二酸、琥珀酸和延胡索酸等)同樣受到TBP的影響[73]。此外TnBP還能破壞人體血液中鞘脂的穩態[51]。

3.3 干擾內分泌

作為內分泌干擾物，TBP具有多種核受體的活性，影響內分泌激素的平衡，在多個研究報道中得到了證實[111,116]。TBP具有明顯的雌激素活性，與17-β雌二醇共同存在時表現出雌激素拮抗活性[121]。熒光素酶報告基因實驗表明，TBP對孕烷X受體(PXR)具有激動活性，而對雄激素受體(AR)、糖皮質激素受體(GR)以及甲狀腺受體β(TRβ)具有拮抗活性。在甲狀腺激素T3存在時TBP顯著降低大鼠垂體瘤GH3細胞的存活率，說明TBP具有T3拮抗作用[111,116]。TBP短期暴露能夠激活組成型雄甾烷受體(CAR)[111]。然而，DBP對AR、ER、GR或PXR等核受體沒有表現出激動或拮抗活性，可能是DBP的疏水性比TBP低所致[111,122]。目前TBP作為內分泌干擾物的研究主要采用體外細胞實驗方法，為了系統全面地研究TBP對內分泌系統的影響，還需要開展體內實驗進行驗證。

3.4 誘導細胞死亡

機體內的氧化應激會導致DNA損傷，細胞周期發生停滯，促進凋亡因子的釋放，最終造成機體死亡[123]。TBP染毒誘導三角褐指藻細胞變形，線粒體膜電位發生變化，最終導致細胞凋亡，1.2 mg·L-1TBP誘導的凋亡率約為(56.48±1.3)%[83]。隨著TBP濃度的升高，河蜆消化腺細胞中DNA發生損傷，caspase-3/8/9的活性和細胞色素c水平隨之升高，TBP通過線粒體和非線粒體途徑誘導細胞凋亡[123]。在斑馬魚肝臟細胞中，與細胞周期、DNA修復及細胞凋亡相關的多個基因表達發生變化，DNA斷裂，但是雌雄魚體對TBP毒性響應的趨勢有所不同，具有性別差異[119]。TBP染毒21 d后，雞的脊髓前角神經元細胞發生凋亡，神經元數量下降[109]。TBP導致大鼠PC12細胞形態改變，細胞核凝集，乳酸脫氫酶(LDH)和caspase-3活性升高，細胞發生壞死性死亡[89]。TBP(50、100和200 μmol·L-1)抑制HepG2細胞增殖，改變線粒體膜的通透性，DNA斷裂，細胞周期停滯在G0/G1期，通過c-Jun N末端激酶(JNK)和胞外調節蛋白激酶(ERK1/2)信號激活線粒體和p53介導的細胞凋亡通路[91]。在A549細胞和Caco-2細胞中也得到類似的結果，DNA損傷，LDH活性升高，最終導致細胞死亡[90]。

總之，TBP主要通過以上4種作用機制來發揮其毒性作用。當暴露于污染物時，細胞會發生氧化應激來適應環境的變化。適度的ROS可以作為信號分子來調節各種信號通路，而過量的ROS會造成氧化損傷，改變細胞代謝進而誘導細胞死亡。細胞針對氧化應激發生的反應和后果取決于污染物暴露的條件以及細胞類型[124]。

Verbruggen等[125]對1975—1999年期間發表的有關TBP急性或慢性暴露的研究成果進行了總結，涉及細菌、藻類、原蟲、扁形蟲、甲殼類和魚類等多種生物，并根據已有數據推算了TBP的效應濃度(包括NOEC、EC10、EC50和EC100等)以及在淡水和海水環境中TBP的最大允許濃度(MPC)和嚴重生態風險濃度(SRCeco)。我們著重對2000年以來有關TBP的生物毒性及作用機制的研究成果進行了匯總(表3)。

表3 磷酸三丁酯對不同生物的毒性效應指標及作用機制(2000年以來)Table 3 Toxic effect index and mechanisms of tributyl phosphate on organisms (since 2000)

續表3生物/細胞種類Organisms/Cell types毒理效應指標Toxic effect index毒性作用機制Toxic mechanisms參考文獻References河蜆C. fluminea-消化腺細胞中SOD和GR活性以及MDA含量下降,產生氧化應激,細胞色素cyp4基因表達升高,谷胱甘肽-S-轉移酶gsts1和gstm1基因表達下降,多個熱休克蛋白(Hsp)和多異源抗性系統的基因表達發生變化,DNA斷裂,caspase-3/8/9活性和細胞色素c水平升高,誘導凋亡Decreases of SOD, GR activities and MDA content in the digestive gland cells, oxidative stress, upregulation of cytochrome cyp4 expression, down-regulation of glutathione-S-transferase gsts1 and gstm1, mRNAs of several heat shock proteins (Hsp) and multixenobiotic resistance system change, DNA breakage, caspase-3/8/9 activity and cytochrome c increase, and cell apoptosis[115,123]斑馬魚D. rerioLC50: 7.815 mg·L-1 (96 h) (胚胎embryo), 7.152 mg·L-1(96 h) (成體adult) ED50: 17.7 mg·L-1(96 h) (胚胎embryo)幼魚的自由游泳和移動速度變慢,乙酰膽堿酯酶(ache)基因表達下降但其活性未改變,神經發育相關的基因如神經生長相關蛋白43(gap43)、微管蛋白α1(α1-tubulin)、音猬因子(shha)、突觸核蛋白(syn2a)和膠質纖維酸性蛋白(gfap)基因表達下降,神經元表達RNA結合蛋白elavl3基因表達升高,肝臟細胞能量代謝下降,sod和cat的mRNA水平下降,細胞周期檢查點激酶(chk2)表達升高,起始識別復合物亞基1(orc1)、周期蛋白A1(ccna1)和周期蛋白B(ccnb)表達下降,caspase-3/9表達下降,DNA修復相關基因表達也發生變化,造成DNA損傷The free-swimming speed and locomotor behavior of larval zebrafish de-crease, acetylcholinesterase (ache) expression decrease but its activity not change, downregulation of genes involved in neural development, such as growth associated protein-43 (gap43), α1-tubulin, sonic hedgehog (shha), synuclein2a (syn2a) and glial fibrillary acidic protein (gfap), upregulation of neuron-enriched RNA-binding protein elavl3 expression, lower hepatic en-ergy metabolism, upregulation of cell cycle checkpoint kinase (chk2) ex-pression, downregulation of sod, cat, origin recognition complex subunit 1 (orc1), cyclin A1 (ccna1), cyclin B (ccnb) and caspase-3/9 expression, the genes related to DNA repair change, and DNA damage[8,93,107,119]青鳉魚O. latipesLC50: 14.2～18 mg·L-1(48 h), 9.6～17 mg·L-1(96 h)胚胎孵化率降低,孵化時間延長,畸形率升高,影響幼魚自由游泳的行為,AChE活性升高Embryo hatching rate decrease, hatching time delay, gross abnormalities in-crease, the free-swimming behavior disruption, and AChE activity increase[93,125]錦鯉C. carpio-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)活性升高,羧酸酯酶(CESE)活性降低Ethoxycoumarin-O-deethylase (ECOD) activity increase and carboxylester-ase (CESE) activity decrease[37]雞G. gallusLD50: 1 500 mg·kg-1丁酰膽堿酯酶(BuChE)活性升高,腰髓前角神經元發生凋亡,數量下降,出現肌無力和共濟失調等癥狀Butyryl cholinesterase (BuChE) activity increase, apoptosis of neurons in the anterior horn of spinal cord, cell viability reduction, and neurological symptoms such as myasthenia and ataxia[108-109]

續表3生物/細胞種類Organisms/Cell types毒理效應指標Toxic effect index毒性作用機制Toxic mechanisms參考文獻References小鼠M. musculusNOEL: 28.9 mg·kg-1·d-1(雌性female), 24.1 mg·kg-1·d-1 (雄性male)(18個月 18 months)ED50: 15～34 μmol·L-1 (胚胎embryo);ED90: 41～107 μmol·L-1(胚胎embryo)影響小鼠胚胎的增殖和形態發育,慢性染毒導致小鼠肝臟腫大,出現肝臟腫瘤,改變血漿和肝臟中內源性代謝產物,抑制尿素合成,影響不飽和脂肪酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸的代謝以及腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白(ABC轉運蛋白)等代謝通路,激活組成型雄甾烷受體(CAR),細胞色素cyp2b10的基因表達上調,CYP2B10和CYP3A11的活性被抑制Cell proliferation and morphological development of embryos disruption, hepatomegaly and hepatocellular adenomas after chronic exposure, endoge-nous metabolites in plasma and liver change, urea synthesis inhibition, sev-eral metabolic pathways disruption such as unsaturated fatty acids biosyn-thesis, arginine and proline metabolism and adenosine triphosphate binding cassette transporters (ABC transporters), activation of constructive andro-stane receptor (CAR), upregulation of cytochrome cyp2b10 expression, and inhibition of CYP2B10 and CYP3A11 enzymatic activity[94,103,120]大鼠R. norvegicusNOEL: 12 mg·kg-1·d-1 (雌性female), 9 mg·kg-1·d-1(雄性male) (24個月 24 months)干擾三羧酸循環,肺組織中SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和GR活性下降,MDA水平升高,誘發氧化應激,大腦中膽堿酯酶(ChE)活性升高,尾神經傳導速度下降,肝小葉肥大,肺部和肝臟受損,膀胱上皮和腎盂上皮出現增生、壞死和潰瘍,出現膀胱乳頭狀或結節狀瘤,曲細精管出現退行性病變,影響精子形成 Disruption of tricarboxylic acid cycle, decreases of SOD, CAT, glutathione peroxidase (GPx) and GR activities, MDA content increase, oxidative stress, cholinesterase (ChE) activity in the brain increase, the conduction velocity of caudal nerve reduction, hepatic centrilobular hypertrophy, lung and liver injury, hyperplasia, necrosis and ulceration in urinary bladder epithelial and renal pelvic epithelial cells, papillary or nodular tumor of bladder, degenera-tive lesions of seminiferous tubules, and spermatogenesis disruption[73,75,88,95,97-102,110]大鼠肝癌細胞株H4ⅡERat hepatoma cell line H4ⅡEIC50: 177.6 μmol·L-1(48 h)細胞存活率下降,誘導氧化應激,gpx1、gr、谷胱甘肽-S-轉移酶α2 (gstα2)、細胞色素cyp1a1和cat等基因表達上調,GPx、GST、乙氧基-異吩唑酮脫乙基酶(EROD)和甲氧基-異吩唑酮脫甲基酶(MROD)等活性增強Cell viability reduction, oxidative stress, upregulation of gpx1, gr, glutathi-one-S-transferase alpha 2 (gstα2), cytochrome cyp1a1 and cat expression, and increases of GPx, GST, ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) and methoxyresorufin-O-demethylase (MROD)[70]大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12Rat adrenal pheochromocytoma cell line PC12IC50: 338.09 μmol·L-1(24 h)細胞存活率下降,細胞嚴重變形,細胞核凝集,AChE活性下降,乳酸脫氫酶(LDH)和caspase-3活性升高,細胞發生壞死性死亡Cell viability reduction, cell malformation, nuclear shrinkage, AChE activity decrease, lactate dehydrogenase (LDH) and caspase-3 activity increase, and necrotic death[89]

續表3生物/細胞種類Organisms/Cell types毒理效應指標Toxic effect index毒性作用機制Toxic mechanisms參考文獻References人肝癌細胞系HepG2Human hepatoma cell line HepG2IC50: 299 μmol·L-1 (48 h)細胞存活率下降,抑制細胞增殖,細胞周期停滯在G0/G1期,ROS過量產生,誘導氧化應激,DNA損傷,線粒體膜電位降低,通過c-Jun N末端激酶(JNK)和細胞外信號調節蛋白激酶(ERK1/2)信號通路誘導凋亡Cell viability reduction, cell proliferation inhibition, cell cycle arrest in G0/G1 phase, ROS overproduction, oxidative stress, DNA damage, MMP de-crease, and cell apoptosis through c-Jun N-terminal kinase (JNK) and ex-tracellular signal-regulated kinases (ERK1/2) signaling pathways[90-91]人肺癌細胞系A549Human lung carcinoma cell line A549-細胞存活率下降,ROS水平和LDH活性均升高Cell viability reduction, ROS and LDH activity increase[90]人結腸腺癌細胞系Caco-2Human colorectal adenocarcinoma cell line Caco-2-細胞存活率下降,LDH活性升高,DNA損傷Cell viability reduction, LDH activity increase, and DNA damage[90]

4 結論與展望(Summary and prospect)

TBP的大量生產和使用導致其在環境介質中分布廣泛，其潛在的負面生態效應與健康風險備受人們關注[25]。目前，關于TBP在生物體內的富集、生物毒性效應和分子機制的研究已有許多報道，本文對此進行了總結。

在國內外許多地區的植物、動物和人體中TBP檢出的濃度具有很大差異，一方面反映了TBP污染具有廣泛性和地域差異性的特點，另一方面反映出TBP對整個生態系統具有潛在的危害性。不同食物鏈(網)中TBP的生物富集和放大效應不同，這與生物種類、生理指標和環境條件密切相關。此方面的研究尚不完善，應加強對典型污染區域和各種類型食物鏈(網)中TBP的生物富集效應及其影響因素的研究，對于準確評價TBP的生態環境風險、TBP的環境容量及制定環境標志提供科學依據。TBP在生物體中能夠進行代謝，DBP和TBP-OH被認為是用于TBP監測的重要生物標志物。對各類組織樣本特別是人體樣本檢測時不能僅僅測定DBP，應將TBP-OH或其他典型代謝物共同納入監測，同時不應忽視這些代謝物的生物活性及潛在的毒性效應。

植物作為生物圈的生產者，對維系生物圈的穩定起著極其重要的作用。目前，TBP的毒性研究主要集中在動物和人體，而對植物的毒性及對食物鏈影響的研究十分缺乏。大多數研究使用的TBP劑量遠遠高于實際環境暴露量，這樣獲得的毒性數據用來進行風險評價存在一定的局限性，亟需開展環境濃度的暴露以及長期低劑量暴露的相關研究，使實驗數據更加符合實際情況。此外，自然界中各種污染物非單獨存在，TBP與其他共存污染物可能產生的聯合毒性需要多加關注。

在生物毒性實驗中，抗氧化酶體系和Hsp等應激蛋白是反映TBP生物毒性的早期預警指標，這些指標易受個體差異的影響，應挖掘更多靈敏、準確、易監測的預警參數。已有學者利用轉錄組學[8]和代謝組學[85]技術進行聚類分析和顯著性富集分析，對生物體中差異表達的信息進行預測與驗證。目前互作網絡分析的關注點主要集中在蛋白質-蛋白質、蛋白質-基因以及代謝途徑之間的關系上，而對于TBP與生物分子之間的相互作用[82]以及其他生物分子如非編碼RNA對其生物毒性作用的調節機制[126]等方面的認識非常有限，迫切需要深入研究，為今后全面了解TBP的毒性和生態風險評估提供理論依據和數據支持。