miR-9-3p通過IRF2BP2調控食管鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡、遷移和免疫逃逸①

周超鋒 王賽 田青 高潔瓊 李洪霖 郭志忠

（河南省中醫院，河南中醫藥大學第二附屬醫院腫瘤三區，鄭州 450000）

食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是最常見的食道癌類型，約占所有病例的90%［1］。由于復發、廣泛浸潤和轉移，ESCC患者五年總存活率低于13%［2］。盡管包括TP53、PIK3CA、EGFR和KRAS在內的多個基因突變已在ESCC被廣泛報道，但ESCC發生、發展和轉移的分子機制尚未闡明［3］。早期檢測對提高食管癌患者預后和降低病死率至關重要，因此在食管癌中鑒定新的治療靶點和有效診斷標志物迫在眉睫。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一系列保守的小非編碼RNA，由20～22個核苷酸組成，通過與靶mRNA的3'UTR結合導致mRNA降解和翻譯抑制，從而調節基因表達［4］。目前證據表明，miRNA可能嚴重影響細胞死亡、分化和轉移在內的各種生物學過程。miR-146a、miR-133b、miR-106b-3p、miR-125a、miR-219-5p、miR-206和miR-384等miRNA在ESCC中扮演抑癌因子角色，通過直接靶向癌基因或拮抗促癌信號傳導途徑抑制ESCC細胞增殖、轉移、干細胞樣干性和免疫逃逸等惡性生物學行為［5-11］。ZHONG等［12］通過生物信息學分析發現，miR-9-3p在ESCC組織中顯著高表達，且與ESCC患者預后相關。CUI等［13］也表明，ESCC患者血漿中miR-9-3p異常高表達，是ESCC的獨立預后因素，可作為診斷和預后的生物標志物。但miR-9-3p對ESCC惡性生物學行為的作用機制有待闡明。

本研究擬通過數據庫分析，并通過收集ESCC患者組織探討miR-9-3p在ESCC中的表達差異及其與患者生存的相關性，此外，通過生物信息學數據庫預測miR-9-3p的下游靶標，并檢測miR-9-3p對ESCC細胞增殖、凋亡、遷移和免疫逃逸的作用機制，旨在為ESCC診斷和治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床樣本30對確診為ESCC的癌組織及其配對癌旁組織收集于河南省中醫院（2017年5月至2020年1月）。本研究所有臨床試驗均經河南省中醫院倫理委員會批準，所有患者知情同意。miR-9-3p表達與ESCC患者臨床信息的相關性見表1。

表1 miR-9-3p表達與ESCC臨床參數的相關性Tab.1 Correlation between miR-9-3p expression and ESCC clinical parameters

1.1.2細胞株人正常食管上皮細胞hEEC（貨號：CP-H031）、ESCC細胞CaEs-17（貨號：CL-0051）、KYSE-30（貨號：CL-0577）、Rca-109（貨號：CL-0077）和TE-1細胞（貨號：CL-0231）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.3主要試劑miR-9-3p mimic/inhibitor和pcDNA 3.1-IRF2BP2及相應陰性對照由廣州銳博生物技術有限公司設計與合成。青、鏈霉素、DMEM培養基和Lipofectamine2000購自美國賽默飛公司；Trizol、TaqMan miRNA和SYBR Two-Step qRT-PCR Ultra-Mix試劑盒購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；CCK-8、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室購自美國康寧公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒和報告基因載體購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；IFN-γ、IL-4和IL-10 ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司；IRF2BP2和PD-L1免疫印記一抗及二抗購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1數據庫分析通過ACLB1數據庫（https：//www.aclbi.com）分析miR-9-3p在ESCC中的表達。通過Starbase數據庫（http：//starbase.sysu.edu.cn）［14］分析miR-9-3p表達與ESCC患者生存率的相關性，并預測miR-9-3p的下游靶標。

1.2.2細胞培養及轉染hEEC、CaEs-17、KYSE-30、Rca-109和TE-1細胞培養于含10%FBS的DMEM培養液（含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml），37℃、5%CO2常規培養。KYSE-30細胞隨機分為陰性對照組（NC）、過表達IRF2BP2組（OV-IRF2BP2）、共過表達miR-9-3p和IRF2BP2（Co-OV）組，胰 酶 消 化，OV-IRF2BP2和Co-OV組KYSE-30細 胞 參考Lipofectamine2000轉染試劑說明書進行pcDNA3.1-IRF2BP2轉 染 和miR-9-3p mimic與pcDNA3.1-IRF2BP2共轉染。通過Transwell小室將KYSE-30細胞和CD8+T細胞共培養48 h，收集CD8+T細胞進行后續檢測。

1.2.3RT-qPCR采用Trizol試劑從收集的組織和所有細胞系中提取總RNA，采用TaqMan miRNA試劑盒將總RNA中的miRNA逆轉錄為cDNA，參考miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒說明書，取2 μl cDNA進行miR-9-3p熒光定量分析。PCR反應體系共20 μl（2 μl反轉錄產物、0.4 μl ROX Reference Dye、10 μl SYBR Green Mix、0.8 μl正反向引物和6 μl dH2O）。PCR熱循環參數為：94℃變性10 s，60℃退火10 s，75℃延伸10 s，45個循環，2-ΔΔCt計算miR-9-3p相對表達，并通過U6 snRNA表達進行標準化。引物序列為miR-9-3p F：5′-GGAGACCGG

AAATGTAGCCA-3′，miR-9-3p R：5′-AATGGCCCGTGGAGTCTTTG-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4Western blot采用RIPA緩沖液裂解KYSE-30細胞提取總蛋白，通過Bradford蛋白測定法確定總蛋白濃度。取蛋白樣品在12%SDS-PAGE凝膠上分離并轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶處理，加入特異性抗IRF2BP2（1∶2 000）和PD-L1（1∶1 000）一抗4℃孵育過夜，加入相應二抗偶聯的HRP孵育過夜，暴露于ECL發光液，并通過iBright智能成像系統觀察和拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.5ELISA收集轉染后的KYSE-30細胞并與CD8+T細胞共培養，5 μg/ml LPS處理上清，參考ELISA試劑盒說明書，酶標儀檢測CD8+T細胞上清中IFN-γ、IL-4和IL-10水 平，并 歸 一 化 為pg/ml，計 算 相 對水平。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗通過Starbase數據庫預測miR-9-3p下游靶基因。此處確定為IRF2BP2，并擴增IRF2BP2 3'UTR WT和MUT序列。IRF2BP2的WT和MUT序列片段通過限制性內切酶載入pmiR-RB-REPORT載體，參考熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測T293細胞熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶相對光單位比值計算和測量相對熒光素酶活性。

1.2.7CCK-8實驗96孔板中每孔接種1 000個轉染后的KYSE-30細胞或與轉染后的KYSE-30細胞共培養后的CD8+T細胞，并在100 μl含10%FBS的培養基中分別培養0 h、24 h、48 h、72 h和96 h，參考CCK-8試劑盒說明書，各孔中加入10 μl CCK-8溶液孵育1 h，酶標儀測定450 nm處光密度，測定不同時間段KYSE-30細胞增殖情況。

1.2.8Annexin V-FITC/PI實驗收獲轉染后的KYSE-30細胞或與轉染后的KYSE-30細胞共培養后的CD8+T細胞，PBS洗滌1次，將100 μl細胞懸液與Annexin V-FITC和PI黑暗中孵育15 min，染色緩沖液洗滌細胞，FACS Calibur流式細胞儀分析樣品。

1.2.9Transwell實驗將各組轉染后的KYSE-30細胞剝奪血清培養過夜，以1×105個/孔接種于Transwell小室上室，下室補充含10%FBS的DMEM培養基，12 h后將下室KYSE-30細胞用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，倒置相差顯微鏡隨機選取5個不同區域對遷移細胞進行計數。

1.3統計學處理采用Graphpad 8.0進行統計學分析和圖形繪制，計量資料采用±s表示，組間比較采用LSD-t法，三組及以上比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。所有體外實驗重復3次。

2 結果

2.1miR-9-3p在ESCC中的表達ACLBI數據庫分析發現，miR-9-3p在ESCC中呈顯著高表達（P＜0.01，圖1A）。Starbase數據庫分析提示高表達miR-9-3p的ESCC患者生存較差（P＜0.001，圖1B）。進一步檢測ESCC樣本發現，miR-9-3p在ESCC組織中的表達顯著高于癌旁組織（P＜0.001，圖1C）。miR-9-3p表達與ESCC浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期顯著相關（表1）。miR-9-3p在ESCC細胞系中呈顯著高表達，且在KYSE-30細胞中表達最高（P＜0.001，圖1D）。提示miR-9-3p異常表達可能與ESCC發展進程有關。

圖1 miR-9-3p在ESCC中呈異常高表達Fig.1 miR-9-3p is highly expressed in ESCC

2.2IRF2BP2是miR-9-3p的下游靶標進一步通過Starbase數據庫預測miR-9-3p的下游靶標，miR-9-3p與IRF2BP2存在潛在結合區域（圖2A）。雙熒光素酶報告基因結果顯示，與陰性對照組、IRF2BP2野生型載體共轉染組以及miR-9-3p mimic與IRF2BP2突變型載體共轉染組相比，miR-9-3p模擬物與IRF2BP2野生型載體共轉染組可明顯抑制熒光素酶活性（P＜0.01，圖2B）。外源性調控KYSE-30細胞miR-9-3p表達發現，與陰性對照組相比，過表達miR-9-3p能顯著抑制IRF2BP2表達（P＜0.01），敲降miR-9-3p則反之（P＜0.01，圖2C）。此外，與正常組織相比，IRF2BP2在ESCC組織中呈顯著低表達（P＜0.01，圖2D），且其表達與miR-9-3p表達呈負相關（P＜0.001，圖2E）。提示miR-9-3p/IRF2BP2對ESCC具有重要調控作用。

圖2 miR-9-3p靶向負調控IRF2BP2表達Fig.2 miR-9-3p targets and negatively regulates IRF2BP2 expression

2.3miR-9-3p通過IRF2BP2對KYSE-30細胞惡性生物學行為的影響為驗證miR-9-3p/IRF2BP2分子軸對KYSE-30細胞惡性生物學行為的影響，Western blot結果顯示，過表達IRF2BP2顯著上調KYSE-30細胞IRF2BP2表達（P＜0.01，圖3A），且Co-OV組與NC組差異無統計學意義（P＞0.05）。相比于NC組，OV-IRF2BP2組KYSE-30細胞凋亡水平顯著上調（P＜0.05，圖3B），且同時過表達miR-9-3p和IRF2BP2能夠恢復KYSE-30細胞凋亡水平（P＞0.05）。進一步發現OV-IRF2BP2組KYSE-30細胞增殖和遷移顯著低于NC組（P＜0.01，圖3C、D），而Co-OV組與NC組差異無統計學意義（P＞0.05）。提示miR-9-3p通過IRF2BP2促進KYSE-30細胞惡性生物學行為。過表達IRF2BP2能夠下調KYSE-30細胞PD-L1表達（P＜0.001，圖3E），而同時過表達miR-9-3p能夠恢復PD-L1表達。進一步檢測ESCC組織中PD-L1發現，IRF2BP2表達與PD-L1表達呈負相關（P＜0.001，圖3F），且與miR-9-3p呈正相關（P＜0.001，圖3G）。提示miR-9-3p/IRF2BP2軸可能調控KYSE-30細胞PD-L1表達，進而促進免疫逃逸。

圖3 miR-9-3p通過IRF2BP2促進KYSE-30細胞惡性生物學行為Fig.3 miR-9-3p promotes malignant biological behavior of KYSE-30 cells through IRF2BP2

2.4miR-9-3p通過IRF2BP2對KYSE-30細胞免疫逃逸的影響PD-L1在腫瘤細胞免疫逃逸中扮演重要角色，因此，共培養KYSE-30細胞和CD8+T細胞，探討miR-9-3p/IRF2BP2分子軸對CD8+T細胞生物學行為的影響。CCK-8結果顯示，與單獨培養CD8+T組相比，共培養后CD8+T細胞增殖活力顯著下調（P＜0.001），而KYSE-30細胞 過表 達IRF2BP2組CD8+T細胞增殖活力明顯高于NC對照組（P＜0.001），且與過表達IRF2BP2組相比，同時過表達miR-9-3p和IRF2BP2顯著降低CD8+T細胞增殖（P＜0.001，圖4A）。ELISA結果顯示，與單獨培養CD8+T組相比，共培養能夠抑制CD8+T細胞IFN-γ和IL-4釋放，且上調IL-10水平（P＜0.001），與NC組相比，過表達IRF2BP2組促進CD8+T細胞IFN-γ和IL-4釋放，下調IL-10水平（P＜0.001），與過表達IRF2BP2組相比，同時過表達miR-9-3p和IRF2BP2則抑制CD8+T細 胞IFN-γ和IL-4釋 放，且 上 調IL-10水 平（P＜0.001，圖4B）。Annexin V-FITC/PI結果顯示，與單獨培養CD8+T組相比，共培養后CD8+T細胞凋亡水平顯著上升（P＜0.001，圖4C）。此外，相比于NC組，OV-IRF2BP2能夠阻止KYSE-30細胞對CD8+T細胞凋亡的促進作用（P＜0.05，圖4A）。提示miR-9-3p通過抑制IRF2BP2表達促進KYSE-30細胞免疫逃逸。

圖4 miR-9-3p通過IRF2BP2促進KYSE-30細胞免疫逃逸Fig.4 miR-9-3p promotes KYSE-30 cells immune escape by targeting IRF2BP2

3 討論

腫瘤發生涉及多個致癌基因，腫瘤抑制劑基因和表觀遺傳改變可協同作用。盡管ESCC已被廣泛研究，但其潛在機制仍不清楚。本研究發現，miR-9-3p在NSCLC癌組織中異常高表達，且與患者較差預后顯著相關。進一步生信分析發現，IRF2BP2是miR-9-3p的下游靶基因。miR-9-3p可通過靶向抑制IRF2BP2表達促進ESCC細胞增殖、遷移和免疫逃逸并誘導其凋亡。提示miR-9-3p可作為ESCC患者診斷和治療的靶標。

本研究部分結果與ZHONG等［12］和CUI等［13］結論一致，提示miR-9-3p在ESCC患者診斷和預后中的重要作用。此外，有研究表明，miR-9-3p在膠質瘤中扮演抑癌因子角色，通過靶向FOXG1抑制膠質瘤細胞增殖并抑制其凋亡［15］。CAI等［16］也表明，骨髓間充質來源外泌體miR-9-3p通過抑制ESM1表達抑制膀胱癌細胞增殖、侵襲和遷移并誘導其凋亡。TANG等［17］在肝細胞癌中也確認miR-9-3p可作為抑癌因子。與這些研究結論相反的是，CHEN等［18］發現上調miR-9-3p通過靶向BLCAP促進髓樣甲狀腺癌細胞生長并抑制其凋亡。提示miR-9-3p在不同惡性腫瘤中具有雙重作用。本研究中，miR-9-3p作為促癌因子促進ESCC發生發展。IRF2BP2蛋白被鑒定為與IRF-2相互作用的核蛋白，且是依賴IRF-2的轉錄阻遏物。大量研究表明，IRF2BP2在不同生物系統中已成為重要的新轉錄輔助因子，可作為基因表達的正負調節劑［19］。此外，IRF2BP2在包括凋亡、存活和細胞分化在內的不同細胞功能中起重要調控作用。研究表明，IRF2BP2在胃癌組織中的表達明顯高于正常組織，且預示患者生存率較低［20］。肝臟特異性IRF2BP2過表達抑制Hippo途徑失活導致腫瘤發生發展［21］。與之相反，本研究中IRF2BP2在ESCC組織中顯著低表達，且是miR-9-3p的下游靶標。過表達IRF2BP2能抑制ESCC細胞增殖和遷移并誘導其凋亡。此外，IRF2BP2可能在巨噬細胞調節和淋巴細胞活化中起作用，突出了其在先天和適應性免疫應答中的功能。如IRF2BP2能夠抑制TCR觸發誘導的幼稚CD4+T細胞活化和克隆擴增［22］。Cdk5缺失會導致IRF2BP2持續表達，抑制腫瘤中PD-L1表達可抑制癌細胞免疫逃逸［23］。WU等［24］也得到類似的結果。本研究也發現，IRF2BP2在ESCC細胞中可抑制PD-L1表達，從而緩解ESCC細胞對CD8+T細胞增殖的抑制作用和對凋亡的促進作用。IFN-γ和IL-4作為腫瘤微環境中的免疫促進因子及IL-10作為免疫抑制因子在癌細胞免疫逃逸中具有重要調控作用［25］。本研究表明，過表達ESCC細胞IRF2BP2并與CD8+T細胞共培養，CD8+T細胞上清中IFN-γ和IL-4水平顯著提高，IL-10則反之。提示IRF2BP2能夠抑制ESCC細胞免疫逃逸。

綜上，本研究提供了有力證據證明miR-9-3p在ESCC中可作為促癌基因。但無法排除除IRF2BP2外，還有其他可能的miR-9-3p靶標有助于ESCC發生發展。近年BAIGUDE等［26］描述了一種改進的HITS-CLIP和miR-Trap方法，可用于鑒定ESCC細胞中生物素標記的miRNAs靶標，可能對miR-9-3p在ESCC進展中的作用提供更精確和詳盡的解釋。