涼血通瘀方干預高血壓大鼠急性腦出血模型對腦組織中差異miRNA表達的影響＊

李薇懿，李國春，魏樂心，錢 勤，郭晴晴，楊詩錦，楊曉娟，王鵬程，陳 楊

（南京中醫(yī)藥大學公共衛(wèi)生系 南京 210023）

1 引言

腦出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）是一種發(fā)生在腦組織和腦室內血管破裂所引起的急性危重疾病，約占全部腦卒中的10%-20%，病死率約為40%[1]，居急性腦血管疾病中的病死率最高位[2]。以往的研究表明，開顱血腫清除術是限制原發(fā)性腦損傷和降低腦出血后顱內壓的有效治療方法[3-5]，然而開顱血腫清除術對患者沒有臨床益處，長期預后沒有改善，而且很少能夠影響神經功能恢復[6]。因此，探索腦出血有效的治療方法，成為亟待解決的問題。中醫(yī)藥診治中風具有悠久的歷史且形成了獨特的病因病機理論。國醫(yī)大師周仲瑛教授總結長期診治腦出血的用藥經驗獨創(chuàng)瘀熱病機理論，在經方犀角地黃湯基礎上加減化裁總結出效果顯著的中藥復方—涼血通瘀方（Liangxue Tongyu Prescription，LTP），臨床應用中取得良好療效[7]，雖然對其成分[8]、發(fā)揮抗炎及抗氧化作用[9]、減輕氧化應激[10]等方面做了諸多探索，但是涼血通瘀方治療急性腦出血的作用機制尚未明確。

miRNA 是一類長度約22-24 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，大腦是最富含miRNA的組織之一，AICH實驗模型證實miRNA 是重要的基因調節(jié)因子且與神經系統(tǒng)疾病息息相關[11]。它的主要作用是通過抑制靶基因的轉錄后翻譯或者降解其mRNA，進而負性調控動植物細胞內的基因表達[12]。然而涼血通瘀方會影響哪些miRNA 表達，以及這些miRNA 在涼血通瘀方治療急性腦出血病理過程及預后的調控機制，有待探究。

因此，本研究以自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats，SHR）雄性為實驗對象，涼血通瘀方灌胃給藥后制作急性腦出血模型并采集腦組織樣本，高通量測序得到急性腦出血大鼠腦組織中miRNA 表達變化，并對差異表達的miRNA 進行分析，包括靶基因預測、GO 功能富集分析、KEGG 信號通路的富集分析以及核心基因篩選。從miRNA 角度探討LTP 干預高血壓大鼠急性腦出血模型過程中可能的藥效機制，以期為后續(xù)LTP研究提供方向和生物信息學依據。

2 研究思路與方法

將SHR 隨機分為對照組（B）和實驗組（C），C 組灌胃給藥LTP，B 組則給予等體積生理鹽水，構建腦出血模型后收集腦組織進行高通量測序，獲得差異miRNA。首先對差異miRNA 進行靶基因預測，并對預測結果進行GO 功能分析、KEGG 通路富集和PPI 網絡分析，進而篩選與LTP 調節(jié)ICH 相關的核心miRNA。研究思路流程圖見圖1。

圖1 研究思路流程圖

3 研究與分析

3.1 實驗動物

清潔級雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）20 只，體重為230-260 g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學動物中心，用標準飼料喂養(yǎng)、自由飲水，動物房溫度（22 ± 3）℃，濕度（55% ± 5%），12 h/12 h晝夜交替，環(huán)境安靜，適應性飼養(yǎng)1周。動物實驗方案通過了南京中醫(yī)藥大學倫理委員會批準，并嚴格遵循科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規(guī)定。

3.2 實驗藥物

水牛角（批號：20170106）30 g、生地黃（批號：20161210）20 g、赤芍（批號：20170108）15 g、大黃（批號：20161201）10 g、地龍（批號：20170126）10 g、牡丹皮（批號：20151206）10 g、石菖蒲（批號：20170120）10 g、三七（批號：20151021）5 g，組方共110 g，購自于銅陵禾田中藥飲片股份有限公司。藥液制備方法：按照涼血通瘀方劑量比例稱取飲片，混合打粉置于圓底燒瓶中，加6-8 倍量水浸泡0.5 h。電熱套加熱回流提取兩次，每次約為1.5 h，收集揮發(fā)油。合并濾液，用旋轉蒸發(fā)儀（80℃）濃縮藥液，加入揮發(fā)油混勻，得到含有生藥量1.0 g·mL-1的藥液，4℃冰箱保存。

3.3 試劑及儀器

VII 型膠原酶（美國Sigma 公司，批號為BNN2146）；戊巴比妥鈉（武漢易泰科技有限公司上海分公司，批號為57-33-0）；大鼠腦立體定位儀（上海玉研儀器有限公司）；多功能開顱鉆（上海玉研儀器有限公司）；TJ-1A 型微量注射泵控制器（保定蘭格恒流泵有限公司）；微量進樣器（上海高鴿工貿有限公司）；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀（南京金正教學儀器有限公司）。

3.4 方法

3.4.1 動物分組及給藥方法

采用完全隨機化方法和SPSS22.0 軟件（IBM SPSS Statistics 22.0）把實驗動物隨機分成對照組（B）以及實驗組（C），每組10 只，隨機化分組的種子數為（20171122）。適應性飼養(yǎng)1 周后連續(xù)灌胃5 天，每天1次，C 組給予涼血通瘀方灌胃（11.55 g·kg-1），B 組灌胃等體積的生理鹽水。

3.4.2 動物造模

手術前12 h 禁食但不禁水，B 和C 組制作急性腦出血模型。腦出血模型制作順序的隨機化種子為（20121123）。參考文獻[13]方法，用新鮮配制2%的戊巴比妥鈉溶液45 mg/100 g 腹腔注射麻醉。將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，確保門齒鉤平面比耳間線平面低2.4 mm。頭部正中剃毛、碘伏消毒后切開，鈍性分離骨膜，暴露前囟點。冠狀縫前0.2 mm，前囟點右側中線向右旁開3 mm，即是右側尾狀核。手持開顱鉆穩(wěn)步鉆孔，微量進樣器抽取稀釋后的（0.05 U·L-1）VII 型膠原酶2ul，進針深度距離顱骨表面6 mm，10 min 勻速推注。留針10 min 后，緩慢勻速退出。醫(yī)用骨蠟填補鉆孔，用青霉素作為局部消炎，縫合切口并消毒。

3.4.3 樣本收集

冷凍管液氮中預冷，術后12 h 迅速取出腦組織，用無酶水快速清洗腦組織表面并吸干液體，收集出血點周圍腦組織約50-100 mg 左右小塊，保存至預冷后的冷凍管，液氮速凍后并保存在-80℃冰箱，B 和C 組分別選取3個腦組織進行高通量測序。

3.4.4 上機測序

從腦組織樣本中提取總RNA，并借助Nanodrop2000 對所提RNA 的濃度和純度進行檢測。起始時取5 μL 總RNA，濃度≥250 ng·mL-1，OD260/280介于1.8 和2.2 之間。去除核糖體RNA，根據說明書使用TruSeqTM 總RNA 庫制備試劑盒（IIIumina）從純化的RNA 中制備索引文庫，利用金屬離子，將RNA 隨機斷裂成200 bp 左右的小片段；依次為模板反轉錄合成cDNA，將反轉錄獲得的cDNA 進行PCR 擴增，采用IIIumina Hiseq 4500測序平臺進行測序。

3.4.5 miRNA靶基因預測

使用miRBase 數據庫序列比對獲得已知miRNA，使用miRDeep2 預測新miRNA。使用miRDeep2 軟件對各樣本中miRNA 的表達水平進行定量分析；使用基于負二項分布的DESeq2 軟件對read counts 進行統(tǒng)計分析，基于一定的標準化處理和篩選條件獲得比較組間表達差異的miRNA，默認參數：p-adjust ＜0.05 且|log2FC| ＞= 1，篩選差異表達顯著的miRNA。本分析利用動物專用的靶基因預測軟件miRanda（http://www.miranda.org/）對所有已知及新預測的miRNA 進行靶基因預測。

3.4.6 差異miRNA靶基因功能富集分析

采用軟件Goatools（https://github.com/tanghaibao/GOatools）對基因集中的miRNA 靶基因進行GO 富集分析。利用GO 數據庫，可以對基因和基因產物按照其參與的生物學過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）及 細 胞 組 分（Cellular Component，CC）三個方面進行功能分類注釋。通常情況下P 值（p-value）＜0.05 時，認為此GO 功能存在富集。

采用R 語言工具包clusterProfiler 工具包[14]。對基因集中的miRNA 靶基因進行KEGG Pathway 富集分析，預測miRNA 靶基因影響的信號通路。默認當P值＜0.05 時，認為此KEGG 通路存在顯著富集情況，按照輸入靶基因個數作圖及分析。

3.4.7 核心靶基因篩選

把1243 個靶基因輸入STRING（https://string-db.org/cgi/），靶基因間相互作用分數（minimum required interaction score）＞=0.900（最 高 置 信 區(qū) 間，highest confidence），PPI 富集p-value＜0.05。運用Cytoscape 軟件的cytoHubba 插件從靶基因中用Maximal Clique Centrality（MCC）算法篩選出前10 名的關鍵靶基因，以作后續(xù)分析。

3.5 結果

3.5.1 涼血通瘀方治療急性腦出血大鼠腦組織顯著差異表達的miRNA

與對照組比較，共有21 個表達有顯著差異的miRNA，結果如表1 所示，其中上調表達的miRNA 有9個，下調表達的有12個。

表1 涼血通瘀方治療腦出血急性期大鼠腦組織顯著差異表達的miRNA

3.5.2 顯著差異miRNA靶基因預測結果

通過miRanda 軟件預測21 個表達有顯著差異的miRNA 靶基因，得到1243 個有統(tǒng)計學意義的靶基因，選取靶基因前5名其結果如表2所示。

表2 涼血通瘀方治療急性腦出血顯著差異miRNA的靶基因預測

3.5.3 GO功能分析結果

采用軟件Goatools對基因集中的miRNA靶基因進行GO 功能富集分析，將得到的分子功能、生物過程和細胞組分注釋結果，按照P值從大到小排列，如圖2 所示。圖中按富集程度列出排名靠前的30個分類項，分析顯示：多數顯著差異表達的miRNA 靶基因功能主要參與突觸囊泡分泌的調節(jié)（regulation of synaptic vesicle exocytosis）、神經遞質分泌的調節(jié)（regulation of neurotransmitter secretion）和神經遞質運輸的調節(jié)（regulation of neurotransmitter transport）生物過程；主要作為細胞內神經元投射終點（neuron projection terminus）、全膜（whole membrane）、質膜區(qū)域（plasma membrane region）和細胞投射（cell projection part）；主要行使小GTPase 綁定（small GTPase binding）、底物特異性跨膜轉運蛋白活性（substrate-specific transmembrane transporter activity）和離子跨膜轉運體活性（ion transmembrane transporter activity）等分子功能。

圖2 miRNA靶基因GO功能分析圖

3.5.4 miRNA靶基因KEGG通路富集分析

1243個表達上有顯著差異的miRNA靶基因，通過KEGG 通路的富集分析得到顯著差異的富集通路結果如圖3 所示。這些差異miRNA 的靶基因在癌證通路（Pathways in cancer）、pI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、人類乳頭瘤病毒感染（Human papillomavirus infection）、神經活性配體-受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）和MAPK 通路（MAPK signaling pathway）等分布廣泛。

圖3 miRNA靶基因KEGG富集通路圖

3.5.5 核心靶基因篩選結果

把1243 個靶基因輸入STRING 數據庫，靶基因相互作用分數最低為0.900，篩選得到439 個點，359 條線，PPI 富集p-value 為0.0072。運用Cytoscape 軟件的cytoHubba 插件從439 個靶基因中用MCC 算法篩選出前10 名的關鍵靶基因，ADRA2C（rno-miR-133b-3p、rno-miR-204-5p 和rno-miR-204-3p）、CASR（rnomiR-204-3p）、CCL28（16_34601）、CCR1（rno-miR-204-5p）、DRD2（rno-miR-204-3p）、GNAT3（rno-miR-34a-3p）、GRM2（16_34601）、DYNC1LI1（rno-miR-204-3p）、GABBR1（rno-miR-200a-3p、rno-miR-204-3p）、GNAI3（rno-miR-200b-3p），結果展示如下圖4。

圖4 PPI蛋白網絡互作圖

4 討論

miRNA 是生理和病理過程的重要調節(jié)器，并影響各種疾病[15-16]。而且，miRNA 網絡涉及各種過程，包括中樞和周圍神經病變的再生、軸突再生、神經細胞分化和慢性疼痛[17-19]。不斷有研究揭示腦出血miRNA表達譜發(fā)生改變并在一系列繼發(fā)損傷中扮演著重要的角色[20]，并廣泛參與腦出血后的氧化損傷、炎癥等病理生理過程。Iwuchukwu 等[21]通過檢測ICH 確診患者腦脊液中的miRNA 表達譜，發(fā)現211 個差異表達miRNA，其中miR-204-5p 高表達與我們的研究結果一致。本研究中，通過實驗組和對照組的比較，涼血通瘀方實驗組引起21 個miRNAs 的顯著表達變化，其中9 個表達下調，12 個表達上調。顯著差異表達的21個miRNA 一共預測得到了1243 個靶基因。對靶基因進行GO 和KEGG 富集分析，其中GO 功能分析結果顯示，主要參與突觸囊泡分泌的調節(jié)、主要作為細胞內神經元投射端、主要行使小GTPase綁定等功能。通過KEGG 分析，這些差異miRNA 的靶基因主要參與了癌證通路、pI3K-Akt 信號通路、人類乳頭瘤病毒感染和MAPK 通路等信號通路。其中的核心的靶基因為Adra2c、Casr、Ccl28、Ccr1、Drd2、Gnat3、Grm2、Dync1li1、Gabbr1、Gnai3，上述10 個基因對于涼血通瘀方干預急性腦出血有著顯著相關性。

腦出血后多巴胺D2 受體（DRD2）表達增加，DRD2 可能在ICH 后具有抗炎作用，DRD2 激動劑具有減輕ICH 后神經炎癥和減輕繼發(fā)性腦損傷的潛力[22]。先前的研究表明DRD2 激動劑具有抗凋亡特性[23]，并且可能參與神經發(fā)生和血管生成[24]。另外，DRD2 區(qū)域對于收縮壓調節(jié)具有顯著相關性，多巴胺功能系統(tǒng)對于調節(jié)血壓具有重要作用[25-26]。多巴胺缺失會導致受體依賴性的高血壓，并且有報告顯示DRD2 基因缺失的小鼠具有活性氧（ROS）依賴性高血壓[27]，而大量研究表明高血壓是腦出血的主要危險因素[28]。有趣的是，在一篇研究卒中后基因表達內在變化的研究中卻發(fā)現DRD2基因表達與腦卒中小鼠的行為恢復呈負相關[29]。本研究的前期探索中發(fā)現，與模型組相比較，LTP能夠改善SHR大鼠神經功能評分。

ADRA2C 是腎上腺素受體-α2（ADRA2）基因的一種亞型，ADRA2 基因家族具有多種血管功能，包括維持基礎腦血流、腦血管舒張、血管完整性和血管平滑肌細胞的正常功能[30-33]。其中，ADRA2C的D等位基因可能與血流量或血管功能相關[34]，在血管中發(fā)現了高水平的α2-AR 活性，這些受體作為溫度受體來介導寒冷誘導的血管收縮，α2-AR 刺激引起血管平滑肌細胞中的鈣動員，參與血管的收縮和舒張，影響血壓[35]，ADRA2C多態(tài)性可能與高血壓或腦血流呈正相關。

G 蛋白偶聯鈣敏感受體CaSR 被認為是多種細胞功能的重要調節(jié)劑，在腦缺血急性期，CaSR 在缺血及邊緣區(qū)表達增加，6 小時再灌注后至三天時間梗死區(qū)的星形膠質細胞中表達明顯增加，這種表達一直持續(xù)到14 天[36]，而在大量浸潤的小膠質細胞或（和）巨噬細胞中卻難以發(fā)現CaRS 的標記。而CaSR 的上調主要影響血管相關細胞如周細胞和內皮細胞，這種現象說明CaRS 可能在腦卒中中發(fā)揮著血管重塑和星形膠質細胞增生[36]。并且腦損傷后新血管形成對內源性修復過程具有重要的作用[37-38]，而對血管生成反應的阻斷會使腦卒中后的結局惡化[39]。星形膠質細胞有助于血管生成、神經發(fā)生、突觸形成和軸突重塑，從而促進神經系統(tǒng)的恢復，是腦卒中神經保護和神經修復的治療靶點[40]。

Grm2 與mGlu 受體具有相關性，Grm2 啟動子H3蛋白組乙?；瘻p少會導致mGlu 受體的減少；而mGlu在卒中中激活會擴大神經元的死亡，這也是腦出血中興奮性氨基酸如mGlu 帶來的興奮性神經毒性導致的神經損傷[41]。mGlu2 是8 個mGlu 受體亞型之一，在缺血型腦卒中研究中，敲除小鼠mGlu2 基因會顯著減少梗死面積，使用mGlu2 受體的阻斷藥物后發(fā)現了神經損傷緩解的現象[42]。我們推測，Grm2 可能通過減少mGlu受體從而抑制mGlu或者其受體導致的腦卒中后神經損傷。

腦缺血可增加CaSR 表達和信號傳導，從而下調GABABR1 表達，降低GABA 信號傳導響應；降低的GABABR1 表達進一步增加了CaSR 表達和活性，引發(fā)了維持神經元過度活躍的前饋反應，這些持續(xù)的細胞反應最終導致永久性神經元損傷和細胞死亡，并導致神經變性和學習，記憶，認知或運動障礙[43]。切除Casr基因或通過鈣蛋白酶抑制劑阻斷Casr 活性在缺血小鼠中提供了強大的神經保護及保留學習和記憶功能，說明CaSR 的過度表達和過度活躍能關鍵地介導神經元的損傷反應，并且阻斷CaSR 的表達或活性可以有效保護神經元免受缺血引起的細胞死亡[43]。

涼血通瘀方中主要的活性成分為槲皮素、山柰酚和大黃素等[44]。其中槲皮素可降低血壓，增強毛細血管抵抗力并降低毛細血管脆性。槲皮素的結合自由能（8.8 kcal·mol-1）與布瑞哌唑（brexpiprazole）的結合自由能（9.5 kcal·mol-1）相似，該藥物已顯示與DRD2[45]結合。有研究[46]報道了槲皮素、山奈酚這些成分主要通過cAMP 信號通路（cAMP signaling pathways）發(fā)揮其治療作用，分子對接驗證了DRD2作為槲皮素、山奈酚等活性成分的重要靶點。另外，不同劑量的槲皮素治療對CCR1 的巨噬細胞表達有差異[47]。大黃素下調CaSR 表達，并通過調節(jié)其下游的線粒體和MAPK 信號通路來抑制細胞凋亡[48]。大黃素和大黃酸也可以抑制CCR1 的表達、TNF-α 和IL-6 的產生，p38 MAPK 和NF-κB的激活[49]。說明涼血通瘀方中活性成分對核心靶基因有潛在調控可能。

在以往的研究中，涼血通瘀方干預腦出血的發(fā)生與發(fā)展機制中鮮有涉及miRNA 的探索，本次篩選出的10個核心miRNA靶基因中多集中在腦缺血中，多與腦缺血發(fā)生發(fā)展及保護作用相關，腦出血與腦缺血在部分機制上具有相關性。但對于腦出血的作用機理的解釋仍不充分。如Grm2 和CaSR 都介導了卒中后神經元凋亡的相關機制，而這些基因對于腦出血的作用都需要進一步的驗證才可以確定其相關作用。

5 結論

本次研究通過高通量測序的廣篩，找到了10個與涼血通瘀方治療腦出血的核心基因縮小了LTP 網絡藥理學靶點范圍，為進一步藥效機制探索指明方向。關于它們在LTP 干預急性腦出血病理進程及預后的調控機制，或許需要更多的體內體外研究來證實其具體機制。