Notch1、Wnt3在胃癌組織中表達及臨床意義

羅 渟， 賈 雯， 高 峰， 王 靜

北部戰區總醫院 內窺鏡科，遼寧 沈陽 110013

胃癌是癌癥相關死亡的第三大常見原因，診斷晚，病死率高[1]。Notch1屬于Notch受體家族，是多細胞生物固有的一種進化保守的信號通路，在胚胎發生和組織穩態中起著至關重要的作用[2-3]。有研究表明，Notch1在胃癌的發展中起重要作用[4]。Wnt蛋白是一種分泌型生長因子，在多細胞動物的胚胎發育和成年組織穩態期間調節干細胞和祖細胞的增殖、分化[5-6]。有研究表明，高水平的非對稱性二甲基精氨酸可正向調控胃癌中β-catenin的表達，并通過Wnt/β-catenin通路促進胃癌遷移、侵襲[7]。Wnt3的上調通過誘導癌細胞增殖、遷移、侵襲和抑制凋亡在胃癌發生中起重要作用，Wnt3可能是胃癌治療的有利突破點[8]。本研究旨在探討胃癌組織中Notch1、Wnt3的表達情況及臨床意義。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2015—2020年北部戰區總醫院收治的36例胃腺癌患者為研究對象。其中，女性10例，男性26例；年齡32～88歲，中位年齡63歲。術中取36例患者的胃癌組織及26例患者的癌旁正常組織，離體后經甲醛固定、石蠟包埋，-80℃冷凍備用。本研究經醫院倫理委員會批準。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 組織芯片制作 由一名經驗豐富的病理專家挑選典型的癌與癌旁組織蠟塊，觀察并根據切片確定具有代表性的病變部位，加以標記制作空白蠟塊，應用組織微陣列儀在蠟塊中打孔(孔徑1 mm，長4 mm)，然后在選取的蠟塊中穿取標記組織直徑，準確放入空白蠟塊的小孔中按照順序依次操作，直至所有組織標本種植于空白蠟塊中，最后石蠟切片，低溫保存。

1.3 免疫組化

1.3.1 主要試劑 兔抗人Notch1單克隆抗體(北京中杉生物技術有限公司)，兔抗人Wnt3單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，濃度均為1∶100；SP兩步法免疫組織化學檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；蘇木精(北京中杉生物技術有限公司)。

1.3.2 實驗方法 石蠟切片常規脫蠟至水，PBS洗液沖洗3次，每次3 min。用濃度為0.3%的過氧化氫溶液在室溫條件下抑制內源性過氧化物20 min，再以PBS洗液沖洗3次，每次3 min。分別選取Notch1、Wnt3的對應多克隆抗體，工作濃度為1∶100，在37℃條件下培育1 h，再用PBS洗液沖洗3次，每次3 min。再以實驗配套試劑在37℃條件下培育30 min，清洗3次，使用DAB顯色10 min，然后以蘇木素襯染，熱水藍化。吹干后，以樹脂進行封片處理，最后在鏡下觀察。用已知標準的Notch1和Wnt3表達陽性的正常胃組織標本作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照，顯微鏡下觀察。

1.4 結果判定 根據半定量標準：取染色良好切片，顯微鏡100倍視野下隨機選取10個視野。染色結果取染色強度(0：無染色，1：輕度，2：中度，3：高度)和染色范圍(0為1%～10%；1為10%～25%；2為25%～50%；3為50%～75%；4為>75%)乘積，按0～12分為4個等級，0得0分，1～4得1分，5～8得2分，9～12得3分[9]。兩項評分乘積≥3為陽性表達，乘積<3為陰性表達。

1.5 統計學方法 采用SPSS 25.0統計學軟件處理數據。計數資料以例(百分率)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。相關性分析采用Spearman等級相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與正常組織Notch1、Wnt3表達 胃癌組織中Notch1陽性率為33.3%(12/36)，低于正常組織的76.9%(20/26)，差異有統計學意義(P<0.05)。胃癌組織中Wnt3陽性率為83.3%(30/36)，高于正常組織的46.1%(12/26)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 胃癌組織Notch1、Wnt3表達與臨床病理參數相關性 Notch1、Wnt3表達與胃癌患者的性別、年齡、TNM分期、有無淋巴結轉移均無相關性(P>0.05)。Notch1、Wnt3表達與胃癌的分化程度、浸潤深度、有無脈管浸潤均有相關性(P<0.05)。見表1。

表1 Notch1、Wnt3表達與胃癌臨床病理參數的關系

2.3 Notch1、Wnt3在胃癌組織中表達相關性 Notch1和Wnt3共同陽性者7例，共同陰性者1例，Notch1陽性而Wnt3陰性者5例，Notch1陰性而Wnt3陽性者23例。Spearman相關性分析顯示，在胃癌組織中，Notch1和Wnt3表達呈負相關(r=-0.474，P<0.05)。

3 討論

Notch1是Notch家族成員之一，與乳腺癌[10]、白血病[15]、膠質瘤[12]、口腔鱗狀細胞癌[13]等多種癌癥有關。一項薈萃分析中的分層分析顯示，Notch1表達升高與腫瘤部位、大小、類型、淋巴血管侵襲和遠端轉移有關[4]。Notch1信號通路是進化保守的細胞相互作用的一種機制，參與胚胎發育和正常細胞的增殖、分化、生存和凋亡等過程[14]。Notch1在胃癌組織中表達升高，并與胃癌淋巴結轉移相關，在胃癌細胞系中敲除Notch1可以減弱腫瘤細胞的增殖、遷移并阻滯細胞周期[15-16]。有研究表明，Notch信號通路是維持胃竇干細胞生長的必要因素，Notch1是調節小鼠和人胃上皮細胞穩態的主要Notch受體之一[17]。緩慢激活胃干細胞的Notch通路可誘導細胞增生和組織肥大，提示Notch可能驅動胃癌的發生[18]。

本研究采用免疫組織化學染色方法檢測胃癌組織中Notch1的表達情況，發現Notch1在胃癌組織中的陽性表達率低于癌旁組織。有研究認為，Notch1在胃癌的發生中可能起抑制作用[19-20]。Ye等[21]研究表明，Notch1在不同的細胞中激活的下游信號轉導通路也不同，Notch1可能在胃癌中發揮抑制作用。

本研究發現，Wnt3在胃癌中的陽性表達率高于癌旁組織，提示Wnt3可能參與調控胃癌的浸潤、遷移。Wnt是作用于細胞增殖、凋亡、分化和遷移等多種過程的一種分泌型脂質修飾糖蛋白家族[22]。Wnt3是轉化生長因子誘導的間充質癌細胞分泌的促進上皮癌細胞侵襲并誘導繼發性EMT表型的關鍵因子，揭示了腫瘤異質性的重要意義，以及腫瘤微環境中上皮和間質轉化的癌細胞之間的相互作用，通過Wnt依賴的機制促進疾病轉移[23]。

相關性分析發現，Notch1與Wnt3在胃癌組織中表達呈負相關。從臨床病理角度分析，Notch1與Wnt3在高分化、不伴脈管浸潤、漿膜未侵犯的胃癌組織中分別高表達和低表達，提示Notch1、Wnt3的表達可能與胃癌患者的預后相關。但在不同組織中，Notch對細胞發生發展的作用有所不同，即使是在同一組織的腫瘤，因為發展階段的不同，Notch的作用也會發生變化[20]。本研究結果顯示，Notch1在胃癌發展中起抑制作用，而Wnt3則起促進作用，與既往多數研究結果存在差異，可能是Notch1作為腫瘤抑制基因還是致癌基因取決于癌癥的類型、階段和其他相關基因的突變。

綜上所述，Notch1在胃癌發展中可能起抑制作用，而Wnt3則起促進作用，Notch1與Wnt3的表達水平呈負相關。本研究存在不足，樣本量較小可能導致結果不準確，需要進一步擴大樣本深入研究。