黃芩苷對膿毒癥急性肺損傷小鼠TLR4/NF-κB通路及Treg/Th17平衡的影響①

徐玲文 王華兵 王倩 揭鳳英 鄧淑萍 董芳（武漢市第三醫院重癥醫學科，武漢 430060）

膿毒癥是臨床危重患者的一種常見全身性炎癥反應綜合征，累及體內多種器官，可發展為多器官功能衰竭、膿毒性休克。急性肺損傷是膿毒癥最常見的并發癥，其在膿毒癥患者中發生率很高，是加速患者死亡的重要因素［1］。膿毒癥發生時，大量炎癥細胞在肺組織聚集、浸潤，活性氧、自由基過量產生，炎癥細胞因子表達增加，Th17/Treg平衡向Th17轉移，引發嚴重氧化應激和炎癥反應，造成肺組織損傷，因此，抑制炎癥，降低氧化應激水平是治療膿毒癥急性肺損傷的有效手段［2-3］。TLR4/NF-κB信號通路參與介導氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等生理病理過程，下調該信號表達可通過抑制Th17細胞分化，促使Treg細胞分化，改善Th17/Treg失衡來減輕結腸炎小鼠的結腸炎癥，還可通過抑制炎癥反應，提高機體抗氧化作用來減輕急性肺損傷［4-6］，因此TLR4/NF-κB通路可能是膿毒癥急性肺損傷治療靶點之一。黃芩苷（Baicalin，BA）屬于黃酮類化合物，是中藥黃芩的主要有效成分，可降低炎癥因子表達，抑制炎癥，減輕關節炎大鼠關節病理損傷，并可改善LPS誘導的小鼠肺炎癥狀［7-8］；BA還能抑制Th17細胞分化，促進Treg激活，減輕二氧化硅誘導的肺纖維化和肺組織炎癥損傷［9］，但BA對膿毒癥急性肺損傷小鼠TLR4/NF-κB通路及Treg/Th17平衡的影響目前還未有明確報道，本文通過誘導復制膿毒癥急性肺損傷小鼠模型，對此進行初步研討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物BALB/c小鼠購自武漢生物制品研究所有限責任公司，生產許可證號：SCXK（鄂）2017-0013，清潔級，雄性，體質量18～22 g。飼養于本院動物房，自然照明，溫度25℃，相對濕度50%，自由進食、飲水，環境保持清潔、安靜，通風良好。

1.1.2主要藥品及試劑BA（BR：90%，JK30647）由武漢瓊格生物科技有限公司提供；脂多糖（CD-07378-ML）由武漢純度生物科技有限公司提供；地塞米松（50-02-2）由武漢澤諾生物科技有限公司提供；SOD檢測試劑盒（A001-3-2）、MDA檢測試劑盒（A003-1-2）由南京建成生物工程研究所提供；總蛋白提取試劑盒（BB-3101）、核蛋白提取試劑盒（BB-3102）由上海貝博生物科技有限公司提供；紅細胞裂解液（R1010）由北京索萊寶科技有限公司提供；標記藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）的抗小鼠IL-17抗體（12-9171-80）、標記異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）的抗小鼠CD4抗體（11-0041-82）由美國Invitrogen公司提供；小鼠TNF-α ELISA試 劑 盒（ab212073）、小 鼠IL-6 ELISA試 劑 盒（ab203360）、小鼠IL-17 ELISA試劑盒（ab210898）、小鼠TGF-β ELISA試劑盒（ab119557）、HE染色試劑盒（ab245880）、兔源GAPDH一抗（ab9485）、BCA蛋白檢測試劑盒（ab102536）、兔源TLR4一抗（ab217274）、兔 源MyD88一 抗（ab219413）、兔 源PCNA一 抗（ab92552）、兔源NF-κB p65一抗（ab16502）、羊抗兔二抗（ab150077）由美國Abcam公司提供。

1.1.3主要儀器全自動血氣分析檢測儀由德國MICROM公司提供；酶標儀（Elx800）由美國Bio-Rad公司提供；流式細胞儀（BD LSRFortessaTM）由美國BD公司提供；光學顯微鏡（E200）由日本尼康公司提供；切片機（CM3050S）由德國Leica公司提供；凝膠成像儀（GelSMART）由北京大龍興創實驗儀器有限公司提供；垂直電泳儀及轉移系統由北京六一生物科技有限公司提供等。

1.2方法

1.2.1膿毒癥急性肺損傷小鼠模型建立及分組給藥將脂多糖溶于0.9%氯化鈉溶液中，配制為5 mg/ml的溶液，以10 mg/kg腹腔注射建立膿毒癥急性肺損傷小鼠模型［10］。共造模65只，成功60只，隨機分為模型組、地塞米松組、BA低、中、高劑量組，每組12只，另取12只小鼠腹腔注射等劑量0.9%氯化鈉溶液，設定為對照組。

參照文獻［11］，以0.9%氯化鈉溶液溶解BA、地塞米松后混勻，制得濃度為7.5、15、30 mg/ml的BA藥液和濃度為0.72 mg/ml的地塞米松藥液，BA低、中、高劑量組分別以10 ml/kg灌胃3種濃度的BA藥液，同時腹腔注射10 ml/kg劑量的0.9%氯化鈉溶液；地塞米松組腹腔注射7.2 mg/kg劑量的地塞米松藥液［12］，同時灌胃10 ml/kg劑量的0.9%氯化鈉溶液；模型組和對照組灌胃10 ml/kg劑量的0.9%氯化鈉溶液，同時腹腔注射10 ml/kg劑量的0.9%氯化鈉溶液，均1次/d，持續14 d。

1.2.2標本采集及肺W/D檢測第14天給藥后24 h，以乙醚氣體麻醉小鼠，采用頸椎脫臼法處死后解剖，采集腹主動脈血3 ml，取1.0 ml進行動脈血氣指標檢測，再取1.0 ml適量紅細胞裂解液后檢測外周血Th17/Treg，剩余1 ml靜置15 min，4℃、3 000 r/min，離心15 min，收集上清液，獲得血清保存在-80℃中備用。分離雙肺，左右肺剪開，左肺稱量濕重，置于60℃烘烤箱中烘干，稱量干重，計算濕干比，即W/D；右肺剪取約1.0 g組織，剪碎，采用總蛋白提取試劑盒和核蛋白提取試劑盒分別提取0.5 g肺組織中總蛋白與核蛋白，通過BCA法分別測定兩者總濃度后煮沸變性，在-80℃保存備用；剩余右肺組織經0.9%氯化鈉溶液漂洗后，進行固定、脫水、透明、包埋處理，最后將組織塊放入切片機中切片，得到厚度為4 μm的薄片備用。

1.2.3小鼠動脈血氣指標檢測將1.2.2中動脈血置于全自動血氣分析檢測儀，參照儀器說明書對動脈血二氧化碳分壓（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）與動脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）進行檢測，計算氧合指數（oxygenation index，OI），OI=PaO2/0.21。

1.2.4小鼠肺組織病理形態檢測取出1.2.2中肺組織薄片，浸入二甲苯中脫蠟處理，然后經水化后以試劑盒進行HE染色，具體步驟參照其說明書進行，將染色后的肺組織薄片以蒸餾水快速漂洗后脫水、透明，最后小心鋪上載玻片后封片，于光學顯微鏡下觀察肺組織染色情況并拍照。

1.2.5小鼠外周血Th17/Treg檢測1.2.2中加入適量紅細胞裂解液的外周血，冰水浴中30 min，4℃下1 000 g離心3 min獲得細胞沉淀，經預冷的PBS洗滌后重懸，計數后將其細胞密度調至1×106個/ml，取1 ml細胞懸液，加入標記PE的抗小鼠IL-17抗體（Th17細胞標志）與標記FITC的抗小鼠CD4抗體（Treg細胞標志），混勻后4℃避光孵育20 min，4℃下1 000 g離心3 min獲得細胞沉淀，經預冷的PBS洗滌、重懸并混勻，采用流式細胞儀測出Treg與Th17細胞比例，得到Th17/Treg。

1.2.6小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β及肺組織SOD、MDA水平檢測1.2.2中蛋白樣品液和血清于4℃冰箱中解凍，各取400 μl以各自試劑盒測定其中TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β、SOD及MDA含量，參照說明書進行具體操作，剩余肺組織蛋白樣品液保存在-80℃中，進行后續蛋白表達檢測。

1.2.7小鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達檢測1.2.5中剩余蛋白樣品液置于4℃冰箱中解凍，煮沸6 min后，分別取20 μg各組蛋白上樣，做電泳實驗分離蛋白，然后馬上濕轉法轉移蛋白，以5%脫脂牛奶室溫封閉所得硝酸纖維膜上蛋白2 h，以薄刀片切下NF-κB p65、TLR4、MyD88、GAPDH、PCNA 5個目的蛋白條帶，以稀釋比例均為1∶2 000的相對應兔源一抗溶液4℃孵育9 h，TBST緩沖液洗3次后以羊抗兔二抗溶液室溫孵育90 min（稀釋比例為1∶1 500），ECL顯影液顯色后拍照，采用Image J軟件分析獲得各蛋白圖像灰度值，以GAPDH作為總蛋白內參，PCNA作為核蛋白內參，定量后統計獲得各目的蛋白相對表達。

1.3統計學分析以±s表示計量資料，用統計學軟件SPSS20.0對上述數據進行統計分析，多組間比較進行單因素方差分析，進一步兩兩比較行LSD-t檢驗，P＜0.05表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1膿毒癥急性肺損傷小鼠模型的建立腹腔注射脂多糖24 h后，小鼠毛色干枯，食欲減退，呼吸困難，發生喘息，檢測小鼠動脈血氣相關指標顯示，與對照組相比，模型組小鼠PaCO2明顯升高（P＜0.05），PaO2、OI明顯降低（P＜0.05），表明模型建立成功。

2.2BA對小鼠肺W/D的影響與對照組相比，模型組小鼠肺W/D明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組小鼠肺W/D降低，且BA低、中、高劑量組三組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）。BA高劑量組與地塞米松組相比，小鼠肺W/D差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠肺W/D比較（±s，n=12）Tab.1 Comparison of lung W/D of mice in each group（±s，n=12）

表1 各組小鼠肺W/D比較（±s，n=12）Tab.1 Comparison of lung W/D of mice in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with BA low dose group，3）P＜0.05；compared with BA medium dose group，4）P＜0.05.

Groups Control Model BA low dose BA medium dose BA high dose Dexamethasone Lung W/D 4.12±0.23 6.65±0.511）5.74±0.252）5.03±0.222）3）4.17±0.282）3）4）4.18±0.262）3）4）

2.3BA對小鼠動脈血氣相關指標的影響與對照組相比，模型組小鼠PaCO2明顯升高（P＜0.05），PaO2、OI明顯降低（P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組小鼠PaCO2降低，PaO2、OI升高，且BA低、中、高劑量組三組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）。BA高劑量組與地塞米松組相比，各指標間差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組小鼠動脈血氣相關指標比較（±s，n=12，mmHg）Tab.2 Comparison of arterial blood gas related indexes of mice in each group（±s，n=12，mmHg）

表2 各組小鼠動脈血氣相關指標比較（±s，n=12，mmHg）Tab.2 Comparison of arterial blood gas related indexes of mice in each group（±s，n=12，mmHg）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with BA low dose group，3）P＜0.05；compared with BA medium dose group，4）P＜0.05.

Groups Control Model BA low dose BA medium dose BA high dose Dexamethasone PaO2 97.64±6.13 54.56±2.971）67.38±3.132）82.82±3.262）3）95.96±4.972）3）4）96.24±5.362）3）4）PaCO2 34.72±1.27 59.73±2.831）50.26±2.542）42.85±2.162）3）35.21±1.872）3）4）35.28±1.962）3）4）OI 464.95±16.45 259.81±9.141）320.86±13.242）394.38±15.352）3）456.95±15.892）3）4）458.29±17.132）3）4）

2.4BA對小鼠肺組織病理形態的影響對照組小鼠肺組織結構完好，無損傷。模型組小鼠肺泡萎縮、肺泡壁變厚，肺間質充血、水腫，并伴隨大量炎癥細胞浸潤，肺組織發生嚴重病理損傷。與模型組相比，各給藥組小鼠肺組織病理損傷均有減輕，且減輕程度隨BA劑量升高而增強。BA高劑量組與地塞米松組小鼠肺組織基本恢復正常，兩者相比，肺組織病理形態無明顯差異，見圖1。

圖1 HE染色檢測各組小鼠肺組織病理形態（×400）Fig.1 HE staining was used to detect pathological morphology of lung tissue of mice in each group（×400）

2.5BA對小鼠肺組織SOD、MDA水平的影響與對照組相比，模型組小鼠肺組織SOD水平明顯降低（P＜0.05），MDA水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組小鼠肺組織SOD水平升高，MDA水平降低，且BA不同劑量組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）。BA高劑量組與地塞米松組相比，各指標間差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組小鼠肺組織SOD、MDA水平比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison of SOD and MDA levels in lung tissue of mice in each group（±s，n=12）

表3 各組小鼠肺組織SOD、MDA水平比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison of SOD and MDA levels in lung tissue of mice in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with BA low dose group，3）P＜0.05；compared with BA medium dose group，4）P＜0.05.

Groups Control Model BA low dose BA medium dose BA high dose Dexamethasone SOD/（U·mg-1）435.23±65.01 278.63±49.321）337.25±51.682）378.04±54.242）3）429.18±63.432）3）4）430.02±66.252）3）4）MDA/（nmol·mg-1）2.13±0.14 4.56±0.371）3.74±0.302）3.01±0.252）3）2.20±0.162）3）4）2.18±0.192）3）4）

2.6BA對小鼠外周血Th17/Treg免疫平衡的影響與對照組相比，模型組小鼠外周血Th17/Treg明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組小鼠外周血Th17/Treg降低，且BA不同劑量組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）。BA高劑量組與地塞米松組相比，外周血Th17/Treg差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、表4。

圖2 流式細胞檢測各組小鼠外周血Th17、Treg亞群比例Fig.2 Flow cytometry was used to detect proportion of Th17 and Treg subsets in peripheral blood of mice in each group

表4 各組小鼠外周血Th17/Treg比較（±s，n=12）Tab.4 Comparison of Th17/Treg in peripheral blood of mice in each group（xˉ±s，n=12）

表4 各組小鼠外周血Th17/Treg比較（±s，n=12）Tab.4 Comparison of Th17/Treg in peripheral blood of mice in each group（xˉ±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with BA low dose group，3）P＜0.05；compared with BA medium dose group，4）P＜0.05.

Groups Control Model BA low dose BA medium dose BA high dose Dexamethasone Th17/Treg 0.17±0.04 0.77±0.101）0.57±0.082）0.38±0.052）3）0.19±0.022）3）4）0.18±0.032）3）4）

2.7BA對小鼠血清細胞因子TNF-α、IL-6、IL-17及TGF-β水平的影響與對照組相比，模型組小鼠血清細胞因子TNF-α、IL-6、IL-17水平明顯升高（P＜0.05），TGF-β水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組小鼠血清細胞因子TNF-α、IL-6、IL-17水平降低，TGF-β水平升高，且BA低、中、高劑量組三組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）。BA高劑量組與地塞米松組相比，各指標間差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

表5 各組小鼠血清細胞因子TNF-α、IL-6、IL-17及TGF-β水平比較（±s，n=12，pg/ml）Tab.5 Comparison of serum levels of cytokines TNF-α，IL-6，IL-17 and TGF-β in each group（±s，n=12，pg/ml）

表5 各組小鼠血清細胞因子TNF-α、IL-6、IL-17及TGF-β水平比較（±s，n=12，pg/ml）Tab.5 Comparison of serum levels of cytokines TNF-α，IL-6，IL-17 and TGF-β in each group（±s，n=12，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with BA low dose group，3）P＜0.05；compared with BA medium dose group，4）P＜0.05.

Groups Control Model BA low dose BA medium dose BA high dose Dexamethasone TNF-α 37.62±2.52 107.57±12.151）79.84±7.682）58.53±4.472）3）39.01±3.022）3）4）38.97±2.982）3）4）IL-6 34.07±5.12 87.58±10.361）70.23±7.522）46.35±6.042）3）35.02±5.022）3）4）34.87±5.032）3）4）IL-17 50.63±4.07 178.46±11.231）130.95±8.122）90.47±7.092）3）51.45±5.052）3）4）51.32±5.132）3）4）TGF-β 489.46±15.11 283.42±8.321）354.13±10.112）410.37±12.252）3）484.16±16.032）3）4）485.27±17.052）3）4）

2.8BA對小鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達的影響與對照組相比，模型組小鼠肺組織TLR4、MyD88、核NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組小鼠肺組織TLR4、MyD88、核NF-κB p65蛋白表達水平降低，且BA低劑量組、BA中劑量組、BA高劑量組三組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）。BA高劑量組與地塞米松組相比，各指標之間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3、表6。

圖3 免疫印跡檢測各組小鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達Fig.3 Expression of TLR4/NF-κB pathway related proteins in lung tissue of mice in each group was detected by Western blot

表6 各組小鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關蛋白相對表達水平比較（xˉ±s，n=12）Tab.6 Comparison of relative expression levels of TLR4/NF-κB pathway related proteins in lung tissues of mice in each group（±s，n=12）

表6 各組小鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關蛋白相對表達水平比較（xˉ±s，n=12）Tab.6 Comparison of relative expression levels of TLR4/NF-κB pathway related proteins in lung tissues of mice in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with BA low dose group，3）P＜0.05；compared with BA medium dose group，4）P＜0.05.

Groups Control Model BA low dose BA medium dose BA high dose Dexamethasone TLR4/GAPDH 0.20±0.04 1.97±0.341）1.18±0.252）0.71±0.122）3）0.21±0.052）3）4）0.22±0.042）3）4）MyD88/GAPDH 0.09±0.02 1.28±0.211）0.69±0.162）0.36±0.082）3）0.11±0.032）3）4）0.10±0.022）3）4）Nuclear NF-κB p65/PCNA 0.21±0.05 2.34±0.411）1.49±0.312）0.92±0.232）3）0.23±0.062）3）4）0.22±0.052）3）4）

3 討論

膿毒癥在臨床中屬于危急重癥，病情進展迅速，患者死亡率高，合并急性肺損傷是膿毒癥患者最常見的并發癥，可導致患者肺功能衰竭，嚴重威脅其生命安全，因此防治急性肺損傷是臨床治療膿毒癥需解決的重點措施［1，13］。Th17/Treg平衡向Th17轉移失衡可造成免疫功能障礙，Th17合成分泌的促炎因子IL-17水平升高，Treg合成分泌的抑炎因子TGF-β水平降低，誘導劇烈的炎癥與氧化應激，是引發急性肺損傷的關鍵致病基礎［2-3，14］。脂多糖屬于一種內毒素，腹腔注射后會引發嚴重的炎癥及氧化應激，導致休克、多器官功能衰竭等癥狀，與人類膿毒癥的病理過程相似，常用于制備膿毒癥動物模型［15］。

本研究采用腹腔注射脂多糖的方法誘導建立膿毒癥急性肺損傷小鼠模型，結果顯示，模型組小鼠肺泡萎縮，肺泡壁變厚，肺間質充血、水腫，并伴隨大量炎癥細胞浸潤，肺組織呈現明顯的病理損傷，肺W/D、動脈血氣指標PaCO2、Th17/Treg、血清促炎因子IL-6、IL-17與TNF-α、肺組織氧化應激標志物MDA含量明顯升高，SOD含量、血清抑炎因子TGF-β水平明顯降低，另外動脈血氣指標PaO2、OI亦明顯降低，表明脂多糖可上調促炎因子表達，引發嚴重的炎癥反應，提高氧化應激水平，導致肺水腫和肺組織損傷，損害肺功能，提示模型建立成功。

BA是黃芩根部含有的活性成分，具有降血脂、消炎抗菌、抗氧化、增強免疫力等廣泛的藥理功效，可抑制冠心病和類風濕關節炎患者機體炎癥反應，改善其臨床癥狀，BA還可顯著降低新生大鼠肺組織Akt和NF-κB P65蛋白磷酸化水平，減輕其低氧誘導的肺損傷［16-17］。本研究結果顯示，以BA處理膿毒癥急性肺損傷小鼠，可減輕其肺組織病理損傷，降低肺W/D、動脈血氣指標PaCO2、Th17/Treg、血清TNF-α、IL-6及IL-17水平、肺組織MDA水平，升高動脈血氣指標PaO2、OI、血清TGF-β水平、肺組織SOD水平，且呈劑量依賴性，表明BA可降低膿毒癥小鼠氧化應激水平，抑制炎癥反應，促使Treg/Th17平衡向Treg偏移，緩解肺水腫，減輕肺組織損傷，改善肺功能，并隨劑量升高而作用增強。

TLR4/NF-κB通路是調控氧化應激、炎癥、免疫調節的關鍵信號通路，下調TLR4表達可抑制NF-κB向核內轉移，調控Th17/Treg免疫平衡，修復結腸炎小鼠體內其向Th17的偏移，還能阻止炎癥因子表達，進而抑制炎癥，減輕急性肺損傷，并改善慢性阻塞性肺疾病癥狀，還可修復小鼠Th17/Treg平衡向Th17偏移，緩解結腸炎小鼠臨床癥狀［4-6，18］，由此推測調控TLR4/NF-κB信號傳導可能是BA減輕膿毒癥小鼠急性肺損傷的藥理機制，本研究結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠肺組織MyD88、TLR4及核NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高，經BA處理后，上述蛋白表達水平降低，且BA各組之間呈劑量依賴性，表明BA可抑制TLR4/NF-κB通路表達，減輕膿毒癥小鼠急性肺損傷，修復其肺功能。

綜上所述，BA可抑制TLR4表達，減弱NF-κB核轉移，降低氧化應激水平，阻止炎癥發生及進展，修復Treg/Th17平衡向Th17的偏移，緩解肺水腫及肺組織損傷，減輕肺功能衰竭癥狀，下調TLR4/NF-κB信號通路表達可能是其起效的分子機制之一，但本研究只做了初步研究，其更確切詳盡的作用機制還需后續進行深入研究。