HNO3改性荔枝木生物炭對大豆累積Cu、Ca、As、Cd的影響

唐惠娟，江紅櫻，李霞，向紹錦，曾慶宇，劉俊,2,3,4,5,*，楊飛，吳順

1.南華大學衡陽醫學院，基礎醫學院，細胞生物學與遺傳學教研室，衡陽 421001

2.南華大學衡陽醫學院，基礎醫學院，生態健康與人類重要疾病防控湖南省高校重點實驗室，衡陽 421001

3.南華大學衡陽醫學院，基礎醫學院，有色金屬礦區耕地重金屬污染生態阻抗技術研究衡陽市重點實驗室，衡陽 421001

4.南華大學衡陽醫學院，基礎醫學院，生物毒理與生態修復衡陽市重點實驗室，衡陽 421001

5.南華大學衡陽醫學院，公共衛生學院，典型環境污染與健康危害湖南省重點實驗室，衡陽 421001

6.中南林業科技大學生命科學與技術學院，長沙 410018

礦產資源的開發和利用在人類社會生產生活中發揮了重要作用，同時也導致了礦區周邊的農田土壤重金屬污染嚴重[1-2]。我國耕地重金屬污染嚴重，Cd、Ni、Cu、Zn、Hg和As是主要的污染元素[3]。洞庭湖濕地周圍土壤表層中As和Cd的濃度均超過《土壤環境質量標準》(GB 15618—2018)中農用地土壤篩選值，近年Cd的濃度處于持續增長狀態[4]。Ca為植物的必需元素之一，有適量的Ca可減輕Cd、Pb和Zn等重金屬對植株的毒害作用[5]。重金屬在土壤中不能被微生物分解，可長期存在于土壤中，并通過食物鏈的富集作用嚴重危害人類健康[6]。因此重金屬污染土壤的修復與利用是人類可持續發展中的重要課題。植物修復技術可原位減小或消除重金屬對農作物的危害，且不會導致二次污染的發生。從常規作物中篩選出可適用于不同土壤條件且能大面積種植的修復品種已成為一種趨勢[7]。

大豆具有生長迅速、高產穩產、可吸收累積重金屬等特點，在世界各地廣泛種植，因此其重金屬污染問題嚴重影響人類社會的食品安全[8-9]。適合在礦區生長的植物主要為草本植物，草本植物具有強的吸收土壤水分和肥料的能力，這有利于草本植株吸收重金屬[10]。大豆也屬于草本植物，其根系對土壤中的礦質元素具有較強的吸收能力。有研究表明，生物炭能促進大豆的生長以及對鎘的富集能力[11]。

我國有大面積的荔枝果園，每年果農疏剪的荔枝樹枝大量被廢棄，或者被直接焚燒，造成大量的資源浪費和環境污染。如何合理開發、利用廢棄的荔枝樹枝，以減少碳排放，成了一個重要的科學問題。生物炭是一些生物質資源通過高溫裂解所形成的富碳材料，在結構上部分高度芳香化，具有豐富的羧基等含氧官能團，有著極好的吸附性能[12]，能夠加強土壤的保水保肥能力[13]，被作為土壤改良劑廣泛應用于修復受污染的土壤[14]。有研究表明，生物炭經過生物、物理或化學改性后，在利用效能、修復重金屬污染土壤性能等方面有提高[15]。利用硫酸、磷酸、草酸和硝酸等對生物炭進行改性處理后，生物炭中的酸性官能團數目有所提高，且其比表面積也有不同程度的改變[16-17]。Wibowo等[18]利用HNO3對生物炭進行改性后，生物炭表面的酸性官能團數目顯著增加且比表面積增大。

迄今為止，未見有關經HNO3改性生物炭對大豆累積與分配Cu、Ca、As和Cd影響的研究。本項目通過盆栽試驗，研究了向重金屬污染土壤添加HNO3改性的荔枝木生物炭后，大豆生物量、植株及器官累積Cu、Ca、As和Cd的變化，探討了HNO3改性生物炭對大豆累積與分配Cu、Ca、As和Cd的影響，以期為重金屬污染土壤的修復和大豆食品安全提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

供試大豆品種為興隆一號，種子由湖南省農業科學院提供。供試生物炭原材料為荔枝木，供試土壤取自衡陽市雨母山鄉稻田土壤。供試土壤重金屬Cu、Ca、As和Cd的含量分別為16.188、1 680.525、6.855和0.310 mg·kg-1。

1.2 生物炭的制備及HNO3改性處理

用去離子水將荔枝木洗凈，在80 ℃烘干12 h。然后將荔枝木切成5 cm長的切片，放入坩堝，在馬弗爐中500 ℃炭化6 h。待自然冷卻至25 ℃，將它通過一個0.28 mm的篩子。最后用去離子水沖洗至中性pH值，制得荔枝木生物炭(BC)。

將濃硝酸優級純(9.07×10-5mg·L-1)稀釋至1.26×10-5mg·L-1，按每100 g生物炭添加1 L 1.26×10-5mg·L-1HNO3，然后在30 ℃下振蕩8 h，用自來水和去離子水漂洗，最后干燥，制備成HNO3改性荔枝生物炭(HNO3-BC)，將制成的HNO3改性荔枝木生物炭樣品保存于干燥器中。

1.3 盆栽試驗

供試土壤自然風干、錘碎、過5 mm篩，保存備用。按每kg土加0.10 g N、0.15 g P2O5、0.10 g K2O計算，以尿素、磷酸二氫銨和氯化鉀為肥源，溶于水后混勻等量噴灑在土壤中拌勻后裝盆。每盆裝風干土4 kg，HNO3改性生物炭添加量為0.125%、0.250%、0.500%和1.000%(改性生物炭在土壤中的質量占比)；以不添加HNO3改性生物炭為對照。每處理重復3次。選取籽粒飽滿的種子，0.5%次氯酸鈉浸泡消毒30 min，用去離子水沖洗。將沖洗后的種子播于盆栽土壤中，每盆4粒種子。

盆栽不定期澆灌蒸餾水，以保持土壤持水量在70%左右，且需定期除草等。在大豆植株表現為兩葉一心時，各盆保留長勢相近的2棵健壯植株，待大豆成熟，收獲成熟大豆植株地上部分和地下部分。

1.4 測定項目與方法

將收獲的大豆植株分為根、莖、葉、籽粒和豆莢5個部分，先后用自來水和去離子水洗凈，置于105 ℃烘箱內殺青1 h，再調至80 ℃烘至恒重。稱量每株大豆各器官的生物量(干質量)后，使用非金屬器械將烘干的植物樣品粉碎、混勻后分別裝入密封袋保存。植株各部位重金屬含量采用HNO3-HClO4體系消化[19]。供試土壤重金屬含量采用HNO3-HCl-HClO3消解[20]。

消解液中Cu濃度用火焰原子吸收光譜法測定，As采用原子熒光光譜儀測定，Ca和Cd濃度用原子吸收分光光度法測定[21-22]。各元素含量測定過程以國家標準物質土壤和植物進行質量控制，Cu、Ca、As和Cd這幾個元素的回收率在97.1%～103.0%范圍內，符合元素分析質量控制標準。

1.5 數據處理及分析

大豆植株重金屬總量的計算公式：植株重金屬總量=根生物量×根重金屬濃度+莖生物量×莖重金屬濃度+葉生物量×葉重金屬濃度+豆莢生物量× 豆莢重金屬濃度+籽粒生物量×籽粒重金屬濃度。大豆植株生物量=根生物量+莖生物量+葉生物量+豆莢生物量+籽粒生物量。

采用Excel 2016和SPSS 16.0軟件進行統計分析，實驗數據用“平均值±標準差”表示。

2 結果(Results)

2.1 HNO3改性荔枝木生物炭表面結構變化

由圖1可知，改性前，BC表面呈蜂窩狀，窩孔結構較多、長度不一，表面灰分較少。改性后的HNO3-BC表面孔網結構更加規整，呈更加清晰的長條狀凹槽結構；同時表面微孔結構增多，孔內有較多微小顆粒堆積。

圖1 荔枝木生物炭(BC)的掃描電鏡圖注：(a) BC；(b) HNO3-BC。Fig.1 SEM analysis of lychee biochar (BC)Note:(a) BC;(b) HNO3-BC.

2.2 HNO3改性生物炭對大豆植株和大豆籽粒生物量的影響

由圖2可知，向重金屬污染土壤施加HNO3改性生物炭對大豆植株的生物量影響顯著(P<0.05)。在一定生物炭施用范圍內，隨著HNO3改性生物炭施用量的增加，大豆植株生物量明顯降低，但達到一定施用量時大豆植株的生物量顯著增加(P<0.05)。在HNO3改性生物炭施用量為0.500%時，大豆植株的生物量達到最低值，比對照組降低了9.140%；在HNO3改性生物炭施用量為1.000%時，大豆植株的生物量達到最大值，比對照組增加了5.376%。由圖2可知，向復合重金屬污染土壤施加HNO3改性生物炭后，大豆籽粒的生物量顯著增加(P<0.05)。在HNO3改性生物炭施用量為1.000%時，大豆籽粒的生物量達到最大值，與對照組相比增加了25.000%。

圖2 HNO3改性生物炭對大豆植株和大豆籽粒生物量的影響注：不同小寫字母表示不同生物炭用量間差異顯著(P<0.05)。Fig.2 Effect of HNO3 modified biochar on the biomass of soybean plant and soybean seedsNote:The different lowercase letters indicate significant difference among different biochar dosage (P<0.05).

2.3 HNO3改性生物炭對大豆植株累積重金屬總量的影響

由表1可知，向重金屬污染土壤中施加HNO3改性生物炭后，大豆植株累積Cu、As、Cd和Ca的總量顯著增加(P<0.05)。在HNO3改性生物炭施用量為0.125%時，大豆植株累積的As總量達到最大值，比對照組增加了47.059%；在HNO3改性生物炭施用量為0.250%時，大豆植株累積的Cu和Cd總量達到最大值，分別比對照組增加了25.506%和44.048%；在HNO3改性生物炭施用量為1.000%時，大豆植株累積的Ca總量達到最大值，比對照組增加了65.778%。

表1 施用HNO3改性生物炭對大豆植株累積重金屬總量的影響Table 1 Effect of applying HNO3 modified biochar on the total heavy metals accumulated in soybean plants

2.4 HNO3改性生物炭對大豆植株各器官累積重金屬的影響

2.4.1 大豆植株各部位Cu含量

由表2可知，向重金屬污染土壤施用HNO3改性生物炭后，大豆植株根、豆莢和籽粒中Cu含量顯著增加(P<0.05)。在HNO3改性生物炭施用量為0.250%時，大豆植株根、豆莢和籽粒中的Cu含量達到最大值，比對照組分別增加了174.777%、46.518%和33.574%。HNO3改性生物炭施用量為0.500%時，大豆植株莖和葉中的Cu含量達到最大值，比對照組分別增加了18.693%和22.882%。

2.4.2 大豆植株各部位As含量

由表2可知，向重金屬污染土壤施用HNO3改性生物炭后，大豆植株根、莖、豆莢和籽粒中As的含量顯著增加(P<0.05)。在HNO3改性生物炭施用量為1.000%時，大豆植株根、莖和籽粒中的As含量達到最大值，比對照組分別增加了88.870%、11.111%和23.611%。在HNO3改性生物炭施用量為0.125%時，大豆植株豆莢中As含量達到最大值，比對照組增加了42.424%。

2.4.3 大豆植株各部位Cd含量

由表2可知，向重金屬污染土壤施用HNO3改性生物炭后，對大豆植株各器官中Cd的含量影響顯著(P<0.05)。大豆植株根和豆莢中Cd含量較對照組顯著增加，分別在施用量為0.250%、1.000%時達到最大值，比對照組分別增加了176.002%、28.732%。在施用量為0.125%時，大豆植株莖和葉中Cd含量顯著降低(P<0.05)；隨著施用量的增加，莖和葉中Cd的含量顯著增加(P<0.05)，分別在施用量為0.500%、1.000%時達到最大值，比對照組分別增加了8.141%、59.407%。施加HNO3改性生物炭后，大豆植株籽粒中Cd的含量顯著降低，在施用量為1.000%時，籽粒中Cd的含量達到最小值，比對照組降低了69.620%。

2.4.4 大豆植株各部位Ca含量

由表2可知，向重金屬污染土壤施用HNO3改性生物炭后，大豆植株各器官Ca的含量顯著增加(P<0.05)。在HNO3改性生物炭施用量為0.125%時，大豆根中Ca含量達到最大值，比對照組增加了100.706%。在HNO3改性生物炭施用量為1.000%時，大豆莖、葉、豆莢和籽粒中Ca含量達到最大值，比對照組分別增加了30.995%、72.871%、33.853%和20.093%。

表2 施用HNO3改性生物炭對大豆植株各器官重金屬含量的影響Table 2 Effect of applying HNO3 modified biochar on the accumulated heavy metals in the organs of soybean plants

3 討論(Discussion)

3.1 HNO3改性生物炭對大豆植株生長的影響

As-Cd復合污染對大豆植株的生長具有抑制作用，且As-Cd復合污染比單元素As污染對大豆植株生長的抑制作用更強[23]。Cu是植物生長必需的微量元素，但是植物組織中過量的Cu會產生毒害作用，如降低植物的光合作用及對礦物質元素的吸收能力等[24]。Ca能促進大豆植株某些酶的活化，改善大豆根瘤的固氮能力，從而促進大豆植株的生長發育[25]。有研究表明，Ca能有效緩解重金屬對植物的毒害作用[26-27]，氯化鈣的施加可促進大豆的生長[28]。有研究發現，向土壤中施用100 t·hm-2的生物炭，并配施氮肥，可使蘿卜的干物質質量增加95%～266%[29]。在不同類型和不同利用方式的土壤中添加生物炭后，土壤中pH增加、有機碳、全氮和速效鉀等含量均顯著提高[30-33]。施用生物炭可改善土壤板結、通氣性和含水率等，其中含水率隨生物炭施用量的增加而增加[34-35]。

研究表明，重金屬在植物體內的累積會影響植株生物量的增長及其在各器官中的分配格局[36-37]。在本研究中，HNO3改性生物炭的施用促進了大豆植株對Cu、Ca、As和Cd的吸收，因此大豆植株會受到Cu、As和Cd的毒害作用；同時HNO3改性生物炭對土壤性質的改善可促進大豆植株的生長，大豆植株各器官累積Ca含量的增加可拮抗Cu、As和Cd對大豆植株的毒害作用。本研究結果表明，在低濃度生物炭施用量范圍內，HNO3改性生物炭對大豆植株的生長有一定的抑制作用。可能是由于HNO3改性生物炭促進了Cu、As和Cd的累積，Cu、As和Cd對大豆植株的毒害作用占優勢，從而抑制了大豆植株的生長；高濃度的HNO3改性生物炭促進了大豆植株的生長，可能由于隨著HNO3改性生物炭濃度的增加，大豆植株累積Ca的含量逐漸增加，Ca對大豆植株的解毒作用及土壤理化性質改善促進大豆植株生長協同作用的結果。在本研究中，施用HNO3改性生物炭后，大豆籽粒的生物量顯著增加。這可能是由于As、Cd主要分布于大豆植株的營養器官，籽粒中Cd含量顯著降低；同時大豆植株各器官Ca含量增加、土壤理化性質改善。因此在低濃度生物炭施用范圍內，大豆植株其他各器官的生長受到了Cu、As和Cd抑制，但大豆籽粒的生長受到了促進作用。本研究發現，大豆植株各器官中累積的Cu、Ca、As和Cd等重金屬含量隨HNO3改性生物炭的施用量不同而改變，進而導致大豆植株各器官的生物量分配格局發生改變；但其機制尚不明確，值得進一步探究。

3.2 HNO3改性生物炭對大豆植株累積重金屬的影響

土壤中可經遷移被植物吸收的重金屬為有效態重金屬，重金屬的有效性決定了其在土壤中的毒害作用[38]。土壤pH值是重金屬形態和遷移的關鍵控制因素，有研究表明，土壤中有效態Pb和有效態Cd的含量與有機質含量和pH值存在負相關關系，通過提高土壤的pH值并施用有機鈍化劑可有效降低重金屬的有效態[39-40]。采用不同的處理方法對生物炭進行處理后，生物炭的各種表面理化性質將發生改變，包括生物炭的表面官能團、表面積和表面電荷等的改變[41-43]。如經酸堿處理、磁化處理等改性處理的生物炭一般其比表面積增大、表面官能團增多，因此其吸附能力得到提高[44]。有學者利用HNO3對松木屑生物炭進行改性處理，經改性后的生物炭比表面積、總孔容積及表面的酸性基團羧基、酚羥基顯著增加[45]。楊蘭等[46]利用HNO3對油菜秸稈制備的生物炭進行改性，結果表明HNO3改性生物炭可降低土壤中的pH值，提高了土壤中Cd的有效態含量。

本研究中生物炭經HNO3改性后，呈現清晰的條狀凹槽結構，微孔結構增多，孔內有較多微小顆粒堆積，使孔隙空間減小，增加了生物炭的比表面積。這是由于HNO3具有強氧化性，生物炭表面發生氧化作用，打通了表面封閉的細小微孔結構，同時使孔壁坍塌成較大孔徑[47]。本研究結果表明，向重金屬污染土壤中施加HNO3改性生物炭后，大豆植株對Cu、Ca、As和Cd的累積作用均顯著提高。這可能是由于經HNO3改性的生物炭比表面積及總孔容積增加，對大豆植株根際周圍土壤的持水作用增強，促進了Cu、Ca、As和Cd隨著水分向大豆植株的遷移和積累；同時由于HNO3改性的生物炭酸性基團顯著增加，施用HNO3改性生物炭降低了土壤中的pH值，增加了土壤中有機質含量，促進重金屬在土壤中的水解，大豆根際土壤對Cu、Ca、As和Cd的吸附作用減弱。

3.3 HNO3改性生物炭對大豆植株各器官中重金屬含量的影響

由表2可知，Cu在大豆植株中含量分布為根>籽粒>葉>莖>豆莢，As在大豆植株中含量分布為根>葉>豆莢≈莖>籽粒，Cd在大豆植株中含量分布為根>葉>莖>豆莢>籽粒，Ca在大豆植株中的含量分布為葉>莖>豆莢>根>籽粒。由此可見，Cu、As、Cd和Ca在大豆植株各器官的分布具有差異性。重金屬在植物中的分布規律一般為地下部分>地上部分，即根>莖葉>籽粒。本研究中Cu在籽粒中的含量高于在莖葉中的含量，有研究表明，大豆豆莢和籽粒中的Cu含量高于莖葉，Cu為植物必需元素之一，易于向籽粒轉移[48]，本研究結果與其一致；Ca主要分布在葉中，這是因為Ca參與植物的光合作用、氧化磷酸化，因此Ca易向葉片遷移[49]。

本研究中向土壤施加HNO3改性生物炭，大豆植株對Cu、Ca、As和Cd的累積總量增加。各HNO3改性生物炭施用水平均顯著增加了Cu、Ca和As在根、豆莢和籽粒的累積量，且大豆籽粒的生物量明顯增加。因此可能是由于籽粒的生長及HNO3改性生物炭促進了大豆植株水分的吸收，從而促進了Cu、Ca和As隨著營養物質及水分由根部向籽粒的遷移。大豆植株各器官中根部是大豆植株累積Cd的主要器官，將Cd從根部運往地上部的能力弱[50]。研究表明，大豆植株受到Cd脅迫時，大豆植株可以將吸收的Cd大部分保留在營養器官中，進而減少籽粒中的Cd含量[51]，與本試驗研究的結果一致。大豆植株葉片和豆莢對Cd的累積影響Cd在大豆植株其他各器官中的分布，特別是影響Cd在籽粒中的累積[51]。有研究表明，Cd是易溶于水的金屬元素，Cd和水分易受水稻葉片蒸騰作用的影響而向葉片轉移，生物炭的施用可以加強這一影響[52]。另有研究表明，施用生物炭可以相對增加水稻籽粒Cd庫的相對容量，使水稻籽粒的Cd含量降低[53]。本研究中Cd在豆莢、葉片中的含量明顯增加，但在籽粒中的含量明顯降低。可能是由于HNO3改性生物炭的施用提高了大豆根際土壤的持水率，大豆植株葉片的蒸騰作用增強，從而促進了Cd和水分子向葉片的轉移；HNO3改性生物炭還可通過增加大豆籽粒Cd庫的相對容量，繼而使大豆籽粒Cd含量降低。

3.4 “HNO3改性生物炭+大豆植株”模式修復重金屬污染農田的潛力

素有“魚米之鄉”美稱的湖南省土壤重金屬污染嚴重，并已影響農產品食品安全與人類健康[4,22]。研究表明，湖南省湘潭市、株洲市和衡陽市等地抽檢的稻米Cd、As嚴重超標[54-55]。因此，有必要對湖南省耕地土壤進行重金屬修復和阻控[56]。本研究中，向重金屬污染土壤施加HNO3改性生物炭后，大豆植株對Cu、As、Cd和Ca的累積能力明顯增強。在HNO3改性生物炭用量為0.25%時，每株大豆可有效去除重金屬污染土壤中Cu(0.310 mg)、As(0.020 mg)和Cd(0.121 mg)，按一般農田種植密度，預計種植20萬株·hm-2(添加HNO3改性生物炭改良土壤)，可去除重金屬污染土壤Cu 62 020 mg、As 3 920 mg和Cd 24 140 mg。HNO3改性生物炭可降低籽粒中Cd含量，增加籽粒中As的含量，同時大豆籽粒的生物量明顯增加。參照谷類的標準，籽粒的As與Cd含量均未超出《食品安全國家標準 食品中污染物限量》(GB 2762—2017)食品安全限量值。Cd在大豆籽粒中主要存在于粗蛋白和淀粉中，只有極少量分布于粗脂肪中，因此可以利用Cd脅迫下生產的大豆籽粒提煉植物油，進一步降低大豆籽粒中Cd的健康風險[57]。近年來，生物能源材料因具有可再生性、安全性好等特點，正在被逐步開發利用[58]，大豆油可作為生物柴油的原料，利用大豆油制備生物柴油的相關研究越來越多[59-61]。因此，HNO3改性生物炭可提高大豆植株修復重金屬污染土壤的能力，同時可促進大豆植株可食用部分籽粒的生物量的增長，且大豆籽粒中As與Cd的含量未超出《食品安全國家標準 食品中污染物限量》(GB 2762—2017)標準中規定的食品限量值。