食管鱗狀細(xì)胞癌組織中牙齦卟啉單胞菌感染和負(fù)性共刺激因子B7同源體4表達(dá)與患者生存的關(guān)系

孫 蔚，孫路易，劉怡文，代寧濤，楊海軍，孔金玉，郭藝博，周福有，高社干

(1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003；2.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省微生態(tài)與食管癌防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003；3.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003；4.安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院河南省食管癌精準(zhǔn)防治醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng) 455000)

食管癌的發(fā)病率及病死率極高，全世界每年新發(fā)食管癌患者約50萬(wàn)例，且一半以上發(fā)生在中國(guó)[1]。食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌中最常見的類型，約占食管癌的95%以上。ESCC患者預(yù)后極差，雖然傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療以及靶向治療、免疫治療等手段在腫瘤綜合治療中不斷發(fā)展，但中晚期ESCC患者的5 a生存率仍低于20%[2-3]。ESCC 的病因至今尚不完全明確，其危險(xiǎn)因素主要包括吸煙、飲酒、飲食、慢性感染、免疫功能紊亂及遺傳易感性等[4]。

有研究表明，多種病原微生物均可通過(guò)長(zhǎng)期定植于機(jī)體，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5-7]。清除病原微生物有助于控制腫瘤的惡性進(jìn)展，但病原微生物感染對(duì)腫瘤的作用機(jī)制目前尚不完全明確。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)為口腔條件致病菌，機(jī)體中其數(shù)量改變可引起微生態(tài)失衡。若口腔頜面部靜脈瓣膜缺如，則Pg可隨血液循環(huán)播散至全身，參與多種疾病進(jìn)程[8-10]，且與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[11-14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Pg在ESCC患者癌組織中檢出率顯著高于癌旁組織，且與患者臨床病理學(xué)特征及5 a生存期有顯著相關(guān)性[12-14]。提示Pg感染和ESCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但具體致病機(jī)制尚不明確。

有研究發(fā)現(xiàn)，多種病原微生物均能通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞負(fù)性共刺激因子高表達(dá)而逃避免疫監(jiān)視，為自身長(zhǎng)期定植提供有利條件，從而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展[14-16]。負(fù)性共刺激因子B7同源體4 (B7 homolog 4,B7H4)是新發(fā)現(xiàn)的共刺激因子家族成員，可協(xié)助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，與多種腫瘤惡性進(jìn)展呈顯著正相關(guān)[17-25]。因此，推測(cè)Pg可能通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞中B7H4高表達(dá)而促進(jìn)ESCC惡性進(jìn)展。基于此，本研究旨在探討ESCC組織中Pg感染和B7H4表達(dá)的關(guān)系及其對(duì)患者生存的影響，以期為ESCC的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2014年1月至2014年12月安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院收治的ESCC患者為研究對(duì)象，并收集手術(shù)切除的ESCC組織標(biāo)本。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為ESCC；(2)均行ESCC切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受過(guò)放射治療、化學(xué)治療和免疫治療者；(2)病歷資料不完整者。本研究共納入ESCC患者110例，其中男69例，女41例；<60歲49例，≥60歲61例；有吸煙史55例，無(wú)吸煙史55例；有飲酒史53例，無(wú)飲酒史57例；組織分化程度：低分化22例，中、高分化88例；腫瘤浸潤(rùn)深度：侵及食管壁外膜75例，未侵及食管壁外膜35例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期63例，Ⅲ、Ⅳ期47例。本研究經(jīng)安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器免疫組織化學(xué)染色試劑盒(過(guò)氧化物酶阻斷劑、山羊血清、山羊抗鼠/兔聚合物及鏈霉菌抗生物素蛋白標(biāo)記的過(guò)氧化物酶)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Pg兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)路易斯維爾大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，B7H4兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，檸檬酸抗原修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation，PBS)、吐溫-20 Tris緩沖生理鹽水(Tris-buffered saline and tween-20，TBST)、二氨基聯(lián)苯胺(diamino-benzidine，DAB)顯色劑購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)ESCC組織中Pg感染及B7H4表達(dá)情況將110份ESCC組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，切片(厚3～4 μm)；60 ℃溶蠟 1.5 h 后立即放入二甲苯脫蠟3次，每次10 min，梯度乙醇(體積分?jǐn)?shù)100%、95%、90%、85%)依次水化5 min，流水沖洗1 min；94～98 ℃下檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)15 min，充分暴露抗原，PBS沖洗；過(guò)氧化物酶阻斷劑封閉10 min，PBS沖洗；滴加正常山羊血清室溫避光封閉30 min；取2張連續(xù)切片，分別加入Pg和B7H4兔多克隆抗體(滴度1200)50 μL，4 ℃孵育過(guò)夜，次日復(fù)溫1 h，PBS沖洗；滴加山羊抗鼠和兔聚合物室溫下孵育30 min，PBS沖洗；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白標(biāo)記的過(guò)氧化物酶室溫下封閉15 min，PBS沖洗，DAB顯色。顯微鏡下觀察顯色適當(dāng)時(shí)，立即用蒸餾水終止顯色；蘇木精復(fù)染，梯度乙醇(體積分?jǐn)?shù)85%、90%、95%、100%)依次脫水1 min，二甲苯透明，風(fēng)干后中性樹膠封片。

光學(xué)顯微鏡下每個(gè)樣本隨機(jī)挑選5個(gè)視野，觀察ESCC組織中Pg感染和B7H4表達(dá)情況，以染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分的乘積作為免疫組織化學(xué)染色評(píng)分結(jié)果，以5個(gè)高倍鏡視野評(píng)分的均值為最終免疫組織化學(xué)染色評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：未著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。以癌細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為Pg感染陽(yáng)性，以癌細(xì)胞的細(xì)胞膜出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為B7H4表達(dá)陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤5%為0分， 5%<陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤25%為1分， 25%<陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤75%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比>75%為3分。Pg陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為免疫組織化學(xué)染色評(píng)分≥2分[13]；B7H4陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為免疫組織化學(xué)染色評(píng)分≥2分[14]。

1.4 隨訪通過(guò)電話聯(lián)系進(jìn)行隨訪，每3個(gè)月電話隨訪1次患者及家屬，隨訪時(shí)間為確診入院至患者死亡的時(shí)間或60個(gè)月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示,2組間生存率比較采用χ2檢驗(yàn)；2組間生存時(shí)間比較采用Log-rank檢驗(yàn)；采用Cohen′s kappa系數(shù)分析進(jìn)行Pg感染與B7H4表達(dá)一致性檢驗(yàn)，Kappa>0.7表示一致性顯著，Kappa0.4～0.7表示一致性較好，Kappa<0.4表示一致性較差；采用Kaplan-Meier法分析Pg感染及B7H4陽(yáng)性表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系，患者生存時(shí)間為入院時(shí)間至最后一次隨訪日期或死亡；采用單因素和多因素Cox回歸分析Pg感染、B7H4表達(dá)及臨床病理特征對(duì)生存的影響；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織中Pg感染和B7H4表達(dá)情況結(jié)果見圖1。在ESCC組織中，Pg感染主要分布于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，B7H4主要表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜。110例ESCC患者癌組織標(biāo)本中，Pg感染陽(yáng)性且B7H4表達(dá)陽(yáng)性33例(Pg+B7H4陽(yáng)性組)，Pg感染和B7H4表達(dá)不滿足同時(shí)陽(yáng)性77例(Pg+B7H4陰性組)。

圖1 ESCC組織中Pg感染及B7H4表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

2.2 ESCC組織中Pg感染與B7H4陽(yáng)性表達(dá)的一致性結(jié)果見表1。Cohen′s Kappa系數(shù)分析結(jié)果顯示，ESCC組織中Pg感染與B7H4陽(yáng)性表達(dá)具有顯著一致性(Kappa=0.710，P<0.05)。

表1 ESCC組織中Pg感染與B7H4陽(yáng)性表達(dá)的一致性

2.3 Pg感染及B7H4陽(yáng)性表達(dá)與ESCC患者一般臨床特征的關(guān)系結(jié)果見表2。ESCC患者Pg感染及B7H4陽(yáng)性表達(dá)與患者性別、吸煙、飲酒及腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表2 Pg感染及B7H4表達(dá)與ESCC患者一般臨床特征的相關(guān)性

2.4 Pg感染及B7H4表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系結(jié)果見圖2。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，110例ESCC患者術(shù)后5 a生存率為26.36%，中位生存期為(32.000±3.630)個(gè)月(95%置信區(qū)間：24.884～39.116)；Pg+B7H4陽(yáng)性組ESCC患者5 a生存率為12.12%，中位生存期為(19.000±5.742)個(gè)月(95%置信區(qū)間：7.746～30.254)；Pg+B7H4陰性組ESCC患者5 a生存率為32.46%，中位生存期為(38.000±5.265)個(gè)月(95%置信區(qū)間：27.682～48.318)；Pg+B7H4陽(yáng)性組ESCC患者5 a生存率及5 a中位生存期顯著低于Pg+B7H4陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.926、9.283，P<0.05)。

A：ESCC患者術(shù)后5 a 生存曲線；B:Pg+B7H4陽(yáng)性組與陰性組ESCC患者術(shù)后5 a 生存曲線。

2.5 ESCC患者生存影響因素的單因素Cox回歸分析結(jié)果見表3。110例ESCC患者成功完成術(shù)后隨訪，以ESCC組織中Pg感染且B7H4表達(dá)陽(yáng)性、性別、年齡、吸煙 、飲酒、分化程度及腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為自變量，以ESCC患者5 a生存結(jié)局為因變量進(jìn)行單因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，性別、吸煙、飲酒及腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Pg感染且B7H4表達(dá)陽(yáng)性與ESCC患者生存有關(guān)(P<0.05)。

表3 ESCC患者生存影響因素的單因素Cox回歸分析

2.6 ESCC患者生存影響因素的多因素Cox回歸分析結(jié)果見表4。將單因素Cox回歸分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素進(jìn)一步行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，腫瘤分化程度、Pg感染且B7H4表達(dá)陽(yáng)性是影響ESCC患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。

表4 ESCC患者生存影響因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

ESCC發(fā)病率及病死率較高，且早期診斷困難，預(yù)后極差。因此，尋找精準(zhǔn)的早期診斷指標(biāo)、有效的預(yù)防措施及靶向治療方法尤為重要。長(zhǎng)期以來(lái)，腫瘤相關(guān)研究中有關(guān)病原微生物慢性感染的探討較少，而實(shí)際上，多種病原微生物均可通過(guò)重塑宿主免疫微環(huán)境，在腫瘤細(xì)胞中長(zhǎng)期定植，從而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸并促進(jìn)其惡性進(jìn)展[20-25]。Pg作為毒力最強(qiáng)的口腔致病菌之一，其所釋放的內(nèi)毒素能抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，從而有利于其長(zhǎng)期定植于機(jī)體，促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌、鼻咽癌、ESCC及肺癌等多種腫瘤的惡性進(jìn)展[11-14]。

病原微生物對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的重塑機(jī)制至今尚未完全明確，多數(shù)研究認(rèn)為，病原微生物可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)負(fù)性共刺激因子，使機(jī)體抗腫瘤免疫功能降低甚至喪失[20-25]。幽門螺桿菌、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒及Epstein-Barr 病毒均可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞B7H4高表達(dá)，協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，從而有利于病原體定植于機(jī)體[20-25]。腫瘤細(xì)胞中B7H4的高表達(dá)與腫瘤惡性進(jìn)展密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞高表達(dá)B7H4的胰腺癌、胃癌及肺癌患者，其生存率及中位生存時(shí)間顯著低于癌細(xì)胞低表達(dá)B7H4的患者[17-19]；癌細(xì)胞高表達(dá)B7H4的宮頸癌與肝癌患者的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率顯著高于癌細(xì)胞低表達(dá)B7H4的患者[20-23]；癌細(xì)胞高表達(dá)B7H4的淋巴瘤患者，癌細(xì)胞增殖、侵襲能力顯著高于癌細(xì)胞低表達(dá)B7H4的患者[24]。

本研究中Cohen′s kappa系數(shù)分析結(jié)果顯示，ESCC組織中Pg感染與B7H4陽(yáng)性表達(dá)具有顯著一致性，提示Pg感染可能誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞高表達(dá)B7H4蛋白。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ESCC細(xì)胞感染Pg后，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中B7H4蛋白表達(dá)水平呈升高趨勢(shì)[14]，與本研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，ESCC患者Pg感染及B7H4陽(yáng)性表達(dá)與患者性別、吸煙、飲酒及腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)，與患者的年齡無(wú)顯著相關(guān)性；此外，單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，性別、吸煙、飲酒及腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及Pg感染且B7H4表達(dá)陽(yáng)性與ESCC患者生存有關(guān)；原因可能為長(zhǎng)期吸煙、飲酒易導(dǎo)致口腔環(huán)境惡劣，使Pg更容易感染并定植，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞高表達(dá)B7H4；中、高分化程度(惡性程度高)的ESCC組織及其微環(huán)境更利于Pg生存及高表達(dá)B7H4；Pg感染及其對(duì)B7H4的誘導(dǎo)效應(yīng)可能促進(jìn)了ESCC的惡性進(jìn)展。

本研究中Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，Pg+B7H4陽(yáng)性組ESCC患者的5 a生存率及5 a中位生存期顯著低于Pg+B7H4陰性組；此外，本研究中多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤分化程度、Pg感染且B7H4表達(dá)陽(yáng)性是影響ESCC患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明Pg感染且B7H4陽(yáng)性表達(dá)及高分化程度均不利于ESCC患者生存，原因可能為ESCC高分化程度有利于Pg在癌組織中生存，且Pg可通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞高表達(dá)B7H4抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，促使癌細(xì)胞免疫逃逸，進(jìn)一步惡化病情，從而縮短患者生存期。

因?yàn)槟[瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的演變過(guò)程，所以，Pg的具體致病機(jī)制有待進(jìn)一步探討，有效清除Pg并抑制癌細(xì)胞B7H4表達(dá)可能會(huì)延緩ESCC惡性進(jìn)展并延長(zhǎng)ESCC患者的生存期，在ESCC 的臨床治療方面具有重要的理論意義和廣泛的應(yīng)用前景。

綜上所述， ESCC組織中Pg感染與B7H4陽(yáng)性表達(dá)具有顯著一致性，Pg感染且B7H4表達(dá)陽(yáng)性可促進(jìn)ESCC的惡性進(jìn)展且不利于ESCC患者生存。