不同劑量礦質(zhì)肥對丘北辣椒根際細菌群落結(jié)構的影響

王燦，袁恩平，張雪廷，王紹祥，趙水靈，李云，李罡

（文山州農(nóng)業(yè)科學院，云南 文山 663000）

辣椒（Capsicum annuumL.）作為中國普遍栽培的蔬菜，是西南邊陲農(nóng)民增收的經(jīng)濟作物之一。辣椒適應性廣、產(chǎn)業(yè)鏈長，是日常生活中常見的蔬菜，不僅營養(yǎng)豐富而且具有較大商業(yè)開發(fā)潛力，栽培面積逐年上升。云南省作為辣椒種植大省，其中，文山州種植面積較大，占云南省辣椒種植面積的81.32%［1］，文山州特殊的地理氣候環(huán)境造就了豐富的辣椒資源，如丘北辣椒、小米辣、涮辣等。丘北辣椒有400多年的種植歷史，1983年12月被對外經(jīng)濟貿(mào)易部授予丘北辣椒金質(zhì)獎章［2］，是文山州除三七、烤煙外大力推進的產(chǎn)業(yè)，在增加農(nóng)民收入、促進農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構調(diào)整上起到了積極作用［3］。研究者常把研究聚焦于N、P、K肥施用比例對丘北辣椒生長發(fā)育的影響上，而忽略了微量礦質(zhì)元素如鈣、鎂、鐵等的作用。韓明珠等［4］通過試驗得到丘北辣椒最佳施氮量為180 kg/hm2。湛方棟等［5］研究表明肥料中N∶P2O5∶K2O為12∶10∶14的處理增加的丘北辣椒土壤微生物數(shù)量最多。

本研究以云南省文山州地方特色品種丘北辣椒為研究對象，采用16S rDNA擴增子測序，旨在從微生物群落結(jié)構多樣性角度探究礦質(zhì)肥在丘北辣椒苗期的應用規(guī)律，為云南省文山州丘北辣椒根際生長微環(huán)境及微生物群落定殖調(diào)控機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種辣椒為文干椒1號，由文山州農(nóng)業(yè)科學院提供。

1.1.2 供試材料礦質(zhì)肥料“礦物之星”由日本群馬長石公司提供，是一種天然礦物質(zhì)（石礦粉中提取）和腐殖酸復合的制劑，其主要礦質(zhì)成分見表1。育苗基質(zhì)為商品育苗基質(zhì)，‘湘正農(nóng)科’牌商品育苗基質(zhì)由湖南農(nóng)業(yè)大學湘暉農(nóng)業(yè)技術研究所研制，主要成分為草炭土。

表1 礦質(zhì)肥料主要礦質(zhì)組成成分及pH

1.2 方法

1.2.1 盆栽試驗及樣品采集試驗地點為文山州農(nóng)業(yè)科學院，時間為2020年12月至2021年5月。將發(fā)芽整齊一致的辣椒種子播種于苗盤（21孔）中進行盆栽試驗。試驗共5個處理，分別是CK處理（0 g/L）、處理A（15 g/L）、處理B（30 g/L）、處理C（45 g/L）、處理D（60 g/L）。每個處理3盤為1次生物學重復，并進行常規(guī)育苗管理。苗齡為51 d時采用五點取樣法選取植株，將植株整株拔出抖落附著土壤基質(zhì)后，用單獨無菌刷刷取粘附在根表面的土壤基質(zhì)，并將各樣品混合后放入50 mL無菌離心管中，迅速置于干冰中保存運輸，后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫S后將抖落土壤基質(zhì)收集用于土壤養(yǎng)分檢測。

1.2.2 DNA濃度檢測使用Magen核酸提取試劑盒（MagPure Soil DNA KF Kit），Equalbit dsDNA HS Assay Kit檢測DNA濃度。以30～50 ng DNA為模板，采用GENEWIZ公司設計的PCR引物擴增原核生物，16S rDNA上包括V3及V4的2個高度可變區(qū)，引物系列如下。F：5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVG AAT-3′和R：5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′。總反應體系為50 μL，5 μL Buffer，4 μL DNA模板，4 μL Mg2+，4 μL dNTP，上、下引物各1 μL，1 μLTaqDNA聚合酶，30 μL去離子水。細菌PCR反應程序為95℃預變性7 min，95℃變性60 s，56℃退火60 s，共35個循環(huán)，72℃延伸15 min，4℃保存，通過Illumina MiSeq進行雙端測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析原始數(shù)據(jù)整理采用DPS 7.05軟件。測序數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)化使用Cutadapt（v1.9.1）、Vsearch（1.9.6）、Qiime（1.9.1）軟件分析。測序數(shù)據(jù)優(yōu)化后質(zhì)量如表2所示。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理辣椒幼苗根際細菌群落結(jié)構分析

5個樣本中共同含有的OTU為130個，除處理C含1個獨有OTU外，其余處理均無獨有OTU（圖1a）。在細菌門水平下，共有10個物種種類，變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢菌，其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）。值得注意的是，在5個樣本處理中隨礦質(zhì)肥料劑量的增加，變形菌門數(shù)量占比呈下降趨勢，最高的是CK，達65.70%，最低的是處理D，為54.04%；而厚壁菌門（Firmicutes）數(shù)量則呈上升趨勢，最高的是處理D，達7.90%，最低的是處理A，為1.38%（圖1b）。在屬水平下（排名前十），CK中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）相對豐度最高，達16.01%。此外，處理C、處理D中f_Chitinophagaceae_Unclassified相對豐度分別是13.52%和10.07%，高于處理A（6.72%）、處理B（4.27%）及CK（6.13%）。芽孢桿菌屬（Bacillus）中處理C、處理D相對豐度分別是3.56%、7.38%，高于處理A（0.86%）、處理B（0.82%）及CK（1.69%）。但 在Pseudolabrys中 處 理A（4.85%）、處理B（4.61%）及CK（5.39%）高于處理C（3.73%）和處理D（3.08%）（圖1c）。圖1d顯示了基于Brary-Curtis距離矩陣聚類情況，其中處理A、處理B、CK聚為一類，處理C、處理D聚為一類。

圖1 不同處理細菌群落組成分析

2.2 不同處理辣椒幼苗根際細菌群落多樣性分析

α多樣性比較中，Ace和Chao1是反映菌群豐富度的指標，數(shù)值越小表明豐富度越低。由表3可知，處理B、處理C、處理D的Ace和Chao1指數(shù)低于處理A和CK，說明處理B、處理C、處理D的豐度低于處理A和CK。這表明礦質(zhì)肥施入量的增加降低了根際細菌群落的物種豐度。Shannon、Simpson是反映菌群多樣性的指標，其數(shù)值越小表明群落多樣性越低。處理A、處理B、處理C的Shannon和Simpson指數(shù)均高于處理D和CK，說明處理D和CK降低了其根際細菌的多樣性。

表3 不同處理細菌多樣性指數(shù)

基于Brary-Curtis距離矩陣進行PCoA作圖，分析得知第一主坐標對樣本差異的貢獻率為63.24%，第二主坐標對樣本參與的貢獻率為15.09%（圖2）。圖中樣本點距離的遠近代表了樣本中微生物群落的相似性，距離越近，相似度越高。如圖2所示，處理A與處理B較近，處理C與處理D較近，CK與其他處理較遠。說明處理A、處理B的細菌群落結(jié)構相近，處理C、處理D的細菌群落結(jié)構相近。

圖2 不同處理細菌群落PCoA分析

2.3 不同處理細菌群落與土壤基質(zhì)環(huán)境關聯(lián)性分析

對各處理土壤樣本進行檢測后發(fā)現(xiàn)，N（氮）、P（磷）、K（鉀）、Na（鈉）、Mg（鎂）、pH、EC（電導率）等化學指標隨添加劑量的增加呈上升趨勢（表4、表5）。如圖3a所示，在門水平下，變形菌門與N、Mg呈顯著負相關，與P、Na、B（硼）、Mn（錳）、EC呈極顯著負相關；厚壁菌門則與Mn、EC呈顯著正相關，與P、B呈極顯著正相關。如圖3b所示，在屬分類水平下，鞘氨醇單胞菌屬與Si（硅）呈顯著負相關；Unclassified_Unclassified與P、B呈顯著正相關；Pseudolabrys與P、K、C/N（碳氮比）、B、Ca（鈣）、Fe（鐵）、Mg、pH呈顯著負相關，與N、Na、Mn、EC呈極顯著負相關；Bacillus則與P、B呈顯著正相關。

圖3 不同處理細菌群落與土壤化學性質(zhì)的相關性分析

表4 不同處理土壤基質(zhì)化學性質(zhì)

表5 不同處理土壤基質(zhì)微量元素

3 小結(jié)與討論

土壤微生物群落與土壤質(zhì)量息息相關，是維持土壤質(zhì)量的重要因素，微生物多樣性在一定程度上可以反映土壤的肥力水平和施肥效果［6］。前期研究表明當土壤基質(zhì)中礦質(zhì)肥施用量為15～30 g/L時，育苗效果顯著高于0 g/L和45～60 g/L，可溶性糖、根系活力、土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶活性均高于其他處理［7-9］。進一步對各處理根際微生物群落高通量測序分析，結(jié)果表明，在5個樣本處理中隨礦質(zhì)肥料劑量的增加，變形菌門占比呈下降趨勢，占比最高的是0 g/L處理，達65.70%，占比最低的是60 g/L處理，為54.04%；厚壁菌門占比則呈上升趨勢，最高的是60 g/L處理，達7.90%，占比最低的是15 g/L處理，為1.38%。說明高濃度處理降低了變形菌門的豐度而提高了厚壁菌門的豐度。這與孔帆［7］的研究結(jié)果一致，長期施用高濃度肥料提高了厚壁菌門的相對豐度。在屬水平中通過對排名前十的細菌屬聚類分析表明，濃度較低的CK、處理A、處理B（0～30 g/L）聚為一類，高濃度處理C、處理D（45～60 g/L）聚為一類。這表明添加劑量的大小對辣椒根際微生物群落結(jié)構有顯著的影響。在α多樣性分析中，處理B、處理C、處理D的Ace和Chao1指數(shù)低于處理A和CK，說明在高濃度處理下根際微生物群落豐度降低，在多樣性比較中處理D的Shannon和Simpson指數(shù)低于處理A、處理B、處理C，表明對丘北辣椒施用高濃度礦質(zhì)肥降低了微生物群落的多樣性。李春越等［10］研究表明長期施用單一化肥使土壤酸堿度發(fā)生改變，對微生物的生命活動產(chǎn)生抑制作用。此外，郭振［11］研究發(fā)現(xiàn)，細菌α多樣性和β多樣性均表明不同施肥措施使細菌群落結(jié)構存在顯著差異，長期施用有機肥處理的細菌群落多樣性較為接近，而不施肥處理和單施化肥處理的細菌群落則單獨成簇。

土壤中營養(yǎng)成分、物理性狀不同可能會導致微生物群落結(jié)構差異［12］，Edwards等［13］研究指出，在控制條件下水稻根際和根內(nèi)微生物群落結(jié)構受土壤類型和宿主植物基因型的共同調(diào)控。劉東海等［14］在小麥根際微生物真菌群落中研究發(fā)現(xiàn)施有機肥可提高微生物多樣性，其原因是有機肥改變了土壤理化性質(zhì)。Dombrowski等［15］研究多年生黃花亭薺在自然和控制條件下根際細菌群落組成的因素試驗中，通過主坐標典范分析和單因素方差分析指出，土壤性質(zhì)能夠解釋根內(nèi)細菌15%的群落變異性，而環(huán)境條件和植物基因型最多解釋了11%的群落變異性，且土壤類型對根內(nèi)細菌門分類水平上的影響更加顯著。陳梅春等［16］研究發(fā)現(xiàn)茉莉花植株內(nèi)生細菌群落受土壤全氮、全鉀、全磷和有機質(zhì)含量影響，變形菌門數(shù)量與全鉀含量呈負相關，與全磷、全氮和有機質(zhì)含量呈正相關；放線菌門、擬桿菌門數(shù)量與全鉀含量呈正相關，與全磷、全氮和有機質(zhì)含量呈負相關。本試驗在前人研究基礎上分析了微量元素對辣椒根際微生物群落的影響，在處理樣本中增加礦質(zhì)肥添加量，各處理土壤基質(zhì)中礦離子含量隨之增加，微生物群落與環(huán)境因子相關性分析中，門水平下，變形菌門與N、Mg呈顯著負相關，與P、Na、B、Mn、EC呈極顯著負相關。厚壁菌門與Mn、EC呈顯著正相關，與P、B呈極顯著正相關。屬分類水平下，鞘氨醇單胞菌屬與Si呈顯著負相關；Pseudolabrys與P、K、C/N、B、Ca、Fe、Mg、pH呈顯著負相關，與N、Na、Mn、EC呈極顯著負相關；芽孢桿菌則與P、B呈顯著正相關。其中芽孢桿菌是一種革蘭陽性桿菌。研究表明，芽孢桿菌具有較強的纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等多種活性，這些酶能夠抑制或破壞周圍其他菌群的生長［17］。在真菌性病害防治中，具有抗逆性強、抗菌廣譜性、殺菌高效、代謝產(chǎn)物豐富等特點［18］。此外，芽孢桿菌在反芻動物胃腸道內(nèi)也具有調(diào)節(jié)動物腸道菌群的功能［19］。這將為發(fā)掘利用對辣椒根際有益的微生物資源，控制潛在有害微生物，保持生態(tài)系統(tǒng)平衡，促進辣椒優(yōu)質(zhì)栽培生長奠定基礎。

綜上所述，向丘北辣椒苗期施用不同劑量礦質(zhì)肥可顯著改變根際細菌群落結(jié)構，表現(xiàn)為高濃度處理降低細菌豐度與多樣性。除N、P、K、pH、EC外，微量元素對丘北辣椒根際細菌同樣存在顯著的影響，這對丘北辣椒根際細菌群落調(diào)控和肥料施用具有一定的指導意義。