玉簪多糖對細胞氧化應激損傷的保護作用機制

吳金姍，黃 榕，劉樹英，劉回民,*，劉洪章,*，劉景圣

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118）

氧化應激是指機體內氧化失衡的狀態，亦是肝損傷發生的主要誘因。氧化應激現象發生時，產生過量的氧自由基會對細胞造成破壞，導致氧化應激損傷。研究表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）是氧正常代謝過程中的產物，也是誘發氧化應激的重要物質，過多的ROS能夠影響基因組的穩定性，導致多種慢性疾病發生。肝臟疾病發生時，患者體內抗氧化狀態失衡，抗氧化酶的表達量減少，ROS水平增高。Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）/核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）是機體內的抗氧化信號通路，能夠誘導抗氧化蛋白的表達，降低機體ROS水平，因此，調節Keap1/Nrf2/ARE信號通路能夠減輕氧化應激損傷。

研究證明植物多糖具有良好的抗氧化能力。體外抗氧化實驗表明，山藥多糖、山茱萸籽多糖、百合籽多糖和黃精多糖具有較強的自由基清除活性；體內抗氧化機制研究表明，竹蓀多糖能夠改善高脂乳糜誘導的肥胖小鼠肝臟氧化應激水平并緩解肥胖相關性肝腎代謝損傷，黑木耳渣多糖能通過提高體內抗氧化酶活性、降低脂質含量起到抗氧化和降脂保肝的作用。相比于合成類抗氧化劑的毒副作用和不穩定性，植物多糖不僅毒副作用小，還具有較強的抗氧化能力，因此，近年來植物多糖的生理活性受到廣泛關注。

紫萼玉簪又名紫花玉簪，為百合科（Liliacea）玉簪屬（）多年生宿根草本植物，其全草或根均可入藥，具有可食用性。目前已有研究證實玉簪中黃酮、皂苷和多糖等成分具有一定的抗炎抑菌活性，但鮮有關于紫萼玉簪根系多糖（root polysaccharide，HVRP）的抗氧化機制研究。本實驗旨在探尋HVRP對叔丁基過氧化氫（-butyl hydroperoxide，-BHP）誘導的HepG2細胞氧化應激損傷的影響，在細胞水平解析HVRP的抗氧化作用機制，為HVRP在功能性食品領域的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫萼玉簪根系于2017年8月采于吉林農業大學校內；HepG2細胞（肝癌細胞） 美國模式培養物集存庫。

-BHP 美國Sigma公司；噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）北京博奧拓達科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 以色列BI公司；DMEM培養基、TRIzol試劑 美國Thermo公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力檢測試劑盒、羥自由基清除能力檢測試劑盒、超氧陰離子自由基清除能力檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；-乙酰半胱甘酸（-acetyl--cysteine，NAC）、ROS試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；PrimeScriptRT-PCR試劑盒 日本TaKaRa公司；Nrf2、NAD(P)H∶醌氧化還原酶1（NAD(P)H∶quinone oxidoreductase 1，NQO1）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化JNK（phosphorylation JNK，p-JNK）、-actin、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（H+L）抗體 北京博奧森生物技術有限公司；溴化鉀（KBr）（色譜純）國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀 上海實驗儀器廠有限公司；二氧化碳培養箱 日本Sanyo公司；紫外-可見分光光度計 美國Thermo公司；全自動酶標儀德國BGM LABTECH公司；Mx3000p實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Agilent公司；ImageQuant LAS 500生物分子成像儀美國GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 HVRP的提取

取洗凈的紫萼玉簪根系，用粉粹機粉碎，過60 目篩，采用索氏抽提法脫脂，自然晾干，按一定料液比置于熱水中浸提一段時間，抽濾后合并濾液濃縮，用體積分數75%乙醇溶液醇沉，隨后冷凍干燥醇沉樣品。采用三氯乙酸法稍加修改脫除蛋白，即取醇沉后凍干多糖加適量水溶解，加入等體積的質量分數16%三氯乙酸溶液混合，80 ℃水浴36 min，經透析、旋轉蒸發并冷凍干燥得到淺棕色多糖，即為HVRP。

1.3.2 HVRP提取率測定

以葡萄糖作為標準品，采用苯酚-硫酸法測定多糖的質量濃度，根據公式（1）計算提取率。

式中：為多糖質量濃度/（mg/mL）；為樣品液稀釋倍數；為樣品液體積/mL；為樣品質量/g。

1.3.3 單因素試驗

采用傳統水提法提取HVRP，提取率主要影響因素有料液比、提取時間和提取溫度，將上述因素進行單因素試驗。設定料液比1∶30、提取時間2 h、提取溫度80 ℃為單因素試驗中的常規量。以料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）、提取時間（1、2、3、4、5 h）和提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）3 個因素變量替換試驗中的常規量。按照1.3.1節方法提取HVRP，分別分析料液比、提取時間和提取溫度對多糖提取率的影響。

1.3.4 響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，選取提取溫度（）、提取時間（）、料液比（）3 個因素，以HVRP提取率作為響應值，進行響應面優化試驗設計，試驗變量的因素與水平如表1所示。

表1 響應面試驗設計因素水平Table 1 Codes and levels of independent variables used for response surface desgin

1.3.5 理化指標測定

采用二硝基水楊酸法測定HVRP還原糖質量分數，回歸方程為＝0.001-0.044 8，＝0.994 6。采用硫酸-間羥聯苯法測定HVRP糖醛酸質量分數，回歸方程為＝0.018+0.007，＝0.995 4。采用考馬斯亮藍法對HVRP蛋白質量分數進行測定，回歸方程為＝0.007 1+0.027，＝0.995 1。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將干燥的HVRP樣品與KBr混合研磨后壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀進行紅外光譜測定，掃描范圍400～4 000 cm，分辨率為2 cm，分析HVRP的有機官能團。

1.3.7 剛果紅染色實驗

取100 μL（1 mg/mL）HVRP溶液與100 μL利用不同濃度NaOH溶液溶解的剛果紅溶液（80 μmol/L）混合加入96 孔板中，在200～700 nm范圍內，利用紫外-可見分光光度計掃描測定溶液的最大吸收波長。

1.3.8 抗氧化活性的測定

參照相應試劑盒說明書測定并計算HVRP對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率。

1.3.9 HVRP對-BHP誘導HepG2細胞氧化應激損傷的保護作用分析

1.3.9.1 細胞培養和分組

HepG2細胞接種于完全培養基（含10% FBS+1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養基）中，在37 ℃、5% CO培養箱內進行培養，定期更換培養基，至對數生長期用于后續實驗。

取對數生長期的HepG2細胞，調整濃度至1×10個/mL，以每孔2 mL接種于6 孔板，實驗分為正常組、模型組、陽性對照組和5、25、100 μg/mL HVRP組（即HV5、HV25、HV100組）。正常組常規培養；模型組加入終濃度為220 μmol/L的-BHP溶液培養細胞2 h，建立氧化損傷模型；陽性對照組和HVRP組先分別使用含100 μg/mL NAC和5、25、100 μg/mL HVRP的培養液培養24 h，再用含終濃度220 μmol/L-BHP的培養液刺激細胞2 h。

1.3.9.2 MTT法測定HepG2細胞存活率

HVRP對細胞存活率的影響分析：將HVRP分別稀釋至0（空白組）、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL。調整HepG2細胞懸液濃度至1×10個/mL，以每孔100 μL接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO培養箱中培養48 h。每孔再加入100 μL不同質量濃度的HVRP溶液，培養48 h后，進行MTT染色，測定570 nm波長處吸光度。按式（2）計算細胞相對存活率。以細胞相對存活率表征細胞活力。

式中：為空白組吸光度平均值；為給藥組吸光度平均值。

-BHP對細胞存活率的影響分析：按上述方法處理HepG2細胞，每孔加入100 μL不同濃度（0、100、200、300、400、500、600 μmol/L）的-BHP溶液刺激細胞，培養2 h后測定570 nm波長處的吸光度。按式（2）計算細胞相對存活率。

1.3.9.3 HepG2細胞中ROS水平及抗氧化酶活力的測定

參照試劑盒說明書測定細胞上清液中ROS相對水平，MDA、GSH含量及CAT、SOD、GPx活力，除ROS水平外，以上指標結果均以蛋白質量計。

1.3.9.4 RNA提取與實時熒光定量PCR

用TRIzon試劑從HepG2細胞中提取總RNA，用PrimeScriptRT-PCR試劑盒合成cDNA，利用實時熒光定量PCR檢測系統定量，分析HVRP對Keap1/Nrf2/ARE通路和HepG2細胞相關基因mRNA表達的影響。具體引物序列如表2所示。基因相對表達量利用2法計算。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences used in this study

1.3.9.5 蛋白質免疫印跡分析

提取胞漿蛋白及核蛋白，用BCA蛋白濃度試劑盒定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離后轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用含5% BSA的TBST緩沖液（三乙醇胺緩沖鹽水溶液（Tris buffered saline，TBS）+Tween 20）封閉過夜，室溫孵育一抗2 h，用TBST緩沖液清洗5 次，然后在室溫下孵育二抗2 h，用TBST緩沖液清洗5 次后滴加增強型化學發光（enhanced chemiluminesce，ECL）試劑，使用生物分子成像儀和ImageJ軟件對結果進行灰度分析。

1.4 數據統計與分析

所有實驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示。采用Design-Expert V 10.0.7.0軟件進行響應面試驗設計與數據處理。用GraphPad Prism 7.0軟件作圖，SPSS 23軟件進行數據分析，多組間比較采用單因素方差分析，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

料液比、提取溫度和提取時間對多糖提取率的影響如圖1所示，當料液比為1∶30時，提取率達到最大；隨提取溫度的升高，提取率先增加后下降，80 ℃時提取率達到最大；隨提取時間延長，提取率先增加后下降，在2 h時提取率最大。當提取溫度超過80 ℃、時間超過2 h時，多糖受到持續高溫的影響會分解，從而導致提取率降低。

圖1 料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）對HVRP提取率的影響Fig. 1 Effects of material-to-solvent ratio (A), extraction temperature (B), and extraction time (C) on the extraction efficiency of HVRP

2.2 響應面優化試驗分析結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果分析

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

根據表3的結果，利用Design-Expert軟件對試驗數據進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸模型方程：＝24.44+1.21+0.46+0.55+1.35-2.77+0.78-3.15-0.55-2.12。

表4 回歸模型方差分析結果Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model

2.2.2 最佳提取工藝的確定及驗證

模型分析HVRP最佳提取工藝條件為提取溫度83.63 ℃、提取時間2.92 h、料液比1∶30.60，預測提取率24.9%。根據實際情況調整工藝為提取溫度84 ℃、提取時間3 h、料液比1∶31，HVRP提取率為23.9%，誤差1%，表明該模型可行性較高。

2.3 HVRP理化性質

經脫脂、脫蛋白處理后HVRP提取率為9.29%。測得HVRP中還原性糖的質量分數為11.17%（111.66 mg/g），蛋白質量分數為0.6%（5.96 mg/g），糖醛酸含量較高，質量分數為12.31%（123.12 mg/g）。研究表明，利用咔唑法測定東北玉簪多糖中的糖醛酸質量分數為20.36%～52.76%；百合多糖中糖醛酸質量分數達12.89%。

2.4 HVRP結構特征分析結果

由圖2A可知，HVRP的紅外光譜在3 422 cm處有1 個強吸收峰，是由O—H伸縮振動引起的；2 916 cm處吸收峰為C—H伸縮振動；1 745、1 634、1 446 cm處吸收峰為C＝O對稱和不對稱拉伸振動引起，表明HVRP中存在糖醛酸，與理化分析結果一致；1 088 cm處的吸收峰為吡喃環的醚鍵所引起，表明HVRP可能為吡喃糖；813、614 cm處的吸收峰表明其可能含有型糖。

如圖2B所示，隨著NaOH濃度增加，HVRP與剛果紅試劑作用后的最大吸收波長不斷減小，較剛果紅未發生紅移，最大吸收波長的連續下降可能是因為HVRP在水溶液中為無規卷曲構象，且氫鍵不斷被堿性溶液破壞。由此判斷，HVRP不存在三螺旋構象。

圖2 HVRP的傅里葉變換紅外光譜（A）和剛果紅實驗結果（B）Fig. 2 Fourier transform infrared spectrum (A) and Conge test results (B) of HVRP

2.5 HVRP的體外抗氧化活性

由圖3可知，隨HVRP質量濃度增大，其抗氧化活性先升高后趨于穩定，呈一定的劑量效應關系，在HVRP質量濃度為100 μg/mL時，DPPH自由基清除率為63.93%，羥自由基清除率為70.31%，超氧陰離子自由基清除率為83.45%。HVRP表現出較強的體外抗氧化能力，其抗氧化活性可能與HVRP中含有一定的糖醛酸有關。

圖3 HVRP對DPPH自由基（A）、羥自由基（B）、超氧陰離子自由基（C）的清除率Fig. 3 DPPH (A), hydroxyl (B), and superoxide anion radical (C)scavenging capacity of HVRP

2.6 HepG2細胞存活率

采用MTT法檢測HVRP的細胞內毒性，如圖4A所示，0～100 μg/mL HVRP對HepG2細胞的生長無毒性，當質量濃度為200 μg/mL時，HepG2細胞活力受到抑制。因此，選取5、25、100 μg/mL進行細胞實驗。

為了考察HVRP對肝細胞氧化損傷的作用機制，采用-BHP建立氧化損傷模型。如圖4B所示，HepG2細胞活力隨-BHP濃度的增加明顯下降。通過GraphPad Prism 7.0軟件進行擬合，得到-BHP作用的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC）為（217.52±20.94）μmol/L。因此，選取濃度220 μmol/L的BHP建立細胞氧化損傷模型。

圖4 HVRP（A）和t-BHP（B）對HepG2細胞活力的影響Fig. 4 Effect of HVRP and t-BHP on cell viability in HepG2 cells

2.7 HVRP對氧化損傷細胞抗氧化能力的影響

大量產生的ROS和GSH的消耗會引起機體的氧化應激，機體受到氧化刺激后，抗氧化酶系統能夠進行自我修復和調整，從而減少對細胞的氧化損傷。由圖5A可知，-BHP作用于HepG2細胞后，ROS生成量是正常組的4.65 倍。HVRP處理能夠極顯著降低ROS水平，HV100組ROS水平降低至正常組的1.27 倍。如圖5B～F所示，與模型組相比，HVRP能顯著或極顯著降低MDA含量，顯著或極顯著提高SOD、CAT和GPx活力并增加GSH含量。以上結果說明HVRP能夠通過提高氧化損傷細胞的抗氧化酶活力、降低ROS水平來幫助細胞抵御氧化損傷。

圖5 不同濃度HVRP對t-BHP誘導的HepG2細胞抗氧化酶活力和ROS生成量的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of HVRP on antioxidant enzyme activities and ROS production in t-BHP-induced HepG2 cells

2.8 HVRP對氧化損傷細胞中Keap1/Nrf2/ARE信號通路基因表達量的影響

Keap1/Nrf2/ARE信號通路是細胞應對氧化損傷的重要抗氧化途徑。由圖6可知，與模型組相比，HVRP處理總體上可明顯上調氧化應激通路中、、、、、基因的表達，當HVRP處理質量濃度為25 μg/mL時，以上基因的表達量極顯著上調，其中抗氧化信號通路下游基因、、表達量分別為模型組的4.36、4.67、5.28 倍。

圖6 HVRP對HepG2細胞氧化應激基因表達的影響Fig. 6 Effect of HVRP on the expression of genes associated with oxidative stress in HepG2 cells

2.9 HVRP對氧化損傷細胞中Keap1/Nrf2/ARE信號通路蛋白表達量的影響

為進一步驗證HVRP的抗氧化作用機制，采用Western Blot檢測相關蛋白表達情況，與基因表達結果相似，HVRP組較模型組明顯提高了Nrf2/ARE通路下游NQO1、HO-1蛋白表達水平（圖7A）。

Nrf2的核轉移是誘導NQO1和HO-1表達的關鍵步驟，HVRP處理使細胞質內Nrf2水平呈劑量依賴型降低趨勢，而細胞核內Nrf2水平呈劑量依賴型升高，表明HVRP能促進Nrf2的核轉移（圖7B）；與模型組相比，HVRP處理提高了Nrf2/ARE通路上游激酶p-JNK/JNK水平（圖7C）。上述結果與文獻[32]結果相似，提示JNK磷酸化可能會促進Nrf2核轉移，從而調控Nrf2/ARE通路下游II期解毒酶NQO1和HO-1的表達。

圖7 HVRP對HepG2細胞Nrf2/ARE通路氧化應激相關蛋白表達的影響Fig. 7 Effect of HVRP on the expression of oxidative stress-related proteins in Nrf2/ARE signaling pathway in HepG2 cells

3 討 論

ROS自由基引發的氧化應激是多種肝臟疾病發生的基礎。Keap1/Nrf2/ARE信號通路作為機體內重要的抗氧化信號通路，能夠誘導抗氧化蛋白的表達，從而增強機體的抗氧化損傷能力。Nrf2是細胞氧化應激通路中最重要的轉錄因子，受Keap1調控，在正常生理狀態下，Nrf2與Keap1在細胞質內處于結合的非活性狀態，通過泛素蛋白酶降解保持動態平衡，當細胞受到刺激時，機體出現氧化應激狀態，Nrf2與Keap1發生解偶聯，Nrf2激活并跨膜入核，與小Maf蛋白結合形成異二聚體，識別抗氧化反應元件ARE，進而啟動下游II相解毒酶和抗氧化酶的表達。相關研究表明，調節Keap1/Nrf2/ARE信號通路可能與肝癌的治療有重要關聯。

研究證實，多糖能通過參與調節Keap1/Nrf2/ARE信號通路起到改善氧化應激損傷等作用。阿里紅多糖能通過調節Nrf2/ARE信號通路提高機體抗氧化損傷作用；海帶多糖能夠通過激活Nrf2信號通路改善放射誘導的氧化應激損傷和炎癥反應；海藻多糖能提高抗氧化蛋白的表達、促進Nrf2的核轉移，并通過激活Nrf2/ARE信號通路改善MRC-5細胞的氧化應激狀態；從羊棲菜中提取的多糖能通過JNK與Nrf2相互作用激活Nrf2/ARE信號通路，并啟動Nrf2下游相關抗氧化和解毒酶基因的表達，進而提高機體抗氧化能力，延緩小鼠的衰老進程。為了明確HVRP的抗氧化機制，本實驗研究了HVRP對Keap1/Nrf2/ARE信號通路的調節作用。結果顯示，HVRP能顯著或極顯著降低細胞內ROS水平和MDA含量、提高抗氧化酶（CAT、SOD、GSH、GPx）活性，并且對Keap1/Nrf2/ARE信號通路中關鍵因子的基因和蛋白表達有顯著的調節作用；JNK作為Nrf2/ARE通路的上游激酶，可能對Nrf2/ARE信號通路的激活具有一定的促進作用，而HVRP處理有提高JNK磷酸化的趨勢，這些結果均表明HVRP對-BHP誘導HepG2細胞氧化應激損傷的保護作用與Keap1/Nrf2/ARE信號通路的調節有關，具體機制可能是HVRP通過誘導JNK蛋白磷酸化，促使細胞質內的Nrf2與Keap1解離，促進Nrf2轉入核內，進而與抗氧化反應元件ARE序列結合，啟動II相解毒酶（HO-1、NQO1、GST）和抗氧化酶的轉錄表達，最終提高HepG2細胞抗氧化能力。

4 結 論

本實驗優化了HVRP提取工藝，得到最優提取條件為：提取溫度84 ℃、提取時間3 h、料液比1∶31，該條件下HVRP提取率為23.9%。體外抗氧化實驗表明HVRP具有較強的自由基清除活性。抗氧化機制研究證明了HVRP通過激活氧化應激Keap1/Nrf2/ARE信號通路起到保護HepG2細胞免受-BHP誘導的氧化損傷作用。綜上，本研究可為HVRP作為天然抗氧化劑在功能性食品中的開發應用提供科學依據。