174例早期肺腺癌患者EGFR基因突變檢測和臨床病理特征分析

閆琛 徐小艷 徐憲偉 楊玉倫 楊金花

1 河南中醫藥大學第五臨床醫學院鄭州人民醫院病理科，鄭州 450000；2河南中醫藥大學第五臨床醫學院鄭州人民醫院胸外科，鄭州 450000；3中國肺癌防治聯盟-鄭州人民醫院肺結節診治分中心，鄭州 450000

肺癌是臨床上極為常見的惡性腫瘤之一，發病率與病死率都很高，嚴重威脅著人類的健康［1-2］。腺癌是常見的肺癌病理亞型，約占40%，由于其臨床癥狀較為隱匿，發現時多為晚期［3-4］。近年來，隨著肺癌篩查的普及和影像學技術的不斷更新，早期肺腺癌的檢出率得到了明顯提高［5-6］。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因的突變不僅參與了癌細胞的分化增殖及新生血管的生成，還與癌細胞的侵襲和轉移有關，更直接影響到相關靶向藥物的選擇及療效，在肺腺癌的發生發展、治療過程及預后判斷中均起著至關重要的作用［7-8］。因此研究不同時期的肺腺癌組織中EGFR基因的突變情況就顯得尤為重要，以往的報道多集中在晚期肺腺癌組織，對早期肺腺癌組織中EGFR基因的突變情況的研究較少。本研究檢測了鄭州人民醫院54例原位肺腺癌和120例微浸潤肺腺癌組織中EGFR基因的突變情況，并收集相關臨床資料，回顧性研究了早期肺腺癌中EGFR基因突變的特點及其與臨床病理特征的關系，現將研究結果總結如下。

資料與方法

1、臨床資料

選擇2019年1月至2020年12月鄭州人民醫院收治的54例原位肺腺癌患者和120例微浸潤肺腺癌患者作為研究對象，其中男性54例，女性120例，年齡25～79歲，平均年齡53.8歲，年齡≥60歲患者72例，年齡＜60歲患者102例。所有患者的原發病灶均有病理診斷結果支持和完整的胸部影像學資料，且均未接受放化療。本研究已經通過鄭州人民醫院倫理委員會的批準，入組患者均知情、同意，入組均為自愿，并按照要求在知情同意書上簽字。

2、納入與排除標準［9-11］

（1）納入標準：①對入選病例給予臨床診斷及病理學檢查，診斷結果與國際非小細胞肺癌（NSCLC）臨床診斷標準相符；②病歷資料完整；③患者具有較好依從性，能夠接受定期隨訪［12］。（2）排除標準：①伴隨嚴重器官疾病以及肝腎功能不全者；②認知功能障礙及智力障礙患者；③臨床資料不全者；④肺外存在原發性腫瘤患者；⑤存在嚴重感染及有心臟病史患者；⑥胃潰瘍患者；⑦存在藥物過敏史患者；⑧妊娠期及哺乳期婦女。

3、方法

3.1、病理類型診斷所有患者均做過外科手術，術后組織送病理科以明確病理類型。參照2015世界衛生組織（WHO）病理分類系統進行病理分型診斷［13］，由2位高年資病理醫師對每例標本的病理診斷進行復核，并確定需要進行分子檢測的標本中腫瘤百分比≥10%。

3.2、標本采集與DNA提取切片前后用75%乙醇消毒蠟塊、刀片前后、刀片座及鑷子，防止交叉污染；切片厚度5μm，數量5～10張，裝入1.5 ml EP管中。DNA提取：采用AmoyDx-FFPE DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行DNA提取，測定DNA的濃度和純度，濃度≥2 ng/μl，純度為1.8≤A260/A280≤2.0視為合格。

3.3、擴增阻滯突變系統-聚合酶鏈反應（amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR）方法檢測EGFR基因突變嚴格按照廈門艾德人類EGFR基因突變檢測試劑盒說明書進行操作，將提取好的DNA稀釋至2 ng/μl，將42.3μl稀釋過的DNA和2.7μl Taq酶混合，分別取5.0μl加入到已經預先分裝好反應液的8聯管中，瞬時離心，用ABI7500熒光定量PCR儀進行檢測，反應條件為：第一階段，95℃預變性5 min，1個循環；第二階段，95℃25 s，64℃20 s，72℃20 s，共15個循環；第三階段，93℃25 s，60℃35 s，72℃20 s，共31個循環。在第三階段60℃時收集FAM和VIC信號，執行實時PCR，按照判讀標準判讀結果。檢測結果由2位專業人員判讀，如果判讀結果不一致，再由第3位人員分析做出最終的決定。

4、統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，EGFR基因的突變率與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1、早期肺腺癌組織中EGFR基因的突變率

174例早期肺腺癌組織中有102例出現了EGFR基因突變，總體突變率為58.6%，其中18外顯子突變5例，占4.9%；19外顯子突變28例，占27.5%；20外顯子突變3例，占2.9%；21外顯子突變66例，占64.7%。3例20外顯子的突變中1例為插入突變，2例為S768I錯義突變；T790M在174例組織中均未被檢出；外顯子21的突變率較高，且全部為L858R錯義突變，見表1。

表1 174例早期肺腺癌組織中EGFR基因突變分析

2、EGFR基因突變情況與患者臨床病理特征的關系

EGFR基因的突變率在174例早期肺腺癌患者中的特點為：女性患者（77/120，64.2%）高于男性患者（25/54，46.3%），無吸煙史患者（77/119，64.7%）高于有吸煙史患者（25/55，45.5%），微浸潤肺腺癌（78/120，65.0%）高于原位肺腺癌（24/54，44.4%），純磨玻璃病灶（67/112，59.8%）和混雜磨玻璃病灶（33/52，63.5%）高于實性病灶（2/10，20.0%），腫物長徑≥1 cm的患者（60/78，76.9%）高于腫物長徑＜1 cm的患者（42/96，43.8%），差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與患者年齡無顯著關系（P＞0.05）。見表2。

表2 174例早期肺腺癌患者的EGFR基因的突變情況與臨床病理特征的關系[例（%）]

討 論

EGFR基因位于人類7號染色體的短臂上，長度為188 307 bp，共有28個外顯子，它編碼的EGFR蛋白是一種跨膜糖蛋白，是受體酪氨酸激酶家族中重要的一員。EGFR活化后可以激活下游多條信號轉導通路，調節轉錄因子繼而激活多個基因的轉錄，參與指導細胞的遷移、黏附、增殖、分化和凋亡。EGFR基因的突變主要發生在外顯子18～21上，它們會引起EGFR下游的信號轉導通路出現異常，可導致多種腫瘤發生［14］。在肺腺癌細胞中，EGFR基因的突變可使酪氨酸激酶的活性明顯增加，從而導致肺腺癌細胞出現很多異常的生物學行為，在肺腺癌的發生發展過程中起著至關重要的作用［15-16］。因此，檢測早期肺腺癌組織中EGFR基因的突變情況，不僅可以給EGFR基因突變導致肺腺癌發生發展的機制提供直接證據，同時也為EGFR靶向治療是否可以加入到早期肺腺癌術后輔助治療提供一定的理論依據。

本研究檢測了174例早期肺腺癌（54例原位肺腺癌和120例微浸潤肺腺癌）組織中EGFR基因的突變情況，其中有102例出現了EGFR基因突變，總體突變率為58.6%，與趙靜等［17］報道的早期肺腺癌中EGFR基因的突變率（62.5%）接近。其中18、19、20、21外顯子的突變分別占4.9%、27.5%、3.0%、64.7%，突變位點主要集中在19-Del和L858R，與同類研究結果一致［18-20］。值得注意的是，4個外顯子中，檢出的全部是敏感突變，以21外顯子L858R位點突變率最高，這是因為EGFR基因突變類型在中國各地區之間存在顯著差異［21］，還是說明L858R突變在早期肺腺癌的發生發展過程中起著特別重要的作用，尚需進一步研究。此外，本研究中174例標本中均未檢出T790M突變，從另一方面也印證了T790M突變與EGFR靶向治療耐藥有關，通常在靶向治療后才出現。

通過分析EGFR基因突變與臨床病理特征的關系，我們發現女性患者中的突變率（64.2%）高于男性患者（46.3%）；無吸煙史患者的突變率（64.7%）高于有吸煙史患者（45.5%），年齡與EGFR基因的突變率無明顯相關性，這些與肺腺癌的同類研究結果一致［22-23］。

2015年世界衛生組織（WHO）病理分類系統將肺腺癌分為非典型腺瘤樣增生、原位腺癌、微浸潤腺癌以及貼壁樣生長為主的浸潤性腺癌［13］。本研究重點分析了原位肺腺癌與微浸潤肺腺癌中EGFR基因突變率的差別，發現微浸潤肺腺癌患者突變率為65.0%，高于原位肺腺癌患者（44.4%）。這說明在原位癌時期就已經發生了EGFR基因的突變，且隨著腫瘤細胞浸潤性的增加，EGFR基因的突變率明顯增加，這與趙靜等［17］的報道結論一致。但是，本研究只分析了原位和微浸潤肺腺癌中EGFR基因的突變情況，在肺腺癌的4個階段中，EGFR基因的突變率有何規律，是否是遞增的，不同階段EGFR基因的突變位點是否一致，這些問題尚需收集更全面的病理類型標本、更多大樣本研究的數據來解答。

174例早期肺腺癌中，我們發現純磨玻璃病灶（59.8%）和混雜磨玻璃病灶（63.5%）中EGFR基因的突變率高于實性病灶（20.0%），與純磨玻璃病灶相比，混雜磨玻璃病灶組織中的EGFR基因的突變率較高，但兩者的差異無統計學意義，這與日本學者Usuda等［24］和國內學者王丹云等［25］的研究結果一致。腫物長徑≥1 cm的患者中突變率為76.9%，高于腫物長徑＜1 cm的患者（43.8%），表明患者的病灶越大，EGFR基因的突變率越高，這與Sun等［26］的研究結果相似。近年來，早期肺腺癌的影像學特征受到很多關注，以后我們也會持續關注早期肺腺癌的更多影像學特征與病理分型及EGFR等驅動基因之間的關系。

本研究尚存在一定的局限性：首先，本研究采用ARMS-PCR方法，只能檢測試劑盒中包含的有限的常見的突變位點，無法檢測一些罕見突變位點，會造成數據一定程度的缺失；其次，本研究只檢測了早期肺腺癌組織中EGFR基因的突變情況，對于肺腺癌的其他驅動基因的狀態無從知曉；再次，本研究納入的病例數相對較少，且不是很均衡，納入的病理類型不是很全面，這在一定程度影響了分析結果的穩定性和結論的可信性，我們的結論還需更大樣本人群的研究數據做進一步驗證。以后我們會繼續收集各階段肺腺癌的病例，尤其是非典型腺瘤樣增生和原位肺腺癌，并結合浸潤性肺腺癌，采用測序方法檢測分析肺腺癌相關的更多驅動基因的狀態，以求揭示這些驅動基因在肺腺癌的發生發展過程中的狀態及其可能起到的作用。

綜上所述，我們發現在早期肺腺癌中EGFR基因突變常見于女性、無吸煙史、微浸潤肺腺癌、磨玻璃病灶、腫物長徑≥1 cm的患者，以21號外顯子L858R突變為主。EGFR基因突變在早期肺腺癌的發生發展過程中扮演著非常重要的角色。因此，檢測早期肺腺癌組織中EGFR基因的突變情況，不僅可以給EGFR基因突變導致肺腺癌發生發展的機制提供直接證據，同時也為早期肺腺癌術后的患者是否采用EGFR靶向治療提供一定的理論依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突