基于“成分-抗氧化”關(guān)聯(lián)的不同發(fā)酵程度茶及茶飲料比較評(píng)價(jià)

王越，翟佩佩，鮑鋒，張富坤，趙盼，李佳，趙東升

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355）

茶，主要由山茶科植物茶（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）的嫩葉經(jīng)過(guò)殺青、發(fā)酵等工藝制作而成，因其清香醇厚的特質(zhì)及發(fā)揮的許多功能而深受全球人們的喜愛(ài)，并成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外食品研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一［1，2］。研究報(bào)道已經(jīng)證實(shí)了茶的各種生物學(xué)功能，如抗氧化、抗炎、抗過(guò)敏、抗微生物和抗癌以及預(yù)防心血管疾病等［3，4］。

氧自由基在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著顯著性的促進(jìn)作用［5-7］。當(dāng)人體內(nèi)的氧自由基產(chǎn)生負(fù)面影響后，會(huì)導(dǎo)致各種疾病的產(chǎn)生，可以通過(guò)攝入具有天然抗氧化功能的藥食兩用植物活性成分來(lái)增強(qiáng)抗氧化作用，輔助機(jī)體能更好地對(duì)抗疾病。茶含有多酚類、嘌呤堿、糖類、維生素和茶色素等營(yíng)養(yǎng)成分，其中主要功能性化學(xué)成分是茶多酚、咖啡堿以及茶多糖［8］。其中，茶多酚能夠高效地清除多余自由基，防止活性氧簇的形成，具有很強(qiáng)的抗氧化功能［9，10］。

茶葉根據(jù)發(fā)酵的程度不同，可以分為3大類型，即未發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶和全發(fā)酵茶。茶中主要功能性成分的組成和含量會(huì)因茶葉類型、品質(zhì)以及水溫和沖泡時(shí)間等因素呈現(xiàn)一定差異［11］。Zhang等［12］利用GC×GC-TOFMS技術(shù)與多變量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)酵程度的茶中化學(xué)成分存在顯著性差異。茶及茶飲料中所含化學(xué)成分種類較多，目前對(duì)于不同類型茶的化學(xué)成分及其抗氧化活性的研究很多，但大多研究報(bào)道集中在單一類型茶葉如綠茶［13］、普洱茶［14］的活性成分或功能以及不同類型茶葉單一活性成分或功能方面［15-17］。鑒于中藥“化學(xué)成分-生物活性”綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)的新模式［18，19］，僅通過(guò)單一類型的活性成分或生物功能作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，不能綜合系統(tǒng)地比較分析不同發(fā)酵程度的茶及茶飲料。因此，本研究基于“化學(xué)成分-抗氧化活性”關(guān)聯(lián)的研究模式，通過(guò)多元化的交叉模式將不同發(fā)酵程度茶及茶飲料的活性化學(xué)成分和抗氧化功能結(jié)合，科學(xué)地對(duì)不同發(fā)酵程度茶及茶飲料進(jìn)行對(duì)比分析［20］，以期為茶葉資源的進(jìn)一步深入開(kāi)發(fā)利用及養(yǎng)生保健茶飲料的品種選擇提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

未發(fā)酵茶（日照綠茶）、半發(fā)酵茶（鐵觀音）、全發(fā)酵茶（紅茶）、未發(fā)酵茶飲料（綠茶）、半發(fā)酵茶飲料（烏龍茶）和全發(fā)酵茶飲料（紅茶）購(gòu)自濟(jì)南市長(zhǎng)清大學(xué)城銀座超市，其中茶飲料除茶葉和水外僅添加少量維生素C和防腐劑，保持原本茶汁風(fēng)味；蘆丁（純度大于98%）、沒(méi)食子酸（純度大于98%）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；甘氨酸（純度大于98%），上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH，純度大于97%）、無(wú)水葡萄糖，阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

X-5型METASH紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Thermo Sorvall ST16R型高速低溫離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；DRHH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海程捷儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酮、多酚、游離氨基酸、多糖的提取將3種茶葉磨成粉末，過(guò)4號(hào)篩，分別精確稱取0.50 g，置于50 mL干燥離心管中，精密加入20.00 mL去離子水，密封，置于水浴（80℃）中加熱提取100 min，冷卻，離心（13 000 r/min）10 min，取上清液作為茶葉供試品溶液［21］。

1.3.2 黃酮類成分的含量測(cè)定參考文獻(xiàn)［22］報(bào)道的黃酮測(cè)定方法測(cè)定不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中黃酮類成分含量，并在其基礎(chǔ)上稍作修改。精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.50 mg，置于25 mL容量瓶中，無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶中，加水至2.5 mL，然后加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加4%氫氧化鈉溶液6.0 mL，無(wú)水乙醇定容，搖勻，放置15 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=12.172C+0.003 3（R2=0.999 1），表明蘆丁在5.00～25.00 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。精密吸取茶葉供試品溶液0.2mL、茶飲料1.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，按上述方法測(cè)定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品溶液中黃酮類成分的含量。

1.3.3 多酚類成分的含量測(cè)定參考王靜等［23］的多酚測(cè)定方法測(cè)定不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中多酚類成分含量，并在其基礎(chǔ)上稍作修改。精確稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品2.50 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL于10 mL量瓶中，加入5.0 mL的Folin-Ciocalteu試劑、4.0 mL的7.5%Na2CO3溶液，去離子水稀釋至刻度，室溫下反應(yīng)1 h，于760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=44.9C+0.012 4（R2=0.999 5），表明沒(méi)食子酸在1.00～9.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。將茶葉供試品溶液及茶飲料稀釋10倍，精密吸取茶葉供試品溶液0.1 mL、茶飲料0.4 mL，分別置于10 mL量瓶中，按上述方法測(cè)定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品溶液中多酚類成分的含量。

1.3.4 游離氨基酸類成分的含量測(cè)定參考彭真汾等［24］的游離氨基酸測(cè)定方法測(cè)定不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中游離氨基酸類成分含量，并在其基礎(chǔ)上稍作修改。精確稱取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，置于25.00 mL的容量瓶中，加適量去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.2 mg/mL的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密移取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于25 mL具塞試管中，加入磷酸緩沖液0.5 mL，茚三酮顯色劑0.5 mL，搖勻，置沸水浴中反應(yīng)15 min，取出，冷水浴冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置10 min后，以水代替標(biāo)準(zhǔn)品溶液作空白對(duì)照，于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=183.78C-0.212 2（R2=0.999 1），表明甘氨酸在1.60～5.60 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。精密吸取茶葉供試品溶液0.2 mL、茶飲料1.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，按上述方法測(cè)定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品溶液中游離氨基酸成分的含量。

1.3.5 多糖類成分的含量測(cè)定參考張媛媛等［25］的多糖測(cè)定方法測(cè)定不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中多糖類成分含量，并在其基礎(chǔ)上稍作修改。精確稱取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品2.50 mg，置于25 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.1 mg/mL的無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密移取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL量瓶中，加水至2.0 mL，再加入5 %的苯酚溶液1.0 mL，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置10 min，置于40℃水浴保溫15 min，取出后稀釋至刻度迅速冷卻到室溫，于490 nm處測(cè)得吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=71.815C+0.005 7（R2=0.999 5），表明無(wú)水葡萄糖在2.00～10.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。精密吸取茶葉供試品溶液0.1 mL、茶飲料0.4 mL，分別置于10 mL量瓶中，按上述方法測(cè)定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品溶液中多糖類成分的含量。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測(cè)定通過(guò)測(cè)定體外DPPH自由基清除率來(lái)評(píng)價(jià)茶及茶飲料的抗氧化活性［26］。精確稱取DPPH 10.00 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.10 mg/mL的DPPH溶液。分別取茶葉供試品溶液及茶飲料0.1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加入2.0 mL的DPPH溶液，無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，在室溫暗處反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai。同等條件下，對(duì)照組Aj為0.1 mL樣品和2.0 mL無(wú)水乙醇，空白組A0為0.1 mL無(wú)水乙醇和2.0 mL的DPPH溶液。測(cè)定完成后，按照如下公式計(jì)算不同濃度的茶葉供試品溶液及茶飲料對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上試驗(yàn)均平行操作3次，并計(jì)算平均值，數(shù)據(jù)以SD表示。使用GraphPad prism 6.01軟件作圖分析各類成分含量，采用SPSS 26.0和RStudio軟件進(jìn)行成分含量與抗氧化功能的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中成分含量

按亞硝酸鈉-硝酸鋁法、福林酚法、苯酚-硫酸法、茚三酮比色法分別測(cè)定3種不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中黃酮、多酚、游離氨基酸、多糖類成分的含量，結(jié)果如圖1所示。不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中黃酮類成分含量范圍分別為19.57～49.25 mg/g、0.19～0.22 mg/mL，其中未發(fā)酵茶及茶飲料中黃酮類成分的含量最高，分別為（49.25±0.78）mg/g、（0.22±0.00）mg/mL。不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中多酚類成分含量范圍分別為12.24～24.25 mg/g、0.43～0.83 mg/mL，其中含量最高的為未發(fā)酵茶及茶飲料，分別為（24.45±0.98）mg/g、（0.83±0.02）mg/mL，而全發(fā)酵茶及茶飲料中多酚類成分含量最低。不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中游離氨基酸類成分含量范圍分別為12.20～14.61 mg/g、0.05～0.07 mg/mL，含量最高的也為未發(fā)酵茶及茶飲料，分別為（14.61±0.05）mg/g、（0.07±0.00）mg/mL。不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中多糖類成分含量范圍分別為20.40～31.90 mg/g、0.15～0.19 mg/mL，而含量最高的為半發(fā)酵茶及茶飲料，分別為（31.90±0.40）mg/g、（0.19±0.01）mg/mL。

圖1 不同發(fā)酵程度茶（a）和茶飲料（b）中各類成分含量

從不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中化學(xué)成分含量變化趨勢(shì)可以看出，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，茶及茶飲料中黃酮、多酚和游離氨基酸類成分含量下降顯著，而多糖類成分卻顯著增加，這與文獻(xiàn)報(bào)道的發(fā)酵對(duì)茶中化學(xué)成分的影響結(jié)果一致［27］。茶中黃酮、多酚和游離氨基酸類成分含量分別從49.25、24.45、14.61 mg/g減少至19.57、12.24、12.20 mg/g，而多糖類成分含量卻從20.40 mg/g增加至31.90 mg/g。在茶葉發(fā)酵制作過(guò)程中，隨著發(fā)酵程度的加深，其多酚類成分呈連續(xù)顯著性降低的趨勢(shì)，游離氨基酸類成分先顯著性降低后趨于平穩(wěn)水平，黃酮類呈先降低后稍微升高的趨勢(shì)，多糖類成分呈先增加后降低的趨勢(shì)。紅茶作為全發(fā)酵茶，發(fā)酵制作過(guò)程中未經(jīng)過(guò)殺青操作，導(dǎo)致紅茶中多酚類成分發(fā)生酶促反應(yīng)而氧化成為茶黃素、茶紅素等高分子性化合物，使得多酚類成分含量大大降低［28，29］。

2.2 不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中DPPH自由基清除率

DPPH作為一種較穩(wěn)定的自由基，其紫紅色顯著特征在517 nm處具有最大吸收峰。分別測(cè)定3種不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中DPPH自由基清除率，結(jié)果如圖2所示。不同發(fā)酵程度的茶及茶飲料均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其DPPH清除率的大小順序?yàn)槲窗l(fā)酵茶＞半發(fā)酵茶＞全發(fā)酵茶，并且DPPH清除率的大小順序與多酚類成分含量的順序相一致。

圖2 不同發(fā)酵程度茶和茶飲料中DPPH自由基清除率

2.3 不同發(fā)酵程度茶及茶飲料成分含量與抗氧化功能的相關(guān)性

分析不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中各類化學(xué)成分與DPPH自由基清除率的相關(guān)性，結(jié)果如表1所示。由表1可知，不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中黃酮、多酚和游離氨基酸類成分含量都與抗氧化功能表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，表明茶及茶飲料的抗氧化功能是由黃酮、多酚和氨基酸類成分共同作用的結(jié)果。其中，多酚類成分含量均與DPPH自由基清除率呈現(xiàn)顯著性正相關(guān)（P＜0.05），這與周金偉等［30］的研究結(jié)果一致，表明多酚類成分在茶及茶飲料抗氧化功能中起著決定性作用。

表1 不發(fā)酵程度茶及茶飲料中成分含量與DPPH自由基清除率的相關(guān)性

3 小結(jié)

本研究通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)3種不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中黃酮、多酚、游離氨基酸、多糖類成分含量進(jìn)行了測(cè)定并分析其與抗氧化能力的相關(guān)性。結(jié)果表明，未發(fā)酵茶中的多酚和游離氨基酸類成分的含量最高，而發(fā)酵茶中多糖類成分含量較高，黃酮類成分含量較低。不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中黃酮、多酚和游離氨基酸類成分含量與抗氧化功能表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，說(shuō)明茶及茶飲料的抗氧化功能主要是由黃酮、多酚和氨基酸類成分共同作用的結(jié)果，其中多酚類成分在抗氧化功能中起決定性作用，此研究結(jié)果表明“成分-抗氧化”關(guān)聯(lián)的模式能夠較系統(tǒng)地對(duì)不同發(fā)酵程度茶及茶飲料進(jìn)行比較分析，并為茶葉資源的綜合開(kāi)發(fā)利用及茶飲料的品種選擇提供一定的科學(xué)參考。