木香烴內酯通過內質網應激和自噬誘導骨肉瘤細胞凋亡①

劉景新 陳余興 王貴（海南西部中心醫院骨科，儋州 571700）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種由成骨間充質細胞引起的骨骼系統原發性惡性腫瘤，多發于15～19歲的青少年。該疾病發病率高，預后差，具有較高的侵襲性和轉移性，確診時約有20%的患者發生遠端轉移，嚴重威脅患者生命安全［1-2］。近年來，手術和化療的改進使得OS患者的五年生存率從不足20%提高至65%～75%，但OS患者一旦出現腫瘤復發或者耐藥性，常規的治療策略很難有效延長患者生存期［3］。因此，臨床亟需探尋新的OS治療策略。

內質網應激是內質網功能紊亂引起的錯誤折疊或未折疊蛋白質積聚狀態，過度的內質網應激會誘導細胞凋亡［4-5］。細胞自噬是細胞進行代謝更新的重要途徑，其與腫瘤的能量代謝、炎癥反應、化療耐藥性等密切相關［6-7］。研究發現，自噬影響多種抗腫瘤藥物誘導腫瘤細胞凋亡過程［8］。內質網應激與自噬均對腫瘤細胞的生存狀態有一定影響。

木香烴內酯（costunolide，Cos）是一種活性倍半萜內酯，來源于云木香、雪蓮花、月桂等多種藥用植物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生物學活性［9］。FU等［10］研究報道，Cos通過激活ROS/MAPK信號通路對腎細胞癌細胞自噬和凋亡起調控作用。Cos還可通過激活凋亡和自噬通路抑制卵巢癌OAW42-A多藥耐藥細胞的生長［11］。Cos對多種腫瘤細胞具有抑制增殖、誘導凋亡的作用，有望成為新一代抗癌藥物。但關于Cos在OS中的作用及內在分子機制的相關研究較少。因此，本研究以OS細胞為研究對象，從內質網應激和自噬的角度探討Cos對OS細胞凋亡的影響及其可能的分子機制，以期為Cos的開發利用和OS的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料人OS MG63細胞株（上海斯信生物科技有限公司）；Cos（純度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司），用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解配制成溶液，保存備用；RPMI1640培養基，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素溶液（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒（美國APExBIO公司）；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；RIPA細胞裂解液、BCA檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；兔B淋巴細胞瘤-2（B lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2結合抗凋亡基因（Bax）、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、內質網應激蛋白真核生物翻譯起始因子2α（eIF2α）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、蛋白激酶R樣內質網激酶（protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、自噬蛋白微管相關蛋白輕鏈3B-Ⅱ（microtubule-associated protein light chain 3B-Ⅱ，LC3B-Ⅱ）、Beclin-1、p62、β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔IgG（H+L）（英國Abcam公司）；ECL化學發光顯色液（蘇州新賽美生物科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養將解凍、復蘇的MG63細胞培養于含10%FBS、1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640完全培養基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，每2 d更換1次培養液，根據細胞形態傳代培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖能力消化重懸MG63細胞，取100 μl細胞懸液以5×105個/ml密度接種于96孔板，待細胞貼壁后，用不同濃度（5、10、15、20、25、40 μmol/L）Cos處理細胞24 h、48 h、72 h，同時設置陰性對照（采用DMSO處理）和空白對照（無細胞），每孔設置5個復孔。細胞培養結束后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃避光孵育4 h，采用多功能酶標儀測定每孔在450 nm處的吸光度（OD），計算細胞增殖抑制率，用Logit法計算半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。細胞增殖活力（%）=（OD藥物組-OD空白對照）/（OD陰性對照-OD空白對照）×100%。實驗重復3次。

1.2.3劃痕試驗檢測細胞遷移能力調整MG63細胞密度為5×105個/ml，均勻接種于6孔板，每孔設5個復孔，待細胞貼壁生長為適宜密度后，棄去培養液，用高溫滅菌的移液槍頭勻速在6孔板內每孔正中間垂直劃線，用滅菌的PBS小心洗去細胞碎片，將培養基更換為無血清的RPMI1640培養基，在0 h于倒置顯微鏡下觀察拍照并做好標記，用20 μmol/L濃度的Cos處理細胞，陰性對照采用DMSO處理，培養48 h后，于倒置顯微鏡下觀察拍照并標記，計算細胞遷移率，實驗重復3次。細胞遷移率（%）=（0 h劃痕距離-48 h劃痕距離）/0 h劃痕距離×100%。

1.2.4Transwell小室法測定細胞侵襲能力預先將稀釋好的Matrigel基質膠工作液加入Transwell小室。室溫放置8 h，固化培養基，接種細胞前對基底膜進行水化。取對數生長期MG63細胞，以5×105個/ml的細胞密度接種于Transwell小室，每孔加入200 μl細胞懸液，下室加入500 μl含10%FBS的RPMI1640培養基，每組設置5個復孔。用20 μmol/L濃度的Cos處理細胞，陰性對照采用DMSO處理，將Transwell小室置入37℃、5%CO2的培養箱中培養48 h，棄去培養液，無菌棉簽輕輕擦去上層細胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，20 min后室溫下用0.1%結晶紫染色30 min，PBS洗去染液，自然晾干，倒置顯微鏡下觀察計數，結晶紫染色細胞數即為侵襲細胞數。細胞侵襲率（%）=藥物組穿膜細胞數/陰性對照組穿膜細胞數×100%。實驗重復3次。

1.2.5Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率將MG63細胞以5×105個/ml的密度接種于60 mm培養皿，加入3 ml培養基，于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養24 h，陰性對照組采用DMSO處理，Cos組采用20 μmol/L的Cos處理，每孔設置5個復孔。細胞處理48 h后，使用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，PBS洗滌2次，加入100 μl的結合緩沖液重懸細胞，分別加入Annexin V-FITC與PI熒光染液各5 μl，室溫下避光孵育20 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.6Western blot法檢測相關蛋白表達水平取對數生長期MG63細胞，重懸調整密度為1×107個/ml，于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養至細胞貼壁。將細胞分為4組：陰性對照組（DMSO處理），Cos組（20 μmol/L Cos處理），Cos+內質網應激抑制劑牛磺熊去氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDC）組（20 μmol/L Cos和500 mg/L TUDC處理）或Cos+自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）組（20 μmol/L Cos和3 mmol/L 3-MA處理）。細胞處理48 h后，收集各組細胞，加入RIPA緩沖液裂解細胞，在4℃、12 000 r/min條件下離心15 min，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取等量的蛋白提取液進行SDS-PAGE電泳，濕法轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h，分別加入凋亡蛋白Bcl-2抗體（1∶1 000）、Bax抗體（1∶1 000）、Caspase-3抗體（1∶1 000）、Cleaved Caspase-3抗體（1∶1 000）、內質網應激蛋白eIF2α抗體（1∶1 000）、CHOP抗體（1∶1 000）、PERK抗體（1∶1 000）、自噬蛋白LC3B-Ⅱ抗體（1∶1 000）、Beclin-1抗體（1∶1 000）、p62抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗滌10 min×3次，加入相應HRP標記的羊抗兔IgG（H+L）（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌10 min×3次，用ECL發光液顯影，以β-actin為內參，分析各條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.3統計學分析采用SPSS17.0和GraphPad Prism7.0軟件進行實驗數據處理分析，實驗結果以±s表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1Cos對OS細胞增殖、遷移、侵襲的影響分別使用5、10、15、20、25、40 μmol/L的Cos處理MG36細胞24 h、48 h、72 h，CCK-8試驗結果顯示，相同作用時間時，隨著Cos濃度的升高，MG36細胞增殖活力逐漸降低（P＜0.05）；相同藥物濃度時，隨著Cos濃度作用時間的延長，MG36細胞增殖活力逐漸降低（P＜0.05）。說明Cos對MG36細胞增殖的抑制作用具有濃度和時間依賴性（圖1A）。因Cos作用24 h時對MG63細胞的增殖抑制效果不明顯，72 h時Cos會過度抑制MG63細胞增殖，而48 h時Cos抑制MG63細胞增殖效果最為有效，故本研究采用48 h作為Cos處理細胞的時間。Cos處理MG36細胞48 h的IC50值為19.21 μmol/L，因此，選取20 μmol/L的Cos用于后續試驗。劃痕試驗和Transwell小室試驗結果顯示，與陰性對照組比較，20 μmol/L Cos處理的MG36細胞遷移、侵襲能力明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖1B、C）。

圖1 Cos對OS細胞增殖、遷移、侵襲的影響Fig.1 Effects of Cos on proliferation，migration and invasion of OS cells

2.2Cos對OS細胞凋亡的影響與陰性對照組比較，20 μmol/L Cos干預MG36細胞48 h后，細胞凋亡率明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 Cos對OS細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Cos on OS cell apoptosis

2.3Cos對OS細胞內質網應激相關蛋白表達的影響與陰性對照組比較，Cos顯著上調MG36細胞的eIF2α、CHOP、PERK蛋白表達水平，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 Cos對OS細胞內質網應激相關蛋白表達的影響Fig.3 Effect of Cos on endoplasmic reticulum stress related protein expression in OS cells

2.4內質網應激參與Cos誘導的OS細胞凋亡與陰性對照組比較，Cos組Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與Cos組比較，Cos+TUDC組Bcl-2蛋白表 達 水平升 高，Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平降低，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 內質網應激參與Cos誘導的OS細胞凋亡Fig.4 Endoplasmic reticulum stress is involved in Cos induced OS cell apoptosis

2.5Cos對OS細胞自噬相關蛋白表達的影響與陰性對照組比較，Cos顯著上調MG36細胞的LC3B-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達水平，下調p62蛋白表達水平，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖5）。

圖5 Cos對OS細胞自噬相關蛋白表達的影響Fig.5 Effect of Cos on autophagy related protein expression in OS cells

2.6自噬參與Cos誘導的OS細胞凋亡與陰性對照組比較，Cos組Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與Cos組比較，Cos+3-MA組Bcl-2蛋白表達水 平升高，Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平降低，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖6）。

圖6 自噬參與Cos誘導的OS細胞凋亡Fig.6 Autophagy is involved in Cos induced apoptosis of OS cells

3 討論

OS是一種高度惡性腫瘤，其典型組織學特征為重度非典型性和多形性，瘤細胞大小不等，形態不一，治療難度較大［12］。盡管臨床有手術、放化療等多種治療方法，但由于OS轉移潛能高，預后差，患者生存率仍較低。積極探索新的、更有效的治療方法，改善OS患者生存率及生活質量尤為必要。近年來，中藥抗腫瘤活性的研究成為熱點。Cos是多種藥用植物的主要活性成分，據報道，Cos具有抑制腫瘤增殖和異種移植瘤生長的效果［13］。PENG等［14］研究報道Cos聯合去氫木香內酯通過c-Myc/p53和AKT/14-3-3途徑誘導細胞周期阻滯和凋亡抑制乳腺癌。WEI等［15］研究表明Cos可誘導H1299肺癌細胞凋亡并抑制其遷移和侵襲。本研究結果顯示，Cos能夠顯著抑制MG36細胞增殖，并且其抑制作用呈濃度和時間依賴性。同時，Cos還可有效降低MG36細胞的遷移、侵襲能力，促進OS細胞凋亡。該結果與JIN等［16］的研究結果一致，進一步證實Cos可抑制OS細胞的遷移和侵襲，Cos具有抗OS的作用。

CHOP是內質網應激誘導細胞凋亡的標志性蛋白，PERK是具有內質網腔結合域和蛋白激酶活性的細胞因子，內質網應激初期，啟動的PERK信號通路中PERK通過發生自體二聚化活化eIF2α，可促進細胞存活，但持久或過度的內質網應激會活化相關因子誘發細胞凋亡，最終促進CHOP的表達［17-18］。細胞凋亡過程中，抗凋亡Bcl-2蛋白、促凋亡Bax蛋白、凋亡核心蛋白Caspase-3以及活化的Cleaved Caspase-3蛋白均會異常表達。LIANG等［19］研究發現苦參堿通過上調Bax和Fas/FasL表達及下調Bcl-2表達誘導人OS細胞凋亡。WANG等［20］發現Cos通過內質網應激途徑誘導肺腺癌細胞凋亡。本研究結果顯示，Cos可通過上調MG36細胞的eIF2α、CHOP、PERK蛋白表達水平激活內質網應激，而內質網應激抑制劑TUDC可以顯著上調Cos處理的MG36細胞Bcl-2蛋白表達量，顯著下調Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達量。該結果提示，內質網應激促進Cos誘導的MG36細胞凋亡。

自噬是細胞自我吞噬的過程，屬于一種降解機制，幫助清除老化、受損的細胞器，維持細胞穩態。大量研究證實，自噬在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用，其可替代凋亡缺陷細胞抑制腫瘤，同時，誘導細胞自噬也可抑制細胞的抗癌活性［21-22］。LC3是自噬中的關鍵蛋白，其轉化為LC3B-Ⅱ是自噬激活的重要標志。Beclin-1是一種抑癌基因，其編碼的蛋白是調控自噬過程的關鍵蛋白，可通過參與自噬體的形成調節自噬活性。p62是一種泛素結合蛋白，在自噬信號轉導中起關鍵作用，其水平可間接反映自噬小體清除水平［23］。WANG等［24］報道松屬素通過升高Beclin-1和LC3B-Ⅱ的水平、降低p62表達激活自噬，進而調控糖皮質激素誘導的細胞凋亡。本研究結果顯示，Cos可顯著上調MG36細胞的LC3B-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達量，下調p62蛋白表達量。提示Cos激活MG36細胞自噬。為探討Cos處理的OS細胞中自噬對細胞凋亡的影響作用，本研究使用自噬抑制劑3-MA處理MG36細胞，結果顯示，3-MA顯著上調Cos處理的MG36細 胞Bcl-2蛋白表達量，下調Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達量。提示抑制自噬能夠有效減弱Cos誘導的細胞凋亡，自噬參與Cos誘導的MG36細胞凋亡。

綜上所述，Cos能夠抑制OS細胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導OS細胞凋亡。其作用機制可能是通過介導細胞內質網應激和自噬誘導細胞凋亡。本研究從內質網應激和自噬方面揭示了Cos抗OS的活性，為探索OS的治療提供了新思路。Cos可能通過其他信號通路發揮抗OS的作用，后期需要進一步揭示Cos抗OS的分子機制。