三七丹參片通過免疫調節(jié)發(fā)揮對病毒性心肌炎小鼠的治療作用①

吳志煥（河北工程技術學院，石家莊050091）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由病毒感染引起的心肌炎性病變［1］。柯薩奇病毒B3（Coxsackie virus B3，CVB3）是VMC發(fā)生的主要病原體［2］。目前研究認為，CVB3直接攻擊心肌細胞，引起的免疫病理損傷及心肌炎癥反應，是導致VMC心肌細胞凋亡及壞死的主要原因［3］。故免疫治療是VMC的主要治療方式［4］。中醫(yī)藥在調節(jié)機體免疫力的同時還具有抗病毒作用［5］。近來研究發(fā)現，三七丹參片具有抗心肌缺血/再灌注損傷功能，還可增強機體免疫力［6-7］。但三七丹參片是否能通過調節(jié)機體免疫來治療VMC目前尚不明確。本研究擬建立VMC小鼠模型，從免疫調節(jié)方面對此進行驗證，以期為三七丹參片的開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物來源健康雄性BALB/c小鼠90只，4～8周齡，體質量16～18 g，購自吉林大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（吉）2020-0003。本實驗由河北醫(yī)科大學實驗動物福利倫理委員會（IACUC）批準（批號：IACUC-105061），并遵循《實驗動物使用指南》，符合3R原則。CVB3懸液由中科院武漢病毒研究所王漢中教授提供。

1.1.2主要試劑及儀器三七丹參片（貴州德良方藥業(yè)股份有限公司，批號：Z20050068，規(guī)格：0.5 g/片）；利巴韋林（上海寶曼生物科技有限公司；批號：D3360）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，貨號：G1120）；TUNEL檢測試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，貨號：XYA113）；肌酸激酶同工酶ELISA試劑盒（滁州仕諾達生物科技有限公司，貨號：SND-M192）；肌鈣蛋白ELISA試劑盒（杭州鉑賽生物科技有限公司，貨號：MM-0427M1）、肌紅蛋白ELISA試劑盒（上海西格生物科技有限公司，貨號：XG-E101848）；IL-17、IL-10、維甲酸相關孤核受體γt（retinoic acid-related orphan receptor γt，RoRγt）、Treg轉錄因子叉頭框蛋白P3（forkhead box protein 3，Foxp3）、泛素蛋白酶2（SUMO protease 2，Senp2）、Toll樣受體-4（Toll-like receptor-4，TLR4）、果蠅雙翅邊緣缺刻同基因1（drosophila double-wing edge notch homologous gene 1，Notch1）等抗體（美國Abcam公司，貨號：ab79056、ab225820、ab41174、ab215206、ab58418、ab217274、ab52627）；自動凝膠成像分析系統(tǒng)（美國伯樂公司，型號：Gel Doc EZ）；熒光顯微鏡（美國奧林巴斯公司，型號：CX43）；超聲診斷掃描儀（加拿大VisualSonics公司，RZ-VEVO 3100）。

1.2方法

1.2.1病毒性心肌炎小鼠模型的建立及分組給藥取BALB/c小鼠，參照文獻［8］腹腔注射CVB3病毒懸液100 μl，連續(xù)3 d，1次/d，制備VMC模型。超聲心動圖檢測心功能指標心臟射血分數（ejection fraction，EF）和心率（heart rate，HR），HR及EF異常降低視為造模成功。共造模成功75只小鼠，隨機分為模型組、三七丹參片低（0.43 g/kg）、中（0.86 g/kg）、高（1.72 g/kg）劑量組及陽性對照組（利巴韋林，1 mg/kg），每組15只，另取15只小鼠，不做任何處理，正常喂養(yǎng)，作為正常對照組。三七丹參片參照文獻［7］設置劑量并進行配制后，灌胃給藥，1次/d；利巴韋林參照文獻［8］經腹腔注射給藥1次；正常對照組及模型組灌胃及腹腔注射等量相應溶劑（羧甲基纖維素鈉、生理鹽水），各組均連續(xù)給藥7 d。給藥期間，統(tǒng)計小鼠死亡及飲食活動等一般狀況。

1.2.2小鼠心功能指標檢測參照文獻［9］用超聲心動圖檢測小鼠心臟EF、HR。

1.2.3小鼠血清心肌損傷相關指標檢測麻醉小鼠，取腹主動脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，取血清，按ELISA試劑盒說明書檢測肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白、肌紅蛋白水平。

1.2.4小鼠免疫功能檢測麻醉處死后解剖小鼠，將心臟組織分成兩部分，一部分置于-80℃冰箱保存，另一部分置于4%多聚甲醛中固定備用。取小鼠新鮮脾臟參照文獻［8，10］方法用流式細胞儀檢測小鼠脾臟中CD4+T/CD8+T、Th17/Treg。

1.2.5HE及TUNEL染色檢測心肌組織病理變化和心肌細胞凋亡率取1.2.4項下4%多聚甲醛中固定的組織標本，常規(guī)處理后切成5 μm的切片。取部分切片按HE及TUNEL試劑盒說明書方法分別染色、封片后，置于顯微鏡下觀察組織變化。采用Image J軟件檢測凋亡細胞數目，并計算細胞凋亡率。

1.2.6免疫組化法檢測心肌組織RoRγt、Foxp3陽性表達水平取1.2.5項下部分切片，抗原滅活修復后，加入一抗（RoRγt、Foxp3，1∶500）室溫孵育4 h后，加入二抗（1∶500）室溫孵育，DAB顯色后置于顯微鏡下觀察拍照，并采用Image J軟件檢測心肌組織中各蛋白陽性表達的平均光密度值。

1.2.7免疫熒光法檢測巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）在心肌組織中的表達水平取1.2.6項下剩余組織切片，經曲拉通透化后，加入一抗（兔抗MIF，1∶500）4℃孵育過夜，加入TRITC標記的二抗（山羊抗兔IgG，1∶200）孵育顯色后，熒光顯微鏡下觀察并拍照，以Image J圖像分析系統(tǒng)檢測MIF表達熒光水平。

1.2.8Western blot檢測心肌組織中IL-17、IL-10、Senp2、TLR4、Notch1蛋白表達取1.2.4中-80℃保存的心肌組織300 mg，4℃解凍后，冰上勻漿、離心分離后，取上清液，BCA法定量蛋白濃度后，取100 μg蛋白進行電泳、轉膜反應，加入IL-17、IL-10、Senp2、TLR4、Notch1一抗（1∶2 000）、β-actin內參抗體（1∶3 000），4℃孵育過夜后，加入二抗（1∶2 000），37℃孵育4 h后，采用增強化學發(fā)光法顯色，以化學發(fā)光儀觀察條帶并拍照，并以Image J軟件分析各組蛋白相對表達水平。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS21.0軟件進行數據統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1三七丹參片對小鼠一般行為的影響正常對照組小鼠無死亡，行為活動正常。模型組小鼠有8只死亡，活動量及飲食減少，解剖后觀察心臟呈白色點狀或條索狀病變。丹參三七片低、中、高劑量組小鼠死亡數分別為5只、3只、1只，陽性對照組有3只小鼠死亡，且各治療組小鼠飲食及活動量均有所增加。

2.2三七丹參片對小鼠心功能的影響與正常對照組相比，模型組小鼠心臟EF、HR降低（P＜0.05）；與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照組HR、EF升高（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高上述指標變化越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1、表1。

圖1 小鼠心臟超聲心動圖Fig.1 Echocardiogram of mice heart

表1 各組小鼠心臟EF、HR比較（±s）Tab.1 Comparison of heart EF and HR of mice in each group（±s）

表1 各組小鼠心臟EF、HR比較（±s）Tab.1 Comparison of heart EF and HR of mice in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 HR（Times/min）422.28±20.21 212.82±10.841）286.17±14.362）340.12±15.942）3）387.58±19.722）3）4）338.39±14.432）3）EF（%）78.93±3.28 51.60±2.461）59.43±1.382）66.57±3.012）3）74.78±3.122）3）4）66.19±3.052）3）

2.3三七丹參片對小鼠心肌損傷標志物的影響與正常對照組相比，模型組小鼠心肌損傷標志物肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白、肌紅蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照組心肌損傷標志物降低（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高上述指標變化越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠心肌損傷標志物變化（±s）Tab.2 Changes of myocardial injury markers of mice in each group（±s）

表2 各組小鼠心肌損傷標志物變化（±s）Tab.2 Changes of myocardial injury markers of mice in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 Creatine kinase isoenzyme/（U·ml-1）30.23±1.64 137.07±4.921）103.39±9.532）76.12±2.282）3）45.11±2.022）3）4）77.23±2.112）3）Myoglobin/（μg·L-1）80.02±4.01 584.12±10.141）403.26±13.122）223.53±10.142）3）164.39±8.132）3）4）228.09±10.352）3）Troponin/（μg·L-1）15.23±1.34 59.37±4.761）50.27±3.122）38.82±2.042）3）22.19±1.132）3）4）38.15±2.162）3）

2.4三七丹參片對小鼠心肌組織病理變化及心肌細胞凋亡率的影響正常對照組小鼠心肌細胞結構正常，無損傷。模型組小鼠心肌組織橫紋模糊，心肌細胞水腫、胞漿疏松且淡染，炎癥細胞浸潤明顯，心肌細胞凋亡率高于正常對照組（P＜0.05）。與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照組小鼠心肌組織橫紋逐漸清晰，心肌細胞壞死及炎癥浸潤等病理損傷逐漸緩解，心肌細胞凋亡率低于模型組（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高心肌損傷越輕，凋亡率降低越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

表3 各組小鼠心肌細胞凋亡率比較（±s）Tab.3 Comparison of cardiomyocyte apoptosis rate of mice in each group（±s）

表3 各組小鼠心肌細胞凋亡率比較（±s）Tab.3 Comparison of cardiomyocyte apoptosis rate of mice in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 Apoptosis rate（%）9.19±0.91 45.63±2.241）36.25±1.492）28.18±1.042）3）16.24±0.722）3）4）29.29±1.432）3）

圖2 各組小鼠心肌HE及TUNEL染色圖（×200）Fig.2 HE and TUNEL staining of myocardium of mice in each group（×200）

2.5三七丹參片對小鼠免疫功能的影響與正常對照組相比，模型組小鼠Th17/Treg、CD4+T/CD8+T升高（P＜0.05）；與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照 組Th17/Treg、CD4+T/CD8+T降低（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高上述指標變化越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3、表4。

表4 各組Th17/Treg、CD4+T/CD8+T比較（±s）Tab.4 Comparison of Th17/Treg and CD4+T/CD8+T in each group（±s）

表4 各組Th17/Treg、CD4+T/CD8+T比較（±s）Tab.4 Comparison of Th17/Treg and CD4+T/CD8+T in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 Th17/Treg 0.16±0.04 4.12±0.461）3.36±0.352）2.09±0.242）3）0.99±0.092）3）4）2.11±0.262）3）CD4+T/CD8+T 1.42±0.12 2.33±0.201）1.91±0.142）1.71±0.112）3）1.57±0.102）3）4）1.72±0.102）3）

圖3 小鼠脾臟淋巴液中Th17及Treg轉錄因子Foxp3流式檢測結果Fig.3 Flow cytometric detection results of Th17 and Treg transcription factor Foxp3 in mice spleen lymph

2.6三七丹參片對小鼠心肌組織MIF表達的影響與正常對照組相比，模型組小鼠MIF表達升高（P＜0.05）。與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照組小鼠MIF表達降低（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高上述指標變化越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4、表5。

表5 各組小鼠MIF表達比較（±s）Tab.5 Comparison of MIF expression in mice of each group（±s）

表5 各組小鼠MIF表達比較（±s）Tab.5 Comparison of MIF expression in mice of each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 MIF 1.09±0.11 2.93±0.241）2.35±0.242）1.88±0.182）3）1.44±0.122）3）4）1.89±0.152）3）

圖4 各組小鼠心肌組織MIF免疫熒光染色圖（×400）Fig.4 MIF immunofluorescence staining of myocardial tissue of mice in each group（×400）

2.7三七丹參片對小鼠心肌組織RoRγt、Foxp3陽性表達的影響與正常對照組相比，模型組小鼠心肌細胞RoRγt陽性表達升高，Foxp3陽性表達降低（P＜0.05）。與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照組小鼠RoRγt陽性表達降低，Foxp3陽性表達升高（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高上述指標變化越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5、表6。

表6 各組小鼠心肌組織RoRγt、Foxp3陽性表達水平比較（±s）Tab.6 Comparison of RoRγt and Foxp3 positive expression levels in myocardial tissue of mice in each group（±s）

表6 各組小鼠心肌組織RoRγt、Foxp3陽性表達水平比較（±s）Tab.6 Comparison of RoRγt and Foxp3 positive expression levels in myocardial tissue of mice in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 RoRγt 4.41±0.14 36.91±1.281）28.58±1.152）20.97±1.052）3）12.47±0.622）3）4）20.49±0.042）3）Foxp3 25.36±1.33 2.28±0.161）7.48±0.582）10.29±1.052）3）18.27±1.322）3）4）10.08±1.082）3）

圖5 各組小鼠心肌組織RoRγt、Foxp3免疫組化染色圖（×400）Fig.5 Immunohistochemical staining of RoRγt and Foxp3 in myocardial tissue of mice in each group（×400）

2.8三七丹參片對心肌組織中IL-17、IL-10、Senp2、TLR4、Notch1蛋白表達的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠心肌組織IL-17、IL-10、TLR4、Notch1蛋白表達升高（P＜0.05），Senp2蛋白表達降低（P＜0.05）。與模型組相比，三七丹參片各劑量組及陽性對照組小鼠IL-17、IL-10、TLR4、Notch1蛋白表達降低（P＜0.05），Senp2蛋白表達升高（P＜0.05），且三七丹參片劑量越高上述指標變化越明顯（P＜0.05）；陽性對照組與三七丹參片中劑量組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表7、圖6。

表7 各組小鼠心肌組織IL-17、IL-10、TLR4、Notch1、Senp2蛋白表達比較（±s）Tab.7 Comparison of protein expressions of IL-17，IL-10，TLR4，Notch1 and Senp2 in myocardial tissue of mice in each group（±s）

表7 各組小鼠心肌組織IL-17、IL-10、TLR4、Notch1、Senp2蛋白表達比較（±s）Tab.7 Comparison of protein expressions of IL-17，IL-10，TLR4，Notch1 and Senp2 in myocardial tissue of mice in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with low dose Sanqi Danshen Tablet group，3）P＜0.05；compared with medium dose Sanqi Danshen Tablet group，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Low dose Sanqi Danshen Tablet Medium dose Sanqi Danshen Tablet High dose Sanqi Danshen Tablet Positive control n 15 7 10 12 14 12 IL-17/β-actin 1.05±0.09 2.84±0.281）2.41±0.262）1.93±0.192）3）1.58±0.152）3）4）1.99±0.192）3）IL-10/β-actin 1.13±0.10 2.73±0.261）2.22±0.242）1.86±0.182）3）1.47±0.142）3）4）1.84±0.172）3）TLR4/β-actin 1.02±0.12 2.99±0.251）2.52±0.232）2.06±0.222）3）1.65±0.172）3）4）2.08±0.262）3）Notch1/β-actin 1.01±0.10 2.73±0.241）2.12±0.252）1.72±0.172）3）1.45±0.142）3）4）1.78±0.172）3）Senp2/β-actin 1.19±0.11 0.13±0.041）0.32±0.052）0.62±0.062）3）0.85±0.082）3）4）0.60±0.052）3）

圖6 各組小鼠心 肌 組織IL-17、IL-10、TLR4、Notch1、Senp2蛋白表達免疫印跡圖Fig.6 Western blot analysis of protein expressions of IL-17，IL-10，TLR4，Notch1 and Senp2 in myocardial tissue of mice in each group

3 討論

新型冠狀病毒、腸道病毒、腺病毒、流感病毒等均可誘發(fā)VMC［11-12］。CVB3誘導的VMC在臨床上最為常見，嚴重時可導致患者出現心力衰竭或死亡等［13］。本研究通過腹腔注射CVB3建立VMC小鼠模型后發(fā)現，小鼠死亡率增高、心肌細胞壞死及炎癥浸潤現象嚴重，并伴隨心功能指標心臟EF、HR的明顯降低，以及心肌損傷標志物水平的異常升高，提示造模成功。大量研究發(fā)現，三七丹參片中的丹參、三七具有抗心肌損傷作用，且馬婧等［14］發(fā)現丹參、三七也是抗新冠病毒的潛在藥物，提示三七丹參片也可能是緩解VMC心肌損傷的潛在藥物。本研究發(fā)現，隨著三七丹參片劑量的升高，VMC小鼠死亡逐漸減少，心肌損傷及炎癥浸潤緩解明顯，心功能損傷也得到顯著改善，且三七丹參片高劑量組改善效果優(yōu)于中、低劑量組及陽性對照組，證實了三七丹參片也可緩解CVB3感染誘發(fā)的心肌損傷，對VMC有較好的改善作用。

病毒感染攻擊心肌等宿主細胞時，會誘發(fā)機體一系列的免疫應答及炎癥反應。研究發(fā)現CVB感染宿主細胞后可導致反應性T細胞和抗體應答的產生，而心臟損傷后自身抗原的釋放也可誘導抗原致敏的CD4+T細胞激活，CD4+T細胞激活后可通過激活巨噬細胞、中性粒細胞浸潤加重心臟損害［15］；CHEN等［16］發(fā)現病毒感染產生的CD4+T和CD8+T可持續(xù)存在并導致心臟慢性炎癥的發(fā)生，而調控CD4+T/CD8+T平衡可減輕VMC心肌損傷。免疫細胞中的Th17可促進巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤而發(fā)揮促炎作用，Treg可抑制炎癥反應并維持免疫平衡，Treg與Th17比例失衡也提示機體免疫功能的紊亂。DAI等［17］發(fā)現，VMC小鼠體內存在Treg/Th17失衡；呂愛婷等［8］發(fā)現調節(jié)Treg/Th17平衡可緩解VMC小鼠心肌損傷，提示CD4+T、CD8+T、Th17、Treg等是參與機體免疫應答的關鍵因子，且與VMC的發(fā)生發(fā)展關系密切。本研究發(fā)現VMC小鼠體內存在CD4+T/CD8+T、Treg/Th17的失衡，以及心肌炎癥因子IL-17、IL-10表達的升高和先天免疫力蛋白酶Senp2表達的缺失，提示VMC小鼠免疫功能失衡及炎癥反應是引起心肌損傷的可能原因。三七具有抗炎、提高免疫功能作用，丹參具有抗細胞凋亡、抗炎、抗心肌損傷作用，張興城等［7］及楊艷等［18］等發(fā)現由三七和丹參兩種藥物聯合組成的三七丹參片具有較好的抗炎、免疫調節(jié)及抗細胞凋亡作用。本研究結果顯示，三七丹參片劑量越高，CD4+T/CD8+T及Treg/Th17越趨向于平衡，Th17轉錄因子RoRγt在心肌組織細胞中陽性表達水平越低、Treg轉錄因子Foxp3在心肌組織中陽性表達越高、心肌細胞炎癥因子釋放越少、心肌細胞凋亡率越低，提示三七丹參片可能通過調節(jié)免疫平衡、降低炎癥反應來緩解VMC小鼠心肌損傷及凋亡。

TLRs是巨噬細胞識別病毒、細菌等抗原微生物，激活機體免疫應答、激活抗原呈遞，介導免疫炎癥反應的主要通路。王芳潔等［19］發(fā)現抑制TLR4表達可緩解CVB3感染小鼠的心肌炎癥損傷程度。MIF是炎癥因子刺激巨噬細胞后釋放的細胞因子，可抑制巨噬細胞游走、促進炎癥反應、促進細菌及病毒的感染。DE SOUZA等［20］發(fā)現在呼吸道合胞病毒感染引起的肺組免疫炎癥損傷過程中，抑制肺組織MIF表達可降低肺組織炎癥損傷。Notch1是RoRγt的上游調節(jié)因子，李志萍等［21］發(fā)現Notch1信號激活可干預Treg/Th17分化平衡過程，且抑制Notch1激活，可降低支原體感染肺炎兒童肺組織免疫炎癥損傷。本研究發(fā)現，CVB3感染小鼠后，也可激活Notch1、TLR4通路，并促進MIF在心肌組織中的表達，提示Notch1、TLR4通路激活也可能參與VMC小鼠免疫炎癥反應過程。三七丹參片各劑量組小鼠心肌組織中Notch1、TLR4及MIF表達呈劑量依賴性降低，且高劑量組優(yōu)于陽性對照組，提示三七丹參片改善VMC小鼠免疫功能及炎癥損傷的作用可能與抑制Notch1、TLR4及MIF表達有關。

三七丹參片可能通過調節(jié)免疫功能，降低炎癥反應來改善VMC小鼠心肌損傷及凋亡，且其降低免疫炎癥反應作用可能與抑制Notch1、TLR4通路激活有關。但病毒感染引起的免疫炎癥反應機制復雜，且靶點較多，三七丹參片對于免疫調節(jié)的靶向調控機制還有待深入研究。