尼羅羅非魚marco基因克隆、亞細胞定位及表達分析

楊觀健，汪志文，黎 源，李炳喜，魯義善

（1.廣東海洋大學水產學院/2.廣東省水產動物病害防控與健康養殖重點實驗室，廣東 湛江 524088；3.廣東海洋大學深圳研究院/4.廣東省水生動物健康評估工程技術研究中心/5.深圳市海水經濟動物種苗健康評價公共技術服務平臺，廣東 深圳 518120）

清道夫受體（scavenger receptors，SRs）是由一類結構各異功能多樣的糖蛋白組成的蛋白質家族，屬于先天性免疫模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），主要分布于吞噬細胞表面，具有抗原識別、吞噬、內毒素清除、細胞黏附和細胞活性調節等多種功能[1-4]。而膠原樣結構巨噬細胞受體（macrophage receptor with collagenous structure，Marco）是清道夫受體家族的重要成員，最早是由Elomaa 等[5]于1995 年在小鼠中發現并命名，屬于A類第6 號成員，因此又被稱為SR-A6[6]。從結構上看，Marco包含一個短的胞內部分、一個跨膜結構域和一個由間隔結構、長的膠原樣結構域與C 端富半胱氨酸受體結構域（scavenger receptor cystein-rich，SRCR）組成的胞外部分，直接或間接參與機體的防御功能[7-8]。研究表明，Marco是一個多功能分子，具有廣泛的配體結合特性，參與內吞作用、細胞黏附、細胞轉運和細胞內信號轉導等許多生物學過程，并參與聚陰離子粒子的結合與攝取[9-10]，在吞噬細胞介導的先天性免疫應答中起著重要作用。關于marco基因的研究主要聚焦在智人（Homo sapiens）[11]、小鼠（Mus musculus）[12]和豬（Sus scrofa）[13]等哺乳動物上，在鳥類[14]中也有報道。然而，有關魚類marco基因的研究，特別是它的功能方面的研究較少。目前，在大黃魚（Larimichthys crocea）[15]、斑馬魚（Daniorerio）[16]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[17]和香魚（Plecoglossus altivelis）[18]中鑒定出Marco同源物，并闡明marco基因在這些魚類中的表達模式。迄今為止，marco基因在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）上的研究尚未見報道。

羅非魚原產于非洲，因其具有富含蛋白、肉質鮮美、價格低和易養高產等優點[19-20]，成為聯合國糧農組織重點推薦的優質經濟魚類。據統計，近年來全球養殖羅非魚產量持續增長，2020 年我國羅非魚養殖產量已達165.54 萬t[21]。隨著養殖規模擴大和養殖環境惡化，以鏈球菌病為主的羅非魚病害頻繁發生，對該產業造成巨大的經濟損失[22-24]。目前，針對羅非魚抗菌免疫的研究逐漸成為熱點。鑒于marco基因在先天性免疫中能夠發揮識別和結合病原體、清除內毒素等重要作用，研究尼羅羅非魚marco基因（Onmarco）的生物學特征和調節機制是必要的。在本研究中，從尼羅羅非魚中克隆獲得marco基因，并對其進行生物信息學、亞細胞定位及表達分析，以期為闡明marco基因在羅非魚抗感染免疫應答中的作用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗用魚 實驗所用尼羅羅非魚購自廣東省湛江市東風市場，規格為（100 ± 10）g/尾，在水溫28 ℃條件下暫養4周備用。

1.1.2 主要實驗試劑及儀器 RNAlaterTMStabilization Solution、PCR 產物純化試劑盒（Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit）、LipofectaminTM3000 Transfection Reagent、DMEM 培養基、胎牛血清FBS 和胰酶Trypsin 購自Thermo 公司；RNA 提取試劑盒（TransZol Up Plus RNA Kit）、平末端克隆試劑盒（pEASY?-Blunt Cloning Kit）和qPCR 試劑盒（TransStart?Green qPCR SuperMix）購自北京全式金公司；反轉錄試劑盒（Reverse Transcriptase M-MLV）、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 和EcoRI、BamHI 限制性內切酶購自TaKaRa 公司（大連）；無內毒素質粒提取試劑盒（E.Z.N.A.?Endo-Free Plasmid DNA Mini Kit Ⅱ）購自Omega 公司；聚肌胞苷酸（Poly I:C）、脂多糖（LPS）購自Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、40 mg/mL 多聚甲醛、抗熒光猝滅封片劑、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購自碧云天公司；Percoll 細胞分離液購自Solarbio 公司；pDsRed-Monomer-N1質粒、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）菌種ZQ0910 和人胚腎細胞HEK-293T來自廣東省水產動物病害防控與健康養殖重點實驗室；引物由生工生物工程公司（廣州）合成。

組織研磨器（TissueLyser II）購自Qigen公司，超微量核酸蛋白測定儀（Nanodrop 2000）和高速離心機（Sorvall Legend Micro 21）購自Thermo 公司，PCR 儀（T100）購自BioRad 公司，凝膠電泳系統（BG-Power 600）購自Baygene 公司，凝膠成像儀（Tanon 4100）購自上海天能科技有限公司，振蕩培養箱（PY-3-3）購自蘇州培英實驗設備有限公司，激光共聚焦顯微鏡（ZEISS LSM 710）購自蔡司公司，熒光定量PCR儀（Light Cycler 96）購自上海羅氏公司。

1.1.3 實驗引物 實驗所用引物見表1。

表1 實驗所用引物Table 1 The primers in this experiment

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗用魚組織預處理 撈取暫養的健康尼羅羅非魚6 尾，收集血液（blood，BL）、皮膚（skin，Sk）、鰓（gill，Gi）、肌肉（muscle，M）、腦（brain，Br）、頭腎（head kidney，HK）、脾臟（spleen，Sp）、肝臟（liver，Li）、胸腺（thymus，Th）和腸道（intestine，In）等10 個組織各10～20 mg，放入RNAlater 后置于-80 ℃冰箱保存備用。

攻毒實驗采用腹腔注射方式，實驗組分別注射1×107cfu/mL 的無乳鏈球菌0.1 mL 和0.2 mg/mL 的聚肌胞苷酸（Poly I:C）0.1 mL，對照組注射等量的磷酸鹽緩沖液（PBS），在感染后0、6、12、24、48、72 和96 h 等7 個時間點分別取尼羅羅非魚6 尾，收集腸道、頭腎和脾臟等3個組織，迅速放入裝有RNAlater的無RNA酶離心管，置于-80 ℃冰箱保存備用。

選擇規格較大的健康尼羅羅非魚，剖取頭腎組織，用Percoll 分離法分離頭腎白細胞后，分為4 組，分別用終濃度均為5 μg/mL 的無乳鏈球菌、脂多糖（LPS）和Poly I:C 進行刺激，并用等量PBS 作對照；分別在0、6、12、24和48 h收集細胞培養液于1.5 mL無RNA 酶離心管，離心后棄上清；加入1 mL Trizol UP混勻后，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 總RNA 的提取及cDNA 的合成 取出冷凍保存的組織樣品，參照TransZol Up Plus RNA Kit 說明書提取總RNA，再參照Reverse Transcriptase MMLV說明書進行反轉錄合成cDNA。

1.2.3Onmarco基因克隆 根據課題組前期獲得的尼羅羅非魚轉錄組數據，用Primer Premier 5.0 設計克隆引物Onmarco-1F 和Onmarco-1071R（表1），以尼羅羅非魚脾臟cDNA 為模板，對Onmarco基因進行擴增。PCR 反應體系（20 μL）：PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 10 μL，ddH2O 7.5 μL，cDNA 模板0.5 μL，Onmarco-1F 1 μL，Onmarco-1071R 1 μL。PCR 反應條件：98 ℃10 s，55 ℃15 s，72 ℃90 s，34個循環；72 ℃5min；4 ℃保存。反應結束后，PCR產物先經瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后純化回收，與pEASY?-Blunt Cloning Vector連接，并轉化到Trans1-T1感受態細胞中。挑取單菌落進行菌落PCR 鑒定，并將陽性單克隆送至生工生物工程公司（廣州）測序。

1.2.4 生物信息學分析 測序結果通過SeqMan 軟件進行拼接，獲得Onmarco基因序列。經NCBI BLAST 比對確定，利用NCBI ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找開放閱讀框（open reading frame，ORF）并推導氨基酸序列，然后分別用ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸序列的理化性質，用ExPASy-ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析親疏水性，用SignalP 5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測信號肽，用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測跨膜結構域，用NCBI Conserved Domain Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測保守結構域，用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html）預測二級結構，用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預測三級結構并用PyMOL 軟件分析空間結構，用ClustalX 2.1 軟件進行多序列比對，用MEGA X 軟件基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）自展（bootstrap）1 000 次構建系統進化樹。

1.2.5 亞細胞定位 構建pDsRed-OnMarco 真核表達載體，限制性酶切位點為EcoRI和BamHI，然后參照E.Z.N.A.?Endo-Free Plasmid DNA Mini Kit Ⅱ說明書提取無內毒素質粒。

將HEK-293T細胞接種到24孔板（孔直徑15.6 mm）培養18 h 后，參照LipofectaminTM3000 Transfection Reagent 說明書分別轉染空載質粒pDsRed-Monomer-N1 和重組質粒pDsRed-OnMarco，孵育48 h 后，用胰酶消化，然后重懸吸取部分細胞于處理后的蓋玻片上，繼續孵育6 h。孵育結束后，先用PBS 洗滌2 次，用40 mg/mL 多聚甲醛固定，再滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）進行細胞核染色，最后用PBS洗滌2次，加入抗熒光猝滅封片劑封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.2.6Onmarco基因表達分析 根據Onmarco基因序列的保守區域，用Primer Premier 5.0設計qPCR引物qRT-Onmarco-427F、qRT-Onmarco-597R（表1），用β-actin作為內參基因，每個樣本設置3個平行復孔。使用Light Cycler 96熒光定量PCR儀進行qRT-PCR，分析marco基因在健康尼羅羅非魚各組織的特異性分布、經無乳鏈球菌和Poly I:C 感染的組織表達情況以及不同刺激物刺激頭腎白細胞后的相對表達量。qRT-PCR 反應體系（20 μL）：Green qPCR SuperMix 5 μL，ddH2O 4.3 μL，cDNA 模 板0.3 μL，qRT-Onmarco-427F 0.2 μL，qRT-Onmarco-597R 0.2 μL。反應條件：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，40個循環；95 ℃10 s，60 ℃60 s，95 ℃1 s；37 ℃10 s。實驗結果采用2-ΔΔCt法計算，用GraphPad Prism 8軟件進行數據分析及圖表處理。

2 結果與分析

2.1 Onmarco基因克隆及序列分析

實驗克隆獲得Onmarco基因序列（GenBank 登錄號：MZ352749），開放閱讀框（ORF）為1 071 bp，共編碼356個氨基酸（圖1）；預測的編碼蛋白的理論分子質量為38.47 ku，理論等電點（PI）為6.14，脂肪指數（Aliphatic index）為67.58，不穩定指數為24.81，總體平均親水性（GRAVY）為-0.735；不存在信號肽。用ExPASy-ProtScale 進一步分析其親疏水性，親水區域占比大（圖2）。結構域預測結果顯示，在推導的OnMarco 氨基酸序列中存在跨膜結構域、膠原樣結構域和SR（即SRCR）結構域，其胞外區（第72～356位氨基酸）占80%（圖3、4）。

圖1 Onmarco基因ORF序列及其推導的氨基酸序列Fig.1 Open reading frame and deduced amino acid sequences of Onmarco gene

圖2 OnMarco親疏水性預測Fig.2 Hydrophobicity prediction of OnMarco

圖3 OnMarco跨膜結構域預測Fig.3 Prediction of transmembrane domain of OnMarco

圖4 OnMarco保守結構域預測Fig.4 Conserved domain prediction of OnMarco

2.2 二級結構與三級結構預測

二級結構預測結果顯示，OnMarco 中的無規則卷曲由205 個氨基酸組成，占57.58%；α-螺旋由78個氨基酸組成，占21.91%；β-折疊結構由12 個氨基酸組成，占3.37%；延伸鏈由61 個氨基酸組成，占17.13%（圖5）。

圖5 OnMarco二級結構預測Fig.5 Secondary structure prediction of OnMarco

利用SWISS-MODLE 對OnMarco 進行同源建模，然后使用PyMOL 進行3D 結構可視化，并和小鼠Marco 三級結構進行比較，發現OnMarco 與哺乳動物Marco三級結構相似（圖6）。

圖6 OnMarco（A）與小鼠Marco（B）三級結構Fig.6 Three-dimensional structures of Marco in O.niloticus(A)and Mus musculus(B)

2.3 同源性與系統進化分析

多序列比對結果顯示，OnMarco 與奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）的相似度最高，為99.44%；與斑馬擬麗魚（Maylandia zebra）、眼斑雙鋸魚（Amphiprion ocellaris）、小鼠（Mus musculus）、人（Homo sapiens）的相似度分別是94.10%、60.80%、42.79%、43.87%（圖7）。

基于NJ 法構建的系統進化樹中，爬行類、鳥類和哺乳類聚為一簇，硬骨魚類單獨聚為一簇，其中尼羅羅非魚與奧利亞羅非魚聚為一支（圖8）。

圖8 基于NJ法構建Marco系統進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of Marco based on Neighbor-Joining method

2.4 亞細胞定位

亞細胞定位實驗結果顯示，在HEK-293T 細胞的全細胞中都有紅色熒光分布，細胞膜上的熒光信號較強（圖9）。

圖9 OnMarco在HEK-293T細胞中的亞細胞定位Fig.9 Subcellular localization of OnMarco in HEK-293T cells

2.5 Onmarco基因的組織特異性分布

通過實時熒光定量（qRT-PCR）技術檢測健康尼羅羅非魚Onmarco基因在各個組織中的表達量，實驗結果表明，Onmarco基因在各個組織中都能廣泛表達，但在血液組織中表達量最高，其次為肌肉、腸道、脾臟、肝臟、腦和胸腺，在皮膚、頭腎和鰓中表達量較低（圖10）。

圖10 Onmarco基因在不同組織中的表達情況Fig.10 Expression analysis of Onmarco in different tissues

2.6 Onmarco 基因在無乳鏈球菌和Poly I:C 刺激后的時序表達

滅活的無乳鏈球菌和Poly I:C 感染尼羅羅非魚后，定量分析檢測羅非魚腸道、頭腎和脾臟3個組織中Onmarco基因的時序表達情況。結果顯示，經無乳鏈球菌刺激后，Onmarco基因表達量在腸道中48 h達到峰值，其余時間表達量較低（圖11(A)）；在頭腎和脾臟中的表達模式類似，表現出交替的起伏波動（圖11(B，C)）。經病毒類似物Poly I:C 刺激后，Onmarco基因表達量在腸道和頭腎中48 h 達到峰值（圖12(A，B)）；在脾臟中在24 h 出現表達高峰（圖12(C)）。

圖11 滅活無乳鏈球菌刺激后Onmarco基因在3個組織中的時序表達Fig.11 Expression analysis of Onmarco in three tissues after S.agalactiae infection

圖12 Poly I:C刺激后Onmarco基因在3個組織中的時序表達Fig.12 Expression analysis of Onmarco in three tissues after Poly I:C infection

2.7 Onmarco基因在不同刺激物刺激頭腎白細胞后的表達模式

用Percoll 分離法分離獲得羅非魚頭腎白細胞，用LPS、Poly I:C 和滅活后的無乳鏈球菌孵育細胞，然后檢測0、6，12，24 和48 h 等5 個時間點Onmarco基因表達情況。結果顯示，在LPS 刺激下Onmarco基因表達量在6 h 達到峰值（圖13(A)）；在Poly I:C刺激下Onmarco基因表達量在12 h顯著升高，在24 h下降，在48 h又顯著升高（圖13(B)）；在滅活的無乳鏈球菌刺激下Onmarco基因表達量逐漸升高，在48 h達到峰值（圖13(C)）。

圖13 不同刺激物孵育尼羅羅非魚頭腎白細胞后Onmarco基因的表達Fig.13 Expression of Onmarco in head kidney leukocyte of immunized O.niloticus

3 討論

本研究克隆得到的尼羅羅非魚marco基因的ORF為1 071 bp，共編碼356個氨基酸。多序列比對結果表明，Marco 蛋白序列和結構域在魚類中是保守的，OnMarco 與奧利亞羅非魚的相似度最高（99.44%）；分子系統進化分析顯示，尼羅羅非魚與奧利亞羅非魚親緣關系最近，聚為一支。與其他生物Marco類似，OnMarco由一個短的胞內段、一個跨膜結構域和一個長的胞外段組成，胞外段具有膠原樣結構域（第194～251位氨基酸）和SR結構域（第261～355 位氨基酸）。與哺乳動物不同的是，OnMarco 僅有一個膠原樣結構域，這與大黃魚的結果一致[15]，表明Marco 在物種進化上出現了差異，膠原樣結構域的數量可能會影響免疫反應的強度。SR 結構域是SR-A家族成員的典型結構域，在結合配體時起到關鍵作用[9]，對隨后的免疫反應至關重要。研究表明，在敲除人和小鼠marco基因的SR 結構域后，它無法正確識別和結合相應的配體[25]。Novakowski 等[7]認為marco基因的SR 結構域還有助于加強吞噬作用，識別病原體，保護生物免受損害。因此，OnMarco具備的SR 結構域是其參與機體免疫活動，防御病原體入侵的前提。亞細胞定位實驗結果顯示，在HEK-293T 細胞的全細胞中都有紅色熒光分布，說明OnMarco 為全細胞分布；細胞膜上的熒光信號較強，說明OnMarco主要在細胞膜上表達。

基因的組織和病理相關表達模式通常與它們的功能有關。有報道稱小鼠marco基因主要在脾臟中表達[26]，人類marco基因主要表達于肺、肝臟和淋巴結[27]。在本研究中，Onmarco基因在健康尼羅羅非魚各組織中廣泛表達，在血液中表達量最高，與香魚（Plecoglossusaltivelis）中的表達特征類似[18]。marco基因在魚類和哺乳動物中的表達特征存在差異，可能是marco基因的表達存在物種特異性。血液是魚體的重要免疫場所，富含吞噬細胞等多種免疫細胞，在魚類免疫中具有重要的作用，其中白細胞能夠直接參與免疫應答過程[28-30]，Onmarco基因在血液中出現高表達量，推測其參與了羅非魚對病原體感染的免疫應答。

無乳鏈球菌感染后，Onmarco基因在腸道、頭腎和脾臟3個組織中的表達水平均有顯著上調。腸道是機體最大的黏膜免疫器官，屬于外周淋巴器官，是抵御病原體感染的重要防線，能夠識別清除入侵的細菌[31]。頭腎和脾臟是魚類各類血細胞發生的主要器官，是無乳鏈球菌攻擊的主要靶器官[32-33]，所以在腸道中，Onmarco基因在48 h 上調表達，而在頭腎和脾臟中6 h 即顯著上升。經Poly I:C 刺激后，Onmarco基因在腸道、頭腎和脾臟3 個組織中表達水平呈時間依賴性上調。Marco有助于巨噬細胞識別病毒，從而引起強烈的免疫反應[34]。Qiu等[35]發現在美國紅魚頭腎和脾臟中，病毒感染會引起marco基因上調表達。在腸道、頭腎和脾臟3 個組織中，Onmarco基因均顯著上調，達到峰值后又恢復正常水平，可能與魚類先天性抗病毒免疫反應有關。

通過LPS、Poly I:C 和滅活后的無乳鏈球菌刺激，檢測頭腎白細胞中Onmarco基因的時序變化情況，結果顯示3 種刺激物都可以上調Onmarco基因的表達，但最高表達量出現的時間略有不同。Poly I:C和無乳鏈球菌刺激后最高表達量均出現在48 h，而LPS 刺激后迅速上調，在6 h 即達到峰值，隨后成下降趨勢，表明Onmarco基因對LPS 更為敏感且反應迅速。與SR-A 家族的其他成員一樣，Marco可以結合革蘭陽性菌和革蘭陰性菌[17]。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的組成成分，可以刺激白細胞，促使炎癥介質的釋放，從而誘導SR-A表達[36]。通過LPS 刺激后，Onmarco基因表達上調，這說明OnMarco 可能在LPS誘導的炎癥中發揮抑制作用。Onmarco基因受到滅活的無乳鏈球菌刺激后上調表達，與小鼠SR-A 抵御李斯特菌和其他革蘭陽性菌的結果一致[37]。據報道，Marco 還能抑制病毒的復制[38]。Poly I:C 是一種人工合成的dsRNA，可作為病毒類似物，激活免疫細胞[39]，Onmarco基因受其刺激后上調表達，可以由此推測OnMarco 在抗病毒感染中發揮免疫作用。這些結果表明，Onmarco基因可以通過革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和病毒類似物的刺激來誘導表達，以保護尼羅羅非魚免受細菌和病毒的感染。此外，Onmarco基因對不同的病原體有不同的表達模式，可能是因為參與不同的信號調節途徑。

4 結論

本研究克隆獲得的Onmarco基因與其他魚類的保守性較高，在HEK-293T 細胞上表現為全細胞分布，主要在細胞膜上表達。Onmarco在尼羅羅非魚各個組織中廣泛表達，其中，血液組織中的表達量最高；經滅活的無乳鏈球菌和Poly I:C 刺激后，Onmarco在羅非魚腸道、頭腎和脾臟中的表達量均呈時序性變化；用LPS、Poly I:C 和滅活后的無乳鏈球菌刺激羅非魚頭腎白細胞，Onmarco表達量均顯著上調，表明Onmarco基因可能在魚體抵御細菌和病毒入侵的免疫反應中發揮重要作用。