右美托咪定復合舒芬太尼對大鼠肺缺血再灌注損傷的作用探究

李亞萍嚴 琳丁培炎臧宏剛閻文軍

(甘肅省人民醫院麻醉手術科,蘭州 730000)

肺缺血再灌注損傷(lung ischemia-reperfusion injury,LIRI)在臨床上廣泛存在,可發生在肺移植、肺切除、心臟驟停和肺栓塞中[1],LIRI是導致肺移植相關死亡的主要原因[2]。因此,探討LIRI發病及治療機制十分重要。舒芬太尼(sufentanil)是高特異 性μ受 體 激 動 劑[3],右 美托咪啶(dexmedetomidine)為新型高特異性α2腎上腺素能受體激動劑[4],這兩種藥物均用于輔助麻醉或術后鎮痛。有研究表明,舒芬太尼可抑制肝缺血再灌注損傷的炎癥反應和氧化應激[5],可以減輕失血性休克引起的急性肺損傷[6];右美托咪定可通過抑制caveolin-1下游信號傳導來減輕大鼠的急性肺損傷[7],并能通過抑制RIPK3/MLKL通路來減輕大鼠離體肺缺血再灌注損傷[8]。然而右美托咪定復合舒芬太尼對LIRI的作用及機制尚不清楚。氧化應激和自噬是影響缺血再灌注損傷的重要機制[9-10],因此,本研究擬通過自噬和氧化應激探討右美托咪定復合舒芬太尼對肺缺血再灌注損傷的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級30只8周齡健康雄性SD大鼠,體重(250±20)g,購于成都達碩生物有限公司[SCXK(川)2020-030]。試驗在甘肅中醫藥大學[SYXK(甘)2021-0004]進行,整個實驗中動物自由采食、飲水,每天12 h光照,溫度約22℃左右。本動物實驗經甘肅省人民醫院醫學倫理委員會審批(IACUC-2021-247),實驗嚴格遵守3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

自噬基因光鏈3B(自噬基因光鏈3B,LC3B,ab192890)、自噬效應蛋白Beclin1(ab210498)、自噬蛋白5(autophagy protein 5,ATG5,ab108327)、βactin(ab8226)、核呼吸因子2(Nuclear respiratory factor-2,Nrf-2,ab62352)、血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1,ab52947)和核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase,PARP,ab139417)抗體均購自Abcam公司;TUNEL試劑盒(Vazyme,南京,中國,No.A112-01);SOD和MDA ELISA試劑盒購自北京達科為生物技術有限公司;細胞核蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。EM-1400PLUS透射電鏡(JEOL,Tokyo,日本);CKX41光學顯微鏡(Olympus,Tokyo,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與造模

(1)LIRI模型

造模方法根據已有報道進行造模[11],改良的Eppinger法建造大鼠LIRI模型,步驟為:25%烏拉坦(4 mL/kg)腹腔注射,頸部游離右頸動脈及氣管后氣管插管,通氣,通氣頻率每分鐘75次,潮氣量為10 mL,吸呼比為1∶2;待動物穩定后(約10 min),開胸,用無創血管夾夾閉左肺門30 min,關胸;30 min后,開放血管夾行缺血后復流60 min。夾閉肺門前,將左下肺韌帶離斷,50 U肝素尾緣靜脈注射5 min。

(2)實驗分組

實驗分為5組,每組6只,分別為假手術組(Sham)、模 型 組(Model)、舒 芬 太 尼 治 療 組(Sufentanil)、右美托咪定治療組(Dexmedetomidine)和舒芬太尼+右美托咪定治療組(Sufentanil+dexmedetomidine)。模型組、舒芬太尼治療組、右美托咪定治療組和舒芬太尼+右美托咪定治療組大鼠均建立LIRI模型,在阻斷左肺門前,分別給予20 μg/kg舒芬太尼、25.2 μg/kg右美托咪定和20 μg/kg舒芬太尼+25.2 μg/kg右美托咪定,再阻斷30 min;假手術組僅開放胸腔一段時間,除不采取藥物治療和阻斷左肺門外,其余處理相同。

1.3.2 檢測內容

(1)HE染色

將肺組織用4%多聚甲醛固定后,按常規方式包埋、脫蠟至水、切片,然后用蘇木精和伊紅染色,通過光學顯微鏡觀察染色結果。

(2)TUNEL染色

采用TUNEL試劑盒對肺組織凋亡進行檢測。修復后,加入50 μL末端脫氧核苷酸轉移酶反應混合物,在37℃避光孵育60 min。加入SSC溶液停止15 min,DAPI染色,在488 nm光照下可視化。

1.3.3 電鏡檢測

3%戊二醛溶液固定新鮮肺組織,然后用1%四氧化鋨再固定。脫水切片后,醋酸鈾染色10 min,再用枸櫞酸鉛染色1 min,通過透射電鏡觀察切片。

1.3.4 ELISA檢測

根據ELISA試劑盒說明書檢測肺組織SOD和MDA水平,最后在450 nm光照條件下觀察光吸收值。

1.3.5 Western blot檢測

提取總蛋白,分離核蛋白,核蛋白提取步驟為:加入細胞質蛋白提取劑裂解15 min,然后將樣品在4℃下以1500 r/min離心10 min,收集沉淀,加入核蛋白提取劑,高速渦旋至沉淀完全分散,冰浴10 min。最后最高轉速劇烈渦旋10 s,4℃ 12377 r/min離心10 min,上清液為細胞核蛋白。然后通過BCA蛋白試劑盒測定總蛋白和核蛋白含量。總蛋白檢測LC3B、Beclin1、ATG5和HO-1蛋白水平,內參為β-actin;核蛋白檢測Nrf-2蛋白水平,內參為PARP。Western blot步驟為:SDS-PAGE分離蛋白,將蛋白質轉PVDF膜上,置于4℃下添加一抗,孵育過夜;洗滌后添加對應的二抗,常溫下孵育2 h。顯色后,基于內參對蛋白水平進行定量分析。

1.4 統計學方法

采用GraphPAD 8軟件分析數據,數據用平均數±標準差(±s)表示,兩組之間比較采用非配對T檢驗,3組及以上采用單因素方差分析,事后比較采用LSD方法檢驗,P＜0.05組間具有顯著差異。

2 結果

2.1 右美托咪定復合舒芬太尼對LIRI大鼠肺組織病理學影響

假手術組大鼠肺組織各級支氣管結構較為清晰,肺泡結構較為完整,未見其他明顯病理變化。模型組大鼠肺組織結構受損,大量肺泡上皮細胞增生,肺泡壁明顯增厚,肺泡腔狹窄甚至消失,支氣管及血管周圍間質炎細胞浸潤,可見淋巴細胞團灶狀聚集,出現大量細胞凋亡。舒芬太尼、右美托咪定和舒芬太尼+右美托咪定治療均造成模型大鼠肺泡壁增厚程度減少,肺組織受損程度減輕,細胞凋亡數目也減少,其中舒芬太尼+右美托咪定治療組大鼠肺泡腔及間質內未見明顯炎細胞浸潤,細胞凋亡數目減少也最明顯。這些結果表明,20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定對大鼠肺缺血再灌注損傷有保護作用,此外,20 μg/kg舒芬太尼復合25.2 μg/kg右美托咪定對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護有協同作用,見圖1。

圖1 通過HE染色和TUNEL染色觀察右美托咪定復合舒芬太尼對大鼠肺缺血再灌注損傷的病理學影響Note. Compare with Model group, ***P＜0.001. Compare with Sufentanil+dexmedetomidine group, &P＜0.05, &&P＜0.01.Figure 1 Pathological effect of dexmedetomidine combined with sufentanil on pulmonary ischemia-reperfusion injury in rats were observed by HE staining and TUNEL staining

2.2 電鏡觀察右美托咪定復合舒芬太尼對LIRI大鼠肺組織細胞線粒體損傷的影響

電鏡結果表明,與假手術相比,模型組大鼠肺組織細胞線粒體嚴重腫脹;舒芬太尼、右美托咪定和舒芬太尼+右美托咪定治療均減輕了模型大鼠肺細胞腫脹程度,其中舒芬太尼+右美托咪定治療組大鼠肺細胞腫脹程度改善最明顯,見圖2。

圖2 透射電鏡觀察肺組織細胞線粒體損傷情況Figure 2 Mitochondrial damage in lung cells were observed by transmission electron microscopy

2.3 ELISA檢測右美托咪定復合舒芬太尼對LIRI大鼠肺組織氧化應激指標SOD、MDA表達的影響

與假手術大鼠相比,模型組大鼠肺組織SOD表達水平顯著降低,MDA表達水平顯著增高;經舒芬太尼、右美托咪定和舒芬太尼+右美托咪定治療后,三組大鼠肺組織SOD表達水平顯著升高,MDA表達水平顯著降低,其中舒芬太尼+右美托咪定治療組在3個治療組中,SOD表達水平最高,MDA表達水平最低,但與舒芬太尼治療組和右美托咪定治療組相比,沒有顯著差異。這些結果表明,20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定及其聯合使用均對大鼠缺血再灌注肺損傷的氧化應激有抑制作用,此外,20 μg/kg舒芬太尼與25.2 μg/kg右美托咪定聯合使用可能有更好的抑制氧化應激的效果,見圖3。

圖3 ELISA檢測肺氧化應激指標SOD、MDA的表達Note. Compare with Model group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 3 Expressions of SOD and MDA in lung were detected by ELISA

2.4 Western blot檢測右美托咪定復合舒芬太尼對LIRI大鼠肺組織自噬及氧化應激Nrf-2/ARE通路相關蛋白表達的影響

與假手術大鼠相比,模型組大鼠肺組織LC3B-Ⅱ、Beclin1、ATG5蛋白表 達 以及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值增高,LC3B-Ⅰ、Nrf-2、HO-1蛋白表達降低;經舒芬太尼、右美托咪定和舒芬太尼+右美托咪定治療后,三組模型大鼠肺組織LC3B-Ⅱ、Beclin1、ATG5蛋 白 表 達 以 及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比 值 降 低,LC3B-Ⅰ、Nrf-2、HO-1蛋白表達增加,其中舒芬太尼+右美托咪定治療與其他兩個治療相比,LC3B-Ⅱ、Beclin1、ATG5蛋白表 達 以及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值顯著降低,LC3B-Ⅰ、Nrf-2、HO-1蛋白表達顯著增加,但舒芬太尼治療組和右美托咪定治療組之間比較,沒有顯著差異。這些結果表明,20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定及其聯合使用均能抑制大鼠缺血再灌注肺損傷引起的自噬,及激活Nrf-2/HO-1抗氧化應激通路,20 μg/kg舒芬太尼與25.2 μg/kg右美托咪定在聯合使用中具有協同作用,見圖4。

圖4 Western blot檢測肺組織自噬及氧化應激Nrf-2/ARE通路相關蛋白的表達Note. A, Total protein related index detection. B, Nuclear protein related index detection. a, Sham. b, Model. c, Sufentanil. d,Dexmedetomidine. e, Sufentanil+dexmedetomidine. Compare with Model group,**P＜0.01,***P＜0.001. Compare with Sufentanil+dexmedetomidine group, &&P＜0.01,&&&P＜0.001.Figure 4 Related proteins of autophagy and oxidative stress Nrf-2/ARE pathway in lung were detected by Western blot

3 討論

已有研究表明舒芬太尼與右美托咪啶聯合用藥存在一定的藥物協同作用,可延長鎮靜作用和呼吸抑制作用的持續時間[12],并可通過調節腦脊液β淀粉樣蛋白Aβ、p-Tau蛋白含量和海馬組織中凋亡相關蛋白Casepase-3、Bax的表達有效保護體外循環手術大鼠認知功能[13]。我們的研究表明,舒芬太尼與右美托咪啶聯合用藥在改善LIRI中也存在一定的藥物協同作用,其機制可能與激活Nrf2/HO-1通路抑制肺組織氧化應激,并抑制非細胞過度自噬,改善肺細胞凋亡有關。

LIRI已被證明可降低肺組織中Bcl-2的水平并增加裂解的Caspase-3的水平,從而激活肺細胞凋亡[14-15]。過度的肺細胞凋亡會損害上皮屏障并導致急性肺水腫[16]。本研究發現20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定均對大鼠肺缺血再灌注損傷有保護作用,可抑制LIRI誘導的肺泡壁增厚,并減少炎細胞浸潤和肺細胞凋亡。此外,20 μg/kg舒芬太尼復合25.2 μg/kg右美托咪定對LIRI大鼠肺組織的保護作用優于這兩個藥物的單獨使用,表明20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護有協同作用。

氧化應激是缺血再灌注損傷的重要機制,LIRI產生的活性氧和促炎因子直接決定移植肺的狀態,可導致移植肺組織凋亡[9]。在病理狀態下,活性氧ROS會過度產生,從而導致氧化應激,氧化應激可導致線粒體腫脹并啟動凋亡級聯反應[17]。為應對氧化應激,Nrf2進入細胞核并激活抗氧化反應元件ARE(antioxidant response element)以增強抗氧化防御。Nrf2/HO-1通路是參與氧化應激調控的重要途徑:Nrf2通過HO-1的作用調控線粒體活動[18],HO-1是Nrf2的靶向基因,受Nrf2信號激活的嚴格調控,HO-1增強了內源性一氧化碳的生成,從而允許Nrf2與Nrf1啟動子中的ARE結合,導致編碼線粒體發生基因誘導[19],因此激活Nrf2/HO-1通路可以保護細胞免受氧化應激誘導的損傷[20]。研究表明舒芬太尼可能通過調節KNG1介導的NF-κB和Nrf2/HO-1信號通路來保護肺組織免受敗血癥誘導的炎癥和氧化應激損傷[6]。本研究表明,20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定均能激活Nrf2/HO-1信號通路、提高SOD表達和降低MDA表達,減輕線粒體腫脹損傷,表明20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定均能抑制LIRI大鼠肺組織氧化應激,改善線粒體損傷,從而減少LIRI大鼠肺細胞凋亡。此外,20 μg/kg舒芬太尼與25.2 μg/kg右美托咪定聯合使用對LIRI抗氧化應激具有協同作用。

氧化應激可觸發線粒體自噬[21]。盡管自噬的作用在缺血再灌注損傷中存在爭議,但普遍認為適度自噬具有保護作用,而過度自噬可能導致缺血期間細胞死亡[10]。Liu等[22]發現小型豬肺缺血再灌注損傷(I/R)后多種自噬相關基因上調,并且肺I/R損傷后粗肺組織和分離的肺泡巨噬細胞中自噬通量被激活。一項研究還發現,自噬通量在肺缺血期間被激活,在大鼠再灌注期間進一步增加[23]。以上表明再灌注損傷可能是自噬失調的結果[24]。此外,一項研究表明,右美托咪定可以通過抑制自噬減輕大鼠離體肺缺血再灌注損傷[25]。本研究表明,20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定均能抑制LIRI大鼠肺組織自噬,且20 μg/kg舒芬太尼與25.2 μg/kg右美托咪定聯合使用對LIRI大鼠肺組織自噬抑制有協同作用。此外,舒芬太尼和右美托咪定及其聯合使用抑制自噬的作用可能與LIRI大鼠肺組織降低的氧化應激水平相關。