2種充氣模式中華鱉工廠化養殖水體水質及微生物群落結構

蘇俊宇，陳 辰，李 偉，雷 駱，祝駿賢，羅來福，耿露露，史 偉，李健松，張繼平，朱新平

（1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231；2.中國水產科學研究院珠江水產研究所農業農村部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣東 廣州 510380；3.惠州市財興實業有限公司，廣東 惠州 561700）

中華鱉（Pelodiscus sinensis）又稱甲魚，是我國重要的名特優水產養殖物種[1]。近年來，中華鱉工廠化養殖發展迅速，以“保溫車間＋養殖池＋地下水”為主。充氣增氧是中華鱉工廠化養殖過程中維持水質穩定，保持水體微生態平衡的重要措施。微孔增氧技術是新興的高效水體增氧技術。該技術通過管道將增壓空氣輸送到養殖池底，氣體通過管壁的微孔以微氣泡形態逸散于水中，有氣泡上升速率慢、滯留時間長、氣水接觸面積大、傳質效率高的特點，可實現水體高效、持久復氧，提高水體中好氧微生物生理活性，加快污染物降解，促進水體凈化[2-3]。該技術目前已用于循環水養殖系統水體增氧[4-5]等多個漁業領域，并取得良好效果。

本研究比較微孔管和普通通底管兩種充氣模式下中華鱉工廠化養殖水體的常規水質指標，用高通量測序方法對水體微生物進行宏基因組測序分析，探討不同充氣模式下水體微生物的群落結構組成和環境因素，為中華鱉工廠化健康養殖研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

實驗在惠州市財興實業有限公司中華鱉工廠化養殖車間進行。實驗設置微孔管和通底管兩種充氣模式（分別記為MA、DG 組），兩種充氣管均購自無錫江諾增氧設備有限公司。微孔管為三元乙丙橡膠（EPDM）材質，孔徑為25 μm；通底管為聚氯乙烯（PVC）材質，孔徑為4 mm。兩種充氣模式充氣管道在池底的布設如圖1所示。

圖1 養殖池充氣裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the inflation device installed in the indoor aquaculture ponds

每種充氣模式均設5 個重復養殖池，每個養殖池容積225 m3。實驗期間，每池投放規格為（300±40）g 的中華鱉15 000 只，投喂相同組分的配方飼料，并由專人統一管理，車間內水溫保持在（30±0.5）℃。每日在投料后1 h（5:00、12:00、18:00）充氣1 h。兩種充氣模式用功率為15 kW 的同一羅茨鼓風機進氣。

飼養2 個月后，水色變為褐色并出現絮狀沉淀物，分別從每個養殖池中采集1 L 水樣，用于后續分析。水樣采集前1 h 停止充氣，用五點采樣法采樣。使用便攜式水質分析儀（奧克丹，OCT-V型）測定pH值、溶氧量（DO）、亞硝態氮（NO2--N）、活性磷酸鹽（PO43-）和氨氮（TAN）5 個水質指標。用孔徑0.22 μm 的醋酸纖維素濾膜（Merk Millipore，USA）對樣本進行真空抽濾，取出濾膜，裝入滅菌離心管，置于液氮保存待測。

1.2 DNA提取和Illumina高通量測序

將濾膜用超低溫研磨儀研磨，按照DNA提取試劑盒（HiPure Soil DNA Kits，廣州美基生物科技有限公司）提取微生物總DNA。用NanoDrop 2000 檢測DNA 濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。

用帶有barcode 的特異引物341F（5′-CCTAC‐GGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACH‐VGGGTWTCTAAT-3′）對細菌16S rRNA 基因V3-V4 可變區進行PCR 擴增。PCR 擴增分為兩輪，第一輪擴增體系為：10×Buffer KOD 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1.5 μL，KOD 酶（東洋紡(上海)生物科技有限公司）1 μL，DNA模板30 ng，補足ddH2O至50 μL。第1 輪擴增程序為：94 ℃2 min；98 ℃10 s，55℃30 s，68 ℃30 s，30 個循環；68 ℃5 min。第1輪PCR 產物用AMPure XP Beads 純化，用Qubit 3.0定量。第2 輪擴增體系為：10×Buffer KOD 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，Index Primer（10 μmol/L）1 μL，Universal PCR Primer（10 μmol/L）1 μL，KOD 酶1 μL，DNA 模板30 ng，補足ddH2O 至50 μL。第2 輪擴增程序：94 ℃2 min；98 ℃10 s，65 ℃30 s，68 ℃30 s，12 個循環；68 ℃5 min。使用AMPure XP Beads 純化第2 輪擴增產物。純化產物使用ABI StepOnePlus RealTime PCR System（Life Technologies，美國）進行定量。使用Illumina公司的Novaseq 6000測序儀，按照PE250模式進行混池測序。

1.3 數據處理與統計分析

高通量測序數據按照Illumina 標準流程對原始數據（raw data）進行質控(QC)，獲得去除低質量讀數（reads）的有效數據（clean data）。將過濾后reads拼接為標簽（tags），對低質量tags 進行過濾，獲得用于后續分析的凈標簽（clean tags）。

為劃分操作分類單元（OTU），用USEARCH 軟件的UPARSE 算法，在相似性97% 的水平下對clean tags進行聚類分析，用UCHIME算法去除聚類比對中檢測到的嵌合體，用R程序包venndiagram對聚類結果進行統計。

基于聚類分析結果，用RDP classifier 軟件的Naive Bayesian assignment 算法對每個OUT 的代表序列進行物種注釋，并在門、科和屬水平上分析兩種充氣模式養殖水體微生物群落結構。以柱形累加圖（門、科水平）或條形圖（屬水平）呈現相對豐度（樣本的物種tags 數/樣本總tags 數）達到1%以上的物種注釋結果，并采用Welch'st檢驗比較物種間的相對豐度。

為評價兩種充氣模式下養殖水體微生物的多樣性水平，用QIIME軟件分別計算兩種充氣模式的微生物群落的α-物種多樣性指數，包括Chao1指數、ACE指數、Shannon 指數、Simpson 指數和覆蓋率（%），并用t檢驗比較多樣性指數的組間差異。為比較兩種充氣模式群落結構的差異，基于樣本間的Jaccard 距離，使用R 程序包vegan 計算組間的β-多樣性，并進行主坐標分析（PCoA）。用R 程序包ggplot2 繪制PCoA主坐標分析圖。

用SPSS 22.0 軟件對水體理化指標的組間差異進行t檢驗或Mann-Whitney U 檢驗；為評價水質因子和微生物群落相對豐度的關系，使用R 程序包vegan對屬水平相對豐度排名前10的微生物群落與前述5個水質指標進行冗余分析（RDA）。

2 結果與分析

2.1 兩種充氣模式中華鱉工廠化養殖水體的主要水質指標

在兩種充氣模式中華鱉養殖水體的主要水質指標如表1 所示。兩組水樣的pH 均呈弱酸性，DG組的pH 值（5.16 ± 0.32）顯著低于MA 組（6.22 ±0.24）；MA 組溶解氧含量較高（10.86 ± 1.98），顯著高于DG 組（4.44 ± 0.47）；兩組水樣的亞硝態氮含量均處于較低水平，MA 組含量（0.18 ± 0.08）顯著低于DG 組（0.53 ± 0.08）；兩組的磷酸鹽和氨氮含量均處于較高水平，但兩組間無顯著差異（P ＞0.05）。

表1 兩種充氣模式下中華鱉工廠化養殖水體的主要水質指標Table 1 Five water quality indices of the indoor industrial aquaculture system for Pelodiscus sinensis under two different aeration methods mg/L

2.2 兩種充氣模式下中華鱉工廠化養殖水體微生物的OUTs分布

高通量測序結果經過濾后，共獲得1293 143 條高質量reads。去除嵌合體以后，最終獲得1168 010條有效tags，平均每個樣本的高質量tags數為116 801條。OTU 聚類分析結果（圖2）表明，DG 組的平均OUTs 數目為463，MA 組的平均OTUs 數目為591。兩組共有的OTUs 數目為308，DG 組獨有的OTUs 數目為155，MA 組獨有的OTU 數目為283。

圖2 兩種充氣模式下養殖水體微生物OTUs分布維恩圖Fig.2 Venn diagram showing the OTU numbers in water of aquaculture system by two aeration methods

2.3 兩種充氣模式下中華鱉工廠化養殖水體微生物多樣性

2.3.1 α-物種多樣性指數 如表2 所示，MA 組水體微生物的4 種多樣性指數（Ace 指數、Chao1指數、Shannon 指數和Simpson 指數）均顯著高于DG 組（P ＜0.05），表明采用微孔管充氣的中華鱉養殖水體微生物多樣性明顯優于通底管充氣模式。

表2 兩種充氣模式下中華鱉工廠化養殖水體微生物α-物種多樣性指數Table 2 Alpha species diversity index of microbial taxa in the indoor industrial aquaculture system for Pelodiscus sinensis under two different aeration methods

2.3.2 β-多樣性分析 圖3 顯示，兩種充氣模式下養殖水體的微生物分別呈現明顯聚類，DG 組樣本只分布于第1、3 象限，MA 組樣本主要分布在第4 象限，主坐標PCo1 和PCo2 的方差貢獻率分別為85.00%和5.25%。表明兩種充氣模式的中華鱉工廠化養殖水體微生物群落結構差異較大，微生物群落分區明顯。

圖3 基于Jaccard距離的主坐標分析Fig.3 Principal coordinate analysis based on Jaccard distances

2.4 兩種充氣模式下中華鱉工廠化養殖水體微生物群落結構組成

2.4.1 門水平的微生物群落結構組成 兩種充氣模式下的中華鱉工廠化養殖水體共檢測到22 個門類微生物，組間的微生物門類組成相似。其中，變形菌門（Proteobacteria）等19 個門為兩種充氣模式共有。藍細菌門（Cyanobacteria）為DG 組特有；納古菌門（Nanoarchaeaeota）和Hydrogenedentes 為MA 組 特有。特有門類的相對豐富在群落組成中均小于1%。

按平均相對豐度大于10%進行優勢菌門統計，兩種充氣模式的優勢菌門差異顯著（圖4）。DG 組的優勢菌門較為集中，66.99%為變形菌門，12.81%為髕骨細菌門（Patescibacteria）；MA 組的主要優勢菌門為變形菌門（44.81%）、髕骨細菌門（13.15%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，10.49%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，9.56%）。

2.4.2 科水平微生物群落結構組成 在科水平，兩種充氣模式下中華鱉工廠化養殖水體的微生物優勢菌科（以平均相對豐度＞10%統計）差異顯著（圖4）。DG 組的優勢菌科為紅桿菌科（Rhodobacteraceae，41.25%）和紅環菌科（Rhodocyclaccae，17.32%），MA組的優勢菌科為紅環菌科（34.07%）和芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae，10.48%）。

圖4 兩種充氣模式下養殖水體微生物門與科水平的相對豐度Fig.4 Relative abundance of microbial taxa in water of aquaculture system by two aeration methods at phylum and family levels

2.4.3 屬水平的微生物群落結構組成 在屬水平，兩種充氣模式下中華鱉工廠化養殖水體的微生物組成相似（圖5），但不同微生物類群間相對豐度差異較大。兩種充氣模式均有較高比例未被注釋的菌屬（DG 組為68.70%，MA 組為79.48%）。在已鑒定的菌屬中，Denitratisoma屬是兩種充氣模式下的共有優勢菌屬，組間相對豐度差異顯著（DG 組為14.38%，MA 組為4.63%）。除Denitratisoma屬外，Luteolibacter屬（4.01%）、Limnobacter屬（2.06%）、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium，1.34%）、埃希氏-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella，1.37%）、Lacunisphaera屬（1.32%）和小紡錘狀菌屬（Fusibacter，1.31%）為DG 組的優勢菌屬，相對豐度均顯著高于MA 組；Sulfuritalea屬（3.91%）、Azospira屬（1.29%）和Tetrasphaera屬（1.17%）為MA 組的優勢菌屬,相對豐度均顯著高于DG組。

圖5 兩種充氣模式下中華鱉工廠化養殖水體微生物屬水平相對豐度Fig.5 Relative abundance of microbial taxa in water of aquaculture system by two aeration methods at the genus level

2.5 兩種充氣模式下微生物群落結構與環境因子的相關性

圖6 可見，RDA1 和RDA2 兩個排序軸對微生物群落結構的解釋程度分別為93.66%和5.66%。水體微生物群落結構與pH 和DO 有正相關性趨勢（r2=0.907，P=0.081 和r2=0.934，P=0.061），與亞硝態氮有負相關性趨勢（r2=0.922，P=0.100）。其 中，Denitratisoma屬、Novosphingobium屬、Lacunisphaera屬、Fusibacter屬 和Limnobacter屬與pH 和DO 呈顯著或極顯著的負相關關系，而Limnobacter屬、Escherichia-Shigella屬和Azospira屬均與pH、DO 有顯著或極顯著的正相關關系（圖7）。

圖6 屬水平微生物群落結構組成與環境因子的RDA分析Fig.6 Redundancy analysis(RDA)of the top 10 genus microbial taxa and five environmental factors

圖7 屬水平物種相對豐度與環境因子相關性熱圖Fig.7 Heat map of the correlation between relative abundance of top 10 genus microbial taxa and five environmental factors

3 討論

養殖水體環境的穩定對于促進水體物質代謝，控制水產養殖病害和水質調控有重要作用。自然條件下池塘養殖水體溶氧主要來源于浮游植物的光合作用。由于中華鱉工廠化養殖在遮光恒溫室內進行，浮游植物光合作用受到完全抑制。因此，高效的充氣增氧，以建立水體良性微生態環境更為重要。微孔管充氣方式因其充氣氣泡在水體中上升速率慢、浮力小，在水體中滯留時間長，氧傳質效率高，可使水體溶氧量顯著增加[6]。本研究顯示，使用微孔管充氣的水體溶解氧含量顯著高于通底管充氣（P＜0.05），亞硝態氮含量顯著低于后者（P＜0.05），水體酸堿度更接近中性，水質環境更有利于水產養殖動物的生存健康。這與魏亞南等[7]使用微孔曝氣方式調控海參（Stichopus japonicus）池塘水質環境的結果一致。研究表明，在養殖過程中使用微孔增氧技術，可有效提高養殖魚塘的產量和水產品的品質，降低養殖尾水的污染。羅楠等[8]比較了草魚（Ctenopharyngodon idella）養殖池塘微孔增氧與葉輪式增氧機增氧效果。結果表明，試驗塘（微孔增氧）的草魚終末體質量、增重率、特定生長率均顯著高于對照塘（葉輪式增氧），飼料系數顯著低于對照塘。在本研究的后續工作中，我們也發現使用微孔管充氣的養殖池商品鱉產量達33～40 kg/m2，比使用普通底管模式可提高15%以上。

本研究顯示，MA 組微生物的OTUs 數目和4 個α-多樣性指數均顯著高于DG組，表明MA組的微生物多樣性水平明顯優于DG組。RDA分析進一步顯示，微生物群落結構與溶解氧、pH 密切相關。魚類池塘水環境的穩定性與微生物多樣性關系密切，當水體微生物群落多樣性增加時，可降低水產養殖病害暴發的風險[11]。因此，本研究的微孔管充氣可有效促進中華鱉工廠化養殖水體微生態環境的穩定，對于降低及控制養殖過程中病害暴發有潛在的積極意義。

本研究顯示，不同的充氣模式對于養殖水體的微生物群落結構有顯著影響。在門水平上兩種充氣模式的第一優勢菌均為變形菌門，DG 組的相對豐度顯著高于MA 組（MA 組44.81%，DG 組66.99%）。變形菌門菌類是淡水養殖水體中分布最為廣泛的微生物[11]，在生物腸道內是極為常見的優勢菌[12]，在土壤和污水處理的氮、磷轉換方面中有極重要作用[13-14]。本研究中，兩種充氣模式下養殖水體微生物均主要由變形菌門紅桿菌科和紅環菌科構成，但二者平均相對豐度差異極顯著（P＜0.01）。紅桿菌科和紅環菌科分屬變形菌門的α 和β 簇群，目前已從中分離篩選出大量有良好反硝化聚磷能力的菌株[15]。操夢穎等[16]對主流-側流序批式反應裝置中污泥微生物群落組成的研究表明，反硝化優勢菌科占比約39.5%～58.6%，與本研究反硝化優勢菌科占比54.55%～58.57%的結果相符。

本研究中，MA 組芽單胞菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著高于DG 組的優勢菌門（P＜0.01）。芽單胞菌是養殖池塘和土壤中常見功能菌群，僅包含芽單胞菌科。芽單胞菌不僅有助于水體的反硝化過程[17]，而且對養殖動物有益生作用[18]。羅衡等[19]研究稻鱉共作模式的土壤時發現，芽單胞菌的相對豐度與pH 呈顯著正相關關系，這與本研究結果一致。擬桿菌門是水體環境中的重要微生物類群，屬于化能有機營養菌，是進行氧化溶解性有機物和碳水化合物的主要消費者之一，在各種水體環境中碳循環過程中起著重要作用[20-21]。由于微孔管充氣模式顯著提高了養殖水體的溶解氧含量，因此提升了養殖水體中需氧菌群的相對豐度，進而可促進養殖水體中的溶解性有機物和碳水化合物的降解，改善水質環境。

在屬水平上，兩種充氣模式均有較高比例未被檢出的菌屬（DG 組為68.70%，MA 組為79.48%），原因可能是本研究采用的是二代測序技術，測序讀長較短，導致屬水平的注釋率偏低。在已被鑒定的菌屬中，DG 組厭氧性菌屬和間性厭氧性菌屬的相對豐度顯著高于MA 組（圖7）。物種和環境的相關性分析結果顯示，Denitratisoma屬和Limnobacter屬與pH 和溶解氧存在顯著的負相關關系（圖9）。Denitratisoma屬是兩種充氣方式中相對豐度最高的屬。該屬屬于變形菌門，是一類兼性厭氧反硝化菌屬，具有完整的反硝化途徑，可在微氧條件下利用系統內NO3-或NO2

-進行反硝化反應[22-23]。Limnobacter屬則是具有降解反硝化過程中N2O 潛能的異養菌[24]，可以緩沖外界環境對厭氧氨氧化菌的影響[25]。除Denitratisoma屬和Limnobacter屬外，DG 組還有相對豐度較高的Fusibacter屬和Lacunisphaera屬菌群。Fusibacter屬是魚類等水產動物腸道中常見的間性厭氧性菌類，與碳水化合物的發酵有關[12,26-27]，而Lacunisphaera屬則與生物膜的產生有關[28]。李盧國等[29]對黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）循環水系統菌落結構的分析結果表明，低氧環境下可發生活躍的脫氮作用，有利于間性厭氧菌的生長。因此，厭氧反硝化菌屬在DG 組較高的相對豐度，可能是本研究中DG 組氨氮含量略低于MA 組的原因之一。此外，本研究在DG 組中還發現了一定比例的Escherichia-Shigella菌屬（1.37%），其相對豐度顯著高于MA 組。Escherichia-Shigella屬是常見于水生動物腸道內的條件致病菌，可引發宿主腸道疾病[30-31]，但目前也有報道認為Escherichia-Shigella屬可能在廢水脫氮與沼氣脫硫耦聯系統中發揮著重要作用[32]。

本研究中，Sulfuritalea屬、Azospira屬和Tetrasphaera屬相對豐度顯著高于DG 組，是MA 組已鑒定菌群中的優勢菌屬。Sulfuritalea屬為硫自養反硝化細菌，在水環境中可利用H2和單質硫等進行自養反硝化反應[33]，是重要的生物修復功能菌種[34]。Azospira屬是常見的好氧反硝化細菌，不僅存在于湖泊等天然水體的沉積物中[35]，也是生物反應器中常見的優勢菌群[36-37]。Azospira可將水體中的碳源作為電子供體進行反硝化作用，在為其自身生長提供能量同時，實現水體的脫氮[35]。Tetrasphaera屬是一種具有反硝化功能的除磷菌類，可利用NOx-N 作為電子受體，降解細菌細胞內的脂質碳源PHB（聚-β-羥丁酸），并將細胞外的PO43--P 攝入細胞內，形成多聚偏磷酸鹽，從而實現同步脫氮除磷的作用[38]。然而，本研究中MA 組和DG 組的磷酸鹽含量差異并不顯著（P ＞0.05），原因可能是Tetrasphaera屬1.17%的相對豐度尚不足以抵消來自飼料投喂等磷輸入途徑的作用。

綜上所述，使用微孔管充氣方式可有效提升中華鱉工廠化養殖水體的溶解氧含量，降低亞硝態氮含量，提高微生物菌群的多樣性，抑制條件致病菌的生長，這對于增強水體的微生物群落穩定性，降低病害暴發風險，維持水產養殖生態系統的健康具有積極作用。此外，本研究的結果初步揭示了中華鱉工廠化養殖水體的水質狀態與微生物群落結構的關系，為中華鱉工廠化健康養殖技術的進一步優化提供了基礎。