無機離子對磷硫修飾DNA的碘催化斷裂反應的顯著影響?

胡坤靈，湯若冰，安 然，2，梁興國，2??

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266237)

磷硫修飾是一種常用的核酸化學修飾方式，廣泛應用于核酸藥物開發[1-3]。磷硫修飾DNA(Phosphorothioate DNA，PT-DNA，見圖1A)是硫原子取代了DNA骨架上磷酸基團中非橋接氧原子。相對于天然DNA，PT-DNA較難被核酸酶消化，可以提高藥物在體內的穩定性，延長核酸藥物的半衰期[4-6]。磷硫修飾可用兩種方法制備，一是用硫修飾的dNTP(α-磷酸處一個氧原子被硫原子取代)為原料，由DNA聚合酶引入[7]；二是通過化學合成法將帶有硫修飾的活性單體引入到DNA序列的指定位置[8]。Zhou和Deng的研究小組在二十世紀八十年代后期意外發現了一種奇怪的現象，即一些微生物(如變鉛青鏈霉菌)的基因組相對于其他微生物很容易斷裂[9]。經過十幾年的研究他們發現，這些微生物的基因組中含有易于斷裂的磷硫修飾[10]。深入研究表明，生物體內只存在R-構型(Rp)而不存在S-構型(Sp)的PT-DNA[11]。雖然PT-DNA被認為具有抗氧化、消滅外來入侵基因組的功能，但其機制及生物學意義還亟待進一步闡明[12-14]。

(A：PT-DNA同非修飾DNA的結構比較；B：Tris、HEPES、磷酸的結構。A:Structural comparison between PT-DNA and unmodified DNA; B:Structures of Tris、HEPES and Phosphoric acid.)

為開發新的測序技術，Gish等于1988年以待測序DNA或RNA為模板生成PT-DNA或PT-RNA，并通過對其進行適當斷裂后的電泳分析來讀取序列信息[15]。他們發現2-碘乙醇或環氧丙烷等烷基化試劑可使PT-DNA斷裂，并提出了烷基化PT-DNA脫硫和斷裂的機理，但未提供證據[16]。隨后，Blanusa等發現可用碘溶解在乙醇中的新鮮溶液(碘/乙醇)代替2-碘乙醇，并指出斷裂收率達70%左右[17]。但有關碘/乙醇斷裂PT-DNA的收率的數據卻無法在相應的文獻中找到。之后大家都引用Nakamaye等的論文，并認為碘/乙醇也是通過形成2-碘乙醇，然后使PT-DNA進行烷基化而斷裂。2014年Cao等人開始使用碘和碘化鉀的混合溶液(不可能生成2-碘乙醇)，并發現與碘/乙醇有同樣的效果[18]。

最初，PT-DNA斷裂使用生物反應常用的Tris-HCl緩沖溶液[15]。Tris(tris-(hydroxymethyl)-aminomethane)、HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸，2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazinyl]ethanesulfonic acid)及Phosphate等有pH調節功能的分子結構如圖1B所示。2014年Cao等開始使用磷酸緩沖溶液代替Tris-HCl，并認為應有同樣的效果[18-20]。一般認為緩沖液是保證反應過程中pH穩定，很難想到會對核酸斷裂反應產生影響。不可思議的是，Cao等推測Tris可能參與了斷裂反應[21]。但他們在反應體系中并未特意加入Tris，只是認為可能是前期樣品處理過程中沒有被除凈的Tris造成的副反應。這些結果提示我們，可能緩沖溶液本身以及各種陽離子對于PT-DNA的斷裂有較大影響，甚至直接參與了反應。顯然，深入研究以解釋這些相互矛盾的結果可以減少它們對于研究者造成的諸多誤解和困惑。

本研究探究了在Tris-HCl、磷酸鈉和HEPES三種緩沖溶液中碘斷裂PT-DNA的情況，并考察了Na+、Mg2+、Ca2+以及精胺等陽離子對斷裂的影響。結果發現緩沖溶液對PT-DNA斷裂影響顯著，且會對單鏈和雙鏈狀態PT-DNA產生明顯不同的影響。最后，我們根據反應結果提出了碘在不同緩沖溶液下斷裂PT-DNA的碘氧化機理，并從氧化反應的角度討論了其在生物體內可能起到的功能作用。

1 實驗方法

1.1 試劑與材料

DNA序列由生工生物工程股份有限公司(中國，上海)合成(見表1)。實驗中所用化學試劑，除碘購自上海麥克林生化科技有限公司外，其他化學試劑(KI、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH、NaCl、MgCl2、CaCl2、Tris、HCl、精胺)均來自國藥集團化學試劑有限公司(中國，上海)。聚丙烯酰胺(PAGE)電泳所需試劑購自白鯊生物技術有限公司(中國，合肥)。

表1 本研究中使用的寡核苷酸序列

1.2 碘溶液的制備

實驗中所使用的碘溶液是I2/KI溶液(碘溶解在碘化鉀的新鮮溶液)，具體制備方法：將固體碘溶于1.0 mol/L KI水溶液中至終濃度為200 mmol/L，60 ℃加熱溶解固體碘,充分溶解后，所得溶液在4 ℃避光保存，2周之內使用。在與PT-DNA反應之前，用無菌水將I2/KI溶液稀釋到所需的濃度。稀釋后的I2/KI溶液需在12 h內使用。

1.3 碘斷裂PT-DNA反應

在20 μL總反應體系中包括如下物質:1.0 μmol/L D1S-90(單鏈)或同時有1.0 μmol/L互補鏈D-30(雙鏈)，0.1 mmol/L I2/KI溶液，20 mmol/L緩沖溶液(Tris-HCl或磷酸鈉或HEPES；pH=8.0，25 ℃測定)；上述物質混合均勻后加入碘。使用PCR儀(將樣品管放入控溫的PCR儀中)控制反應溫度。除了研究溫度對斷裂反應的收率影響時采用4種反應溫度(0、25、37和65 ℃)外，如無特殊指出，一般反應溫度為25 ℃，反應時間為30 min。反應至指定時間后，加入2 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)以破壞未反應的碘，并在4 ℃條件下保存樣品，直到樣品進行電泳檢測。斷裂反應的產物通過變性12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(6.25 mol/L甲酰胺、8.0 mol/L尿素、1×TBE電泳緩沖液)進行檢測。

對于研究鹽離子對碘斷裂PT-DNA影響的實驗，只是在上述反應體系中，在碘加入前加入不同濃度的鹽離子(NaCl：1.0～3 000 mmol/L，MgCl2：0.01～200 mmol/L,CaCl2：0.01～100 mmol/L，精胺：0.01～0.2 mmol/L)，其他條件與上述斷裂反應相同。

1.4 丙烯酰胺凝膠電泳分析斷裂收率

碘斷裂反應后，將樣品與1×上樣緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl(pH=7.6)、0.03%溴酚藍、0.03%二甲苯氰FF、60%甘油、60 mmol/L EDTA)混合，用含6.25 mol/L甲酰胺的12%變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分析。電泳結束后用GelRed染色，底物和斷裂產物將通過Gel Doc XR+成像系統(Bio-Rad)和Image lab軟件v3.0(Bio-Rad)定量。斷裂收率(生成斷裂產物與反應底物的比值)計算公式如下：

斷裂收率=(P1+P2)/(S+P1+P2)×100%。

式中：S為底物(D1S-90)的條帶亮度；P1及P2分別為斷裂后的兩段產物(51和39 nt)的條帶亮度。每個實驗至少重復3次取平均值；實驗中條帶亮度的定量誤差在5%以內。

1.5 統計學分析

使用SPSS 24.0統計軟件進行分析，其中對含有單鏈及雙鏈狀態下兩組的組間比較采用雙側曼-惠特尼U檢測(Two tailed Mann-Whitney U test)。

2 結果與討論

2.1 Tris-HCl條件下碘高效斷裂PT-DNA

三羥甲基氨基甲烷(Tris)作為一種最常用的生物反應緩沖溶液，在2-碘乙醇斷裂PT-DNA研究中經常被使用?？紤]到單鏈和雙鏈DNA結構中磷酸二酯鍵空間結構的差異可能影響PT-DNA的斷裂效率，我們首先研究了各種緩沖溶液下碘對單鏈和雙鏈狀態PT-DNA的斷裂情況。單鏈反應體系采用含有單個磷硫修飾的90 nt長單鏈DNA(D1S-90)，具體序列如表1所示。在硫修飾位點斷裂后會產生長度為51和39 nt的兩個DNA片段(見圖2A)。雙鏈反應體系采用D1S-90和D-30(30 nt長互補單鏈)退火雜交，雜交后形成長度為30 bp的雙鏈結構(硫修飾位點處于雙鏈部分的中間位置，見圖2B)。

在Tris-HCl緩沖條件下，碘斷裂PT-DNA的結果顯示單鏈斷裂率在70%左右(見圖2A)。有趣的是，當反應溫度為0 ℃時斷裂收率最高,達到76%(見圖2A的泳道2)，這表明斷裂反應非常高效。溫度較低斷裂效率反而有所升高這一反?，F象可能是由于碘在造成PT-DNA斷裂的同時還會發生脫硫反應[16,22]，而低溫抑制了脫硫有利于提高斷裂反應與脫硫反應的比例。相比單鏈體系，雙鏈體系斷裂率稍高，可達75%～80%(見圖2B)。

(A：單鏈PT-DNA結構示意圖及變性膠電泳分析；B：雙鏈PT-DNA結構示意圖及變性膠電泳分析。圖中紅色字體S表示磷硫修飾的位置。泳道1為對照組D1S-90。泳道2～5分別為反應溫度為0、25、37、65 ℃的反應結果。A: Structure of single-stranded PT-DNA and results of eletrophoertic analysis; B: Structure of double-stranded PT-DNA and results of eletrophoertic analysis.The red font S in the figure indicates the position of PT-modification.Lane 1 represents D1S-90 as a control group.Lane 2～5 represent the results at reaction temperatures of 0、25、37、65 ℃, respectively.)

2.2 鹽離子對Tris-HCl緩沖溶液中PT-DNA斷裂的影響

為進一步探究各種鹽離子對Tris-HCl緩沖溶液中碘斷裂PT-DNA的影響，分別研究了在NaCl、MgCl2、CaCl2及精胺的條件下單鏈和雙鏈狀態PT-DNA的斷裂效率。電泳后經定量分析所得的斷裂收率與離子濃度的關系如圖3所示。上述鹽類物質在很低的濃度范圍內(1～10 mmol/L)就可以顯著降低單鏈斷裂的收率。隨著鹽濃度的增加，收率逐漸降低并達到飽和，如加入1.0 mol/L NaCl后D1S-90單鏈的斷裂收率從72%下降到58%。加入100 mmol/L的MgCl2和CaCl2后，單鏈PT-DNA的斷裂收率分別下降到53%和47%，Mg2+和Ca2+二價陽離子對斷裂反應的影響更大，這可能是由于陽離子同DNA上帶負電的磷酸基團結合對斷裂反應產生了阻礙作用，而二價陽離子的結合能力更強。如這一猜想正確，可以預測多聚陽離子精胺(每個精胺分子含有兩個氨基和兩個亞氨基)會產生更為顯著的阻礙作用。見圖3D顯示，很低濃度(小于50 μmol/L)的精胺即可顯著降低斷裂收率；當精胺濃度達到100 μmol/L時，斷裂率甚至降低至40%以下。在實驗中我們發現，當體系中含有100 μmol/L以上精胺時，電泳染色效果顯著降低，這是由于精胺結合DNA后影響了染料的結合，造成難以染色。有趣的是，在僅有精胺的對照組中，我們也發現了約40%的斷裂收率。這一結果表明，在Tris不存在的情況下，精胺本身也能促進硫修飾DNA的斷裂，但其反應的詳細機理有待進一步研究。

圖3 鹽離子對Tris-HCl條件下碘斷裂PT-DNA的影響

意外的是，隨著Na+、Mg2+和Ca2+等金屬陽離子的濃度的升高，雙鏈狀態PT-DNA的斷裂反應的收率穩定在81%～84%之間，并沒有顯著下降(見圖3)。這表明與單鏈狀態不一樣(p<0.05)，在Tris-HCl緩沖溶液中雙鏈狀態PT-DNA的斷裂反應基本不受這些陽離子的影響。這可能是單鏈和雙鏈DNA同Tris分子作用受其他陽離子的影響不同造成的。而精胺使雙鏈狀態PT-DNA斷裂收率也顯著降低(見圖3D)。這可能因為精胺對雙鏈DNA的結合能力極強，阻礙了陰離子定向攻擊磷酸二酯鍵處的磷原子。精胺存在下染色劑對雙鏈DNA更難染色也說明其對雙鏈DNA的超強結合能力[23-25]。這也表明精胺通過這種相互作用保護DNA。

2.3 陽離子通過同Tris競爭對單鏈DNA的結合以影響碘斷裂PT-DNA

Tris的分子結構中含有三個羥基和一個氨基(見圖1B)，這一結構既有助于同DNA結合又可能參與DNA水解斷裂所需的親核反應。我們推測有可能是Tris分子中因質子化而帶正電荷的氨基與帶負電的PT-DNA相互吸引，而Tris的羥基可進攻磷硫修飾位點而發生斷裂。加入陽離子后可能與Tris形成了對DNA結合的競爭關系，聚集在PT-DNA周圍的這些陽離子影響了帶正電荷的Tris離子的接近，從而使斷裂收率降低。

為驗證金屬陽離子同Tris對PT-DNA結合的競爭作用，我們重點研究了Tris的濃度為20和100 mmol/L兩種情況下，MgCl2濃度對斷裂收率的影響(見圖4)。結果表明，當Tris的濃度為20 mmol/L時，加入10 mmol/L MgCl2后單鏈PT-DNA的斷裂率從初始的72%下降至56%。當Tris濃度為100 mmol/L，單鏈PT-DNA的斷裂率同樣隨著MgCl2濃度的增加呈下降趨勢，且高濃度MgCl2可顯著降低單鏈PT-DNA的斷裂率。上述結果表明，陽離子確實影響了Tris與PT-DNA的結合，進而影響了PT-DNA的斷裂反應。

圖4 Mg2+與Tris的競爭影響單鏈的斷裂收率

2.4 磷酸鈉/HEPES緩沖溶液中PT-DNA的斷裂及鹽離子的影響

磷酸鈉(Sodium phosphate)曾被用于代替Tris-HCl作為PT-DNA斷裂反應的緩沖溶液[18]。為進一步研究各種離子對PT-DNA斷裂的影響，我們探究了在帶負電荷的磷酸根離子和電中性的HEPES分子作為緩沖溶液的反應情況。有趣的是，相比Tris-HCl作緩沖溶液，無論是單鏈還是雙鏈PT-DNA的斷裂收率都顯著下降(見圖5)。當HEPES作為緩沖溶液時，單雙鏈體系斷裂收率無明顯差別(見圖5的泳道3、泳道5，收率約為30%)；當磷酸鈉作為緩沖溶液時，雙鏈體系的斷裂收率(見圖5的泳道6，收率為39%)是單鏈體系(見圖5的泳道4，收率為16%)的2倍以上。不同緩沖條件造成了斷裂收率有差異，這也從側面驗證了Tris-HCl可能不僅是保持體系pH的緩沖溶液，而且極有可能作為反應物參與了斷裂反應。而磷酸鈉及HEPES不同于Tris，不能直接參與PT-DNA的斷裂反應。這一結果表明，PT-DNA的斷裂效率不只決定于斷裂試劑碘和反應溶液的pH，其他分子可能對其也有很大的影響。

(泳道1為對照組D1S-90及D30。Lane 1 represents D1S-90 and D30 as a control group.)

前面已經證實陽離子對Tris-HCl條件下的單鏈斷裂反應有顯著的抑制作用，而對雙鏈幾乎沒有作用，那對于磷酸鈉和HEPES這兩種緩沖溶液是否有類似的結果呢？如表2所示，當HEPES作為緩沖溶液時，1.0 mol/L NaCl使單鏈和雙鏈PT-DNA的碘斷裂收率均有所下降(見表2)。更有趣的是，磷酸鈉作為緩沖溶液時，同Tris-HCl作為緩沖溶液的情況相反，1.0 mol/L的NaCl反而使雙鏈狀態PT-DNA的斷裂收率顯著提高(由39%提高至61%)。對于單鏈PT-DNA，1.0 mol/L的NaCl未造成收率的明顯變化(分別是20%和16%)。

表2 不同緩沖溶液條件下加入1.0 mol/L NaCl的斷裂收率

為了進一步確認陽離子對磷酸鹽緩沖溶液中PT-DNA斷裂的作用，我們研究了NaCl濃度對收率的影響(見圖6)。結果顯示，NaCl濃度對單鏈PT-DNA的斷裂影響不大，且斷裂收率都很低(16%～20%)。對雙鏈PT-DNA的斷裂，隨NaCl濃度(≤1.0 mol/L)升高而收率升高(收率由40%升高到60%左右)。當NaCl濃度達到1.0 mol/L時，進一步升高NaCl濃度，斷裂收率則基本保持不變。

圖6 NaCl對磷酸鈉條件下碘斷裂PT-DNA的影響

實際上，與HEPES分子呈電中性不同，磷酸鹽在水中電離時帶有一個或兩個負電荷?？紤]到高濃度鹽離子可以增加磷酸鈉條件下雙鏈狀態PT-DNA的斷裂收率，我們猜測磷酸緩沖溶液中，磷酸或許也能參與斷裂反應。如果確實如此，磷酸鈉濃度也會影響斷裂收率。因此我們研究了磷酸鈉濃度對PT-DNA斷裂的影響(見圖7)。結果顯示，對于雙鏈PT-DNA，當磷酸鈉濃度(pH保持不變)由5 mmol/L增加至100 mmol/L，斷裂收率由17%提高到56%(見圖7的泳道3～7)。雖然單鏈PT-DNA斷裂收率依舊不高(<25%)，但可明顯看出隨著磷酸鹽緩沖的溶液濃度增加，單鏈PT-DNA斷裂收率由12%提升至24%(見圖7的泳道8～10)。

圖7 磷酸鈉緩沖溶液的濃度對碘斷裂PT-DNA的影響

綜上，鹽離子對PT-DNA斷裂有著復雜的影響。在三種不同的緩沖溶液中鹽離子對于單鏈和雙鏈PT-DNA斷裂的影響不同(促進/阻礙)，即在PT-DNA分子周圍的離子環境顯著影響了其斷裂反應。

2.5 碘斷裂PT-DNA的機理推測

圖8 碘斷裂PT-DNA的機制推測

除了緩沖溶液，PT-DNA的構象對斷裂效率也可能產生影響，而這種影響在高濃度鹽離子的作用下可能更加明顯。在Tris-HCl緩沖溶液中，鹽離子與Tris競爭結合PT-DNA進而影響了斷裂反應。特別是對于單鏈PT-DNA，Tris對于PT-DNA的結合能力較弱，更容易受到陽離子的影響。雖然鹽離子對單鏈斷裂顯示出較明顯的影響，但是即使很高的陽離子濃度下，單鏈PT-DNA的斷裂收率也仍有50%左右。而對于雙鏈DNA，由于DNA雙螺旋結構的小溝中有較強的疏水性，在疏水作用和離子結合的雙重作用下，Tris可能同DNA結合更緊密，很難被陽離子替代。因此，鹽離子很難影響Tris-HCl緩沖溶液中碘對雙鏈PT-DNA的斷裂反應。

目前的研究認為，天然的磷硫修飾DNA通過抗氧化或類似限制性修飾(Restriction modification)系統保護細菌自身而提高生存競爭力[26-27]。我們的研究表明，細菌可能通過這種磷硫修飾來保護DNA分子的氧化。特別是當其他抗氧化系統存在漏洞，讓具有氧化能力的分子可以接觸到DNA時，磷硫修飾可減少DNA堿基的氧化。總之，PT-DNA可以有效吸引弱氧化劑以免其對DNA造成難以修復的破壞。細菌可通過指定位點(磷硫修飾處)的結構變化或斷裂而產生抗氧化響應，最大限度地保持基因的穩定性。同時也引發了我們對帶有磷硫修飾的核酸藥物在體內代謝方式的思考，它們很可能是由于氧化作用引發的斷裂而后被進一步代謝或是脫硫后被核酸酶分解。此外，這種磷硫修飾DNA或RNA已被用于開發核酸藥物、重金屬離子檢測和核酸檢測等生物技術[28-30]。因此，本研究結果及推測的機理有助于核酸藥物的開發與優化。

3 結語

本研究表明，緩沖溶液及鹽離子可影響PT-DNA的斷裂收率，特別是Tris通過直接參與反應的方式使PT-DNA發生高效斷裂，最高收率可達80%。在HEPES或磷酸鈉緩沖條件下，斷裂收率較低(一般低于60%)。研究還發現，PT-DNA所形成的二級結構(單鏈或雙鏈)對斷裂也產生了很大的影響。具體表現在，Tris作為緩沖溶液時，陽離子會使單鏈PT-DNA的斷裂收率顯著下降，但不影響雙鏈狀態PT-DNA的斷裂反應。金屬陽離子的存在會使得磷酸鈉緩沖溶液條件下雙鏈狀態PT-DNA易受羥基(OH-)進攻，進而斷裂收率得到顯著提高；而對于單鏈PT-DNA體系，雖然斷裂收率也會隨金屬陽離子濃度升高而升高，但提升效果欠佳，最高收率僅達24%。本研究可為深入理解磷硫修飾DNA的生物學功能及開發相應的生物技術提供重要參考。