NEIL3調控p53信號促進卵巢癌進展的分子機制研究①

廖振蓉 申昌梅 余瑛（贛州市腫瘤醫院，贛州 341000）

卵巢癌是導致女性患者死亡的主要惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性生命健康。由于癥狀隱匿性強、體征出現較晚、早期診斷方法缺乏，卵巢癌初次確診時間較晚，發生遠處轉移概率較高，且治療后復發率也相對較高，五年生存率往往低于40%［1-3］。然而，當前手術治療和放射治療仍然是卵巢癌最主要的治療手段，短時間內并無新的治療策略或治療藥物［1-3］。導致這種狀況的主要因素是對卵巢癌發病及進展的深層分子機制認識太少，因而挖掘卵巢癌的決定性因子并闡明其分子機制是當前及未來較長時間內的重要任務。

DNA損 傷 應 答 反 應（DNA damage response，DDR）是維持DNA完整性和穩定性的重要機制。研究發現腫瘤細胞常伴有DDR缺陷，導致基因損傷積累，最終引起腫瘤發生［4-5］。

本研究主要探討DDR相關蛋白NEIL3在卵巢癌組織中的表達與卵巢癌分級的相關性，并通過體外實驗觀察NEIL3對卵巢癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響，同時驗證NEIL3與p53信號通路在卵巢癌中的作用及機制，為卵巢癌的早期診斷、預防、靶向治療及抗腫瘤藥物的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料卵巢癌組織和癌旁組織（距離病灶3 cm范圍）標本來源于贛州市腫瘤醫院病理科2016年8月至2019年9月保存的冰凍組織標本，癌組織取自原發灶，對應的癌組織和癌旁組織均取自同一個體，臨床信息完整。共38例，患者均知情同意。

卵巢癌細胞株SKOV-3、人正常卵巢上皮細胞株IOSE80購于中國科學院細胞庫；RPMI1640、FBS、胰酶（Gibco）；NEIL3-siRNA（蘇州泓迅生物科技有限公司）；Lipofectamine2000（Invitrogen）；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒、CCK-8、DMSO、細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術公司）；NEIL3、GAPDH引物（上海捷瑞生物科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1細胞轉染與基因敲減生物學網站分析并設計靶向人源基因NEIL3的siRNA寡核苷酸，然后以脂質體法導入細胞，siRNA靶向敲減細胞中NEIL3基因的表達。胰酶消化，計數，將SKOV-3、IOSE80以1×106個/ml接種于6孔板，無雙抗培養，細胞密度達到60%～80%時進行細胞轉染。①陰性對照：2 μl Lipo/100 μl無血清無雙抗培養基；②2 μg NEIL3-siRNA+8 μl Lipo/100 μl無血清無雙抗培養基；③5 μg NEIL3-siRNA+8 μl Lipo/100 μl無血清無雙抗培養基；④7 μg NEIL3-siRNA+8 μl Lipo/100 μl無血清無雙抗培養基，將混合物加入6孔板，輕搖混勻，37℃培養箱中培養4 h，更換含10%FBS的RPMI1640培養基，24 h、48 h、72 h后收集細胞備用。每組設3個復孔，所有試驗均重復3次。

1.2.2細胞增殖檢測（CCK-8法）收集轉染后的各組細胞，以3 000個/孔分別接種于96孔板。分別培養24 h、48 h、72 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑，孵育4 h后酶標儀檢測450 nm處的吸光度值，計算細胞增殖能力。每組設3個復孔，所有試驗均重復3次。

1.2.3細胞凋亡分析收集轉染后的各組細胞，以預冷PBS重懸后再次離心收集細胞，然后按照細胞凋亡檢測試劑盒使用說明書進行流式檢測分析凋亡率。簡述如下：以100 μl結合液重懸細胞，加入10 μl Annexin V-FITC染料，混勻后避光37℃孵育15 min，再加入400 μl結合液，混勻后，上機檢測凋亡率。每組設3個復孔，所有試驗均重復3次。

1.2.4Transwell小室實驗胰酶消化轉染24 h后的細胞以1×104個/孔分別接種于24孔板中懸掛的濾膜孔徑為8 μm的小室中，下室加入600 μl含20%FBS的RPMI1640培養基。分別于24 h、48 h、72 h后取出小室，甲醇固定，結晶紫染色，棉簽輕拭小室濾膜上層。顯微鏡下觀察，隨機選取10個不同的視野拍照，計數。每組設3個復孔，所有試驗均重復3次。

1.2.5實時熒光定量PCR分析收集轉染后的各組細胞，Trizol裂解細胞，RNA提取試劑盒提取總RNA。取1 μg總RNA根據反轉錄試劑盒使用步驟進行反轉錄制備cDNA。以GAPDH為內參，1 μg cDNA為模板，20 μl總反應體系，95℃5 min，（95℃15 s、60℃1 min）×45個循環，72℃延伸。每組設3個復孔，所有試驗均重復3次。

1.3統計學分析應用SPSS16.0軟件對數據進行統計學分析，定性分析采用χ2檢驗，兩組間比較采用t檢驗，生存曲線采用Kaplan-Meier法，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1NEIL3與卵巢癌臨床病理因素具有相關性qPCR檢測表明卵巢癌組織中NEIL3 mRNA的表達量是癌旁組織中的3.58倍，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖1A）。Kaplan-Meier分析發現，NEIL3表達量與卵巢癌患者的生存期呈負相關，NEIL3mRNA表達量高的卵巢癌患者五年生存率明顯低于NEIL3 mRNA表達量低的患者（P=0.004，圖1B）。

圖1 NEIL3基因表達的臨床意義Fig.1 Clinical significance of expression of NEIL3 gene

2.2NEIL3促進卵巢癌細胞生長如圖2A，qPCR檢測發現卵巢癌細胞SKOV-3中NEIL3 mRNA表達比人卵巢表皮細胞IOSE80提高15倍，差異具有統計學意義（P＜0.05）。本實驗設計合成了NEIL3-siRNA（siNEIL3），并成功敲減NEIL3表達。如圖2B所示，siNEIL3敲減效率達到90%。SKOV-3細胞的增殖能力隨之減弱。如表1，CCK-8檢測結果顯示，與對照組相比，轉染siNEIL3后第5天，SKOV-3增殖能力減弱34%，差異有統計學意義（P＜0.05）。在卵巢癌A2780細胞中，第5天后敲減組比對照組細胞增殖能力也顯著降低（P＜0.05）。提示NEIL3促進卵巢癌細胞的生長。

表1 CCK-8法檢測敲減NEIL3基因后SKOV-3細胞的增殖情況Tab.1 Proliferation of SKOV-3 cell after knockdown of NEIL3 gene detected by CCK-8 assay

圖2 敲減NEIL3基因可抑制SKOV-3細胞增殖Fig.2 Knockdown of NEIL3 gene inhibited proliferation of SKOV-3 cells

2.3敲減NEIL3抑制卵巢癌細胞遷移Transwell小室實驗檢測NEIL3對SKOV-3細胞遷移能力的影響。結果顯示，轉染siNEIL3降低NEIL3表達后，SKOV-3細胞穿過Transwell小室濾膜的數量明顯減少，細胞遷移能力較對照組降低53%，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3）。提示NEIL3對卵巢癌細胞遷移具有促進作用。

圖3 敲減NEIL3基因抑制SKOV-3細胞轉移Fig.3 Migration of SKOV-3 cell was inhibited by knockdown of NEIL3 gene

2.4敲減NEIL3促進卵巢癌細胞凋亡利用流式細胞術檢測轉染siNEIL3后SKOV-3細胞凋亡情況。如圖4所示，敲減NEIL3后SKOV-3細胞凋亡率接近8%，而對照組凋亡率不到1%，凋亡率升高近8倍，差異具有統計學意義（P＜0.05）。該數據表明NEIL3具有保護卵巢癌細胞免受凋亡的作用。

圖4 敲減NEIL3基因誘導SKOV-3細胞凋亡Fig.4 Knockdown of NEIL3 gene induced apoptosis of SKOV-3 cell

2.5NEIL3通過p53調控下游分子表達qPCR檢測凋亡相關基因的表達水平。如圖5所示，p53、p21、Bax及caspase-3基因的mRNA表達水平顯著提高。NEIL3敲減組較對照組分別提高6.47、7.33、2.82、5.44倍。相 反，NEIL3敲 減 組 中Bcl-2的mRNA表達水平較對照組降低約80%，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示NEIL3可能通過p53調控卵巢癌細胞凋亡。

圖5 NEIL3調控SKOV-3細胞中p53相關分子表達Fig.5 NEIL3 regulated expressions of p53-related molecules in SKOV-3 cell

3 討論

DNA堿基可能受到氧化、烷基化、脫胺和氧化性DNA損傷等許多內源性和外源性損傷，DNA堿基損傷誘導包括癌癥、動脈粥樣硬化、神經退行性疾病（如帕金森病和阿爾茨海默病）、衰老等多種疾病的發生和發展。堿基切除修復（base-excision repair，BER）途徑是主要的DNA修復途徑之一，DNA糖基酶是BER的關鍵酶，通過催化改性堿基和糖-磷酸主鏈間的N-糖基鍵的水解來啟動修復［6-9］。迄今為止，四種識別和切除氧化堿基的哺乳動物DNA糖基化酶已被鑒定，分別為：OGG1、NTH1、NEIL1和NEIL2。NEIL3是最近被發現的第三種哺乳動物DNA糖基化 酶，與NEIL1和NEIL2同屬于NEIL家族［10-12］。

NEIL家族是與大腸桿菌DNA糖酵素Fpg和Nei同源的蛋白質，NEIL1、NEIL2和NEIL3基因分別位于人類的15號、8號和4號染色體。NEIL3是一個68 kD的蛋白，其催化區域包含一個DNA結合口袋，能夠將被氧化的DNA堿基從端粒四聚體中切除，從而將ssDNA底物中氧化的DNA損傷產物去除，在細胞快速分裂中修復受損的堿基中發揮重要作用［13-14］。NEIL3在增殖細胞中表達，處于S/G2期，已被報道為細胞周期調控基因，是與復制小體相關的DNA糖基化酶，提示其在維持復制叉的穩定性中發揮重要作用［15］。人NEIL3在胸腺和睪丸中表達，而小鼠NEIL3在脾臟、骨髓、胸腺、血細胞和大腦區域高表達［16］。此外，NEIL3也被證明與癌癥的發生發展緊密相關。NEIL3的異常表達或突變會影響DNA復制效率，增加癌癥發生的風險，并影響癌癥的進展及治療。在一些轉移性癌癥的病例中，NEIL3可能是維持癌細胞生長或惡性腫瘤進展所必需的。

有研究檢測18個不同腫瘤組織和健康組織中hNEIL3 mRNA的表達水平，結果表明除睪丸和胰腺外，與正常細胞相比，腫瘤細胞內的NEIL3水平顯著升高。NEIL3在原發性惡性黑色素瘤中高表達，與原發性惡性黑色素瘤的轉移發展及其患者的高病死率相關。因此，有研究者認為高水平的DNA修復可能解釋了黑色素瘤對化療和放療的耐藥性。在包括GBM、LGG、PADC、LUAC、KRCCC和KPCCC等多數腫瘤中，NEIL3表達水平明顯升高，同時促進腫瘤細胞的增殖和生長。NEIL3高表達水平與不同類型 癌 癥（GBM、LGG、PADC、LUAC、KRCCC和KPCCC）患者的不良臨床結果顯著相關。此外，高NEIL3表達與三陰性表型（ER陰性、PR陰性、HER2陰性表型）間的相關性是支持預后較差的乳腺癌特定亞組的一個重要特征。相反，在胃癌和結直腸癌患者中，高NEIL3表達與更好的癌癥特異性生存有關。因此，NEIL3可能在不同組織引起的癌癥中發揮不同作用，NEIL3的上調可能影響不同類型腫瘤的進展［16-17］。

然而，NEIL3在卵巢癌中的作用及其機制尚不明確。本研究通過檢測卵巢癌細胞及組織標本中NEIL3的表達水平，敲減NEIL3-siRNA在卵巢癌中的表達，較為系統地研究了NEIL3在卵巢癌中的表達情況和作用機制。首先，課題組檢測到卵巢癌組織中NEIL3 mRNA的表達量高于癌旁組織，統計學分析顯示，NEIL3在卵巢癌組織中的表達與卵巢癌病理分級及患者的生存時間有明顯的相關性。在高分化的卵巢癌組織中，NEIL3 mRNA的表達量明顯低于低分化的卵巢癌組織，NEIL3 mRNA表達量高的卵巢癌患者總生存期明顯低于NEIL3 mRNA表達量低的卵巢癌患者，提示NEIL3表達上調可能參與卵巢癌的發生發展。通過CCK-8、Transwell小室、流式細胞術實驗檢測NEIL3對卵巢癌細胞惡性行為的影響，結果顯示，NEIL3能夠促進卵巢癌細胞的增殖和遷移，抑制其凋亡。敲減NEIL3后，通過熒光定量PCR技術檢測SKOV-3細胞內p53、p21、Bax、Bcl-2 mRNA表達水平。結果顯示，p53、p21、Bax mRNA表達水平上調，Bcl-2 mRNA表達水平下調，差異有統計學意義（P＜0.05），提示沉默NEIL3可能激活p53依賴的凋亡信號通路，促進腫瘤細胞凋亡，從而調控卵巢癌細胞的生長、遷移和侵襲。

作為DDR的關鍵酶，NEIL3高表達的腫瘤可能具有更大的基因組不穩定性，NEIL3的高水平表達可能促進癌癥表型基因組不穩定和/或干擾替代DNA修復，這種特殊的特征可能有助于解釋NEIL3高表達卵巢癌細胞的惡性生物學行為和癌癥患者的不良預后。本研究結果提示NEIL3可以作為一個潛在的藥物靶點被探索，為卵巢癌的治療策略和患者的預后評估指標開發提供了新思路。