鐵死亡在百草枯中毒中的研究進展

張 帆陳星澎趙 敏*

(1.中國醫科大學附屬盛京醫院急診科,沈陽 110004;2.中國醫科大學附屬盛京醫院社會服務部,沈陽 110004)

細胞死亡在機體生存和發育中發揮重要的作用。提到細胞死亡,人們通常想到的是凋亡和壞死。但這兩種細胞死亡方式已經不能完全解釋所有發生的細胞死亡現象。隨著科學不斷發展,人們提出自噬性細胞死亡、細胞焦亡、鐵死亡等細胞死亡方式。這些死亡方式與壞死和凋亡相比,在形態學、生化標志物和基因表達等方面具有顯著的不同。自噬性細胞死亡主要表現為溶酶體介導的蛋白質和細胞器的降解;細胞焦亡主要表現為caspase-1介導的gasdermin D(GSDMD)剪切、細胞膜穿孔及炎性介質的釋放;鐵死亡主要表現為鐵依賴的脂質過氧化累積、線粒體形態改變、抗氧化系統失效。鐵死亡作為一種新型的細胞死亡方式受到越來越多的關注。研究表明,鐵死亡與腫瘤、呼吸系統疾病、神經系統疾病等多種疾病相關[1]。而最新的研究表明,鐵死亡在百草枯(paraquat,PQ)中毒過程中也發揮重要的作用[2-3]。本文就鐵死亡在PQ中毒造成的組織損傷中作用的研究概況進行總結,為其進一步研究提供理論基礎。

1 鐵死亡概述

鐵元素是微生物、動植物和人類必不可少的微量營養素。然而,鐵超載可以通過多種機制損害機體,包括誘導細胞死亡。鐵死亡是一種鐵依賴的細胞死亡方式,由不受限制的脂質過氧化和隨后的膜損傷引起。鐵死亡可通過外部途徑或內在途徑觸發。外部途徑主要是通過鐵轉運蛋白的調控而啟動,而內在途徑主要是通過阻斷細胞內抗氧化酶的表達或活性而誘導的。這一過程的異常調節與各種病理條件有關,包括急性組織損傷、感染、癌癥和神經退行性變等。

2 鐵死亡機制

鐵代謝異常和脂質過氧化是鐵死亡的主要介質。鐵死亡主要表現為:(1)鐵超載;(2)活性氧(reactive oxygen species,ROS)過量產生;(3)細胞內谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)耗竭;(4)脂質過氧化積累[4]。

2.1 鐵代謝異常

鐵作為機體必需的微量元素之一,其代謝異常是鐵死亡的重要環節。在機體內,鐵主要通過與胞外轉鐵蛋白結合而被轉運到細胞內,隨后儲存在細胞內的鐵蛋白中,或借助于細胞膜上的鐵轉運蛋白泵出細胞,參與鐵元素的自循環。鐵離子參與多種酶的活性調節,故此,維持鐵穩態十分重要。當鐵穩態失衡,過量的鐵離子通過芬頓反應等催化生成大量的ROS,造成氧化損傷和脂質過氧化累積,引起鐵死亡[5]。

2.2 ROS過量產生

自由基含有未配對電子,它們能夠使細胞成分氧化。ROS在促進鐵死亡中的來源和功能已經得到了很好的研究。ROS由依賴于鐵的芬頓反應在線粒體產生。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidase,NOX)家族的酶也可以通過質膜傳遞電子,產生ROS。細胞內游離鐵的水平由一個影響鐵的吸收、儲存、利用和釋放的綜合系統控制。特別是鐵運輸(如轉鐵蛋白/轉鐵蛋白受體)或鐵儲存蛋白ferritin的自噬依賴性降解增加細胞中的不穩定鐵水平,隨后誘導ROS的產生,致使鐵死亡的發生[5]。氧化磷酸化產生的過量ROS可引起線粒體蛋白、質膜和脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)的氧化損傷,從而損害線粒體功能。

2.3 細胞內GPX4耗竭

鐵死亡的一個重要特征就是GPX4失活或下調。GPX4是一種硒酶,通過將有毒的磷脂氫過氧化物還原為無毒的磷脂醇,發揮重要的鐵死亡抑制因子的作用。研究者對鐵死亡作用和調控的研究大部分依賴于系統xc-抑制劑(如伊拉斯汀、磺胺吡啶和索拉非尼)或GPX4抑制劑(如RSL3、ML210和ML162)的使用。作為鐵死亡的關鍵調控因子,GPX4以谷胱甘肽(glutathione,GSH)為輔助因子,在脂質損傷修復和膜脂保護中起主要作用[6]。GSH通常被認為是機體的主要抗氧化劑。然而,GSH水平主要受胱氨酸/谷氨酸反轉運體的一個特定輕鏈亞基溶質載體家族7A11(solute carrier family 7A11,SLC7A11)功能的影響。SLC7A11的抑制也是鐵死亡過程中的重要特征之一,而抑制GPX4或SLC7A11能夠引起鐵死亡[7]。

2.4 脂質過氧化的積累

鐵死亡的主要特征之一是脂質過氧化水平升高。脂質過氧化(脂質被自由基氧化降解的過程)是觸發鐵死亡的主要生化事件。除了前文所述具有強大的氧化作用的ROS外,脂質過氧化還可以通過酶來完成。鐵可以增加花生四酸脂氧合酶(arachidonic acid lipoxygenase,ALOX)的 活 性[8]。ALOX能催化多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)氧化生成各種過氧化氫PUFA衍生物,如脂質過氧化氫(lipid hydroperoxide,LOOH)和反應醛(包括4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4HNE)和丙二醛(malonaldehyde,MDA))。這些醛不僅是炎癥介質,還可進一步誘導蛋白質或DNA中加合物和交聯物的形成,逐漸導致蛋白質和DNA功能受損。ALOX家族成員在介導脂質過氧化和引起鐵死亡中發揮了環境依賴的作用。另外,細胞色素P450還原酶家族能夠催化電子從NADPH轉移到細胞色素P450和其他血紅素蛋白。其中,細胞色素P450氧化還原酶(cytochrome P450 oxidordeuctase,POR)在鐵死亡過程中起著不依賴ALOX的促進PUFA過氧化的作用。這種POR依賴的脂質過氧化作用依賴于其自身氧化和產生ROS的能力[9]。

3 鐵死亡在疾病發展中的作用

缺陷或過度的鐵死亡在多種疾病的發病機制中發揮作用,作為這些疾病的治療靶點引起廣泛關注。一些富含鐵的組織(如肝、腦、心、腎等)或細胞更容易發生鐵死亡損傷。細胞死亡的病理后果之一是無菌炎癥,進一步侵蝕器官功能。損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMP)是由細胞死亡和組織損傷引起的炎癥和免疫反應的介質。除了與細胞死亡相關的常見DAMP外,氧化脂質代謝物(如MDA和4HNE)可能作為與鐵死亡相關的DAMP,誘導鐵死亡特異性的炎癥和免疫反應。值得注意的是,鐵死亡可能以雙重方式影響癌癥免疫監測。一方面,鐵死亡引起的慢性應激可通過誘導炎癥相關免疫抑制促進腫瘤生長;另一方面,惡性細胞的急性大量鐵死亡可能引起由細胞毒性T淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫反應。因此,針對鐵死亡通路的癌癥治療和預防策略在使用鐵死亡激活劑或抑制劑方面可能有很大的不同。

4 PQ中毒

4.1 概述

PQ是一種非選擇性、廉價、有效、環境友好的除草劑,這些特性使其在許多國家得到了廣泛的應用。由于PQ的持續廣泛使用和較長的半衰期,其在土壤中的殘留不斷累積,在動物覓食過程中可進入食物鏈。除了在農業中廣泛使用PQ外,大多數PQ中毒是由于操作不規范和個人防護裝備使用不當造成的。另外,由于易于購買,在一些農村地區,PQ還被用作自殺工具。PQ可以通過呼吸系統、消化系統和粘膜吸收等進入人體,并引起不同程度的毒性反應。PQ中毒是一個重要的公共衛生問題。應重視PQ中毒,盡量減少PQ對人體的危害,提高其安全性。

在全球范圍內,PQ每年都會導致意外和故意中毒。PQ中毒根據攝入濃度不同可分為輕度、中度、重度3個等級。輕度中毒引起的癥狀較輕,甚至沒有明顯的癥狀,這種程度的中毒通常不會導致死亡。中度中毒可導致器官損傷,病情惡化最終會導致死亡。嚴重中毒可導致急性器官衰竭,并在短時間內死亡。已有研究表明,PQ中毒會對肺、腎、肝、腦及其他器官造成嚴重損害[10-11]。

4.2 PQ中毒的病理生理學

PQ能在肺、腎等組織中積累。據報道,PQ中毒的死亡率超過90%[12]。PQ具有多靶點機制,對機體造成損傷,不僅影響肺,還影響心、腎、胃腸道、神經系統和免疫系統。

4.2.1 肺

PQ對呼吸系統毒性最大,肺是PQ病理作用的主要靶點。目前對PQ的研究主要集中在肺,特別是肺纖維化。PQ中毒早期呼吸系統臨床表現主要為急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征,急性期后繼發進行性肺纖維化。PQ主要通過多胺轉運體等在肺部積累,肺部的PQ濃度是血漿的10倍[13]。PQ中毒首先影響患者的肺氧合能力,進而出現胸悶氣短癥狀,伴有肺腫脹和胸腔積液[14]。PQ選擇性地在肺組織中積累,使肺組織明顯破壞和纖維化,導致機體死于呼吸衰竭[15-16]。

4.2.2 腎

PQ在體內迅速分布,在腎臟中積累濃度最高,可引起嚴重的腎毒性,導致急性腎損傷,表現為腎濾過功能下降[17]。注射PQ 24 h后,在腎皮質深部近端小管就可以觀察到細胞死亡。PQ在24 h內可引起小鼠急性腎小管變性和壞死。在PQ中毒大鼠中,血清PQ濃度、血尿素氮和肌酐水平呈時間依賴性升高,肌酐清除率降低[18]。PQ主要以原型從腎臟排泄,因此當腎功能下降時,PQ排泄減少,血漿濃度增加,進而加強腎臟和其他器官的損害[17]。

4.2.3 肝

一項對187例PQ中毒患者的回顧性研究顯示,46.52%的患者出現了肝并發癥,天門冬氨酸轉氨酶、谷丙轉氨酶和膽紅素升高[19]。在大鼠急性PQ中毒模型,腹腔內注射PQ可以顯著誘導肝細胞萎縮、肝細胞不規則排列、肝組織壞死、門靜脈充血、紅細胞滲出、竇前間隙縮小等病理改變[20]。

4.2.4 心

在PQ中毒引起的多器官損傷中,心臟損害很常見,特別是心臟氧化應激和心肌損傷,最終導致心力衰竭。由心臟損傷引起的一系列疾病可能導致猝死。PQ中毒繼發的心肌損傷常導致預后不良。使用PQ的大鼠心率增加,左心室舒張末期和收縮期末期直徑增加,縮短分數減少。鏡下可見心肌纖維核淺染、腫脹甚至消失。隨著中毒時間的延長,胞漿中線粒體分解形成空泡,細胞膜結構消失,水腫導致心肌排列紊亂[21]。

4.2.5 消化系統

PQ中毒后,機體食欲急劇下降,這與消化系統功能障礙有關。研究發現,PQ主要影響胰腺、胃和腸道。PQ中毒可引起胰腺損傷,導致胰腺炎[22]。這可以認為是化學中毒引起的胰腺炎,導致胰蛋白酶升高,而胰蛋白酶升高與血漿PQ水平呈正相關。胰蛋白酶水平越高,預后越差。PQ通過消化系統攝入,主要在小腸吸收。研究發現PQ不會直接導致胃腸道毒性,它首先引起肺或膀胱毒性,然后中性粒細胞產生ROS引起胃腸道毒性[23]。病變發生在胃腸道的小管腔,包括上皮皺襞的完整性喪失、絨毛丟失、粘膜細胞脫落并充滿管腔[24]。另一方面,在迷走神經背側運動核和黑質致密部中,PQ還引起α-synuclein折疊沉積。它還可以改變多巴胺能調節,影響單突觸黑體-迷走神經通路,導致胃動力短期增加。然而,非生理調節最終導致胃排空延遲和胃輕癱[25]。結腸也是PQ吸收的主要器官。PQ可以減少與肌肉松弛有關的一氧化氮(nitric oxide,NO)的釋放,抑制亞硝酸鹽信號轉導,最終導致結腸蠕動減慢[26]。

4.2.6 免疫系統

PQ對免疫系統也會造成極大損害。當免疫系統受到破壞時,抵抗力同時降低,會加重其他器官的炎癥反應。PQ毒素可通過水體破壞魚類的免疫系統,影響細胞免疫和體液免疫的調節,進一步損害肝、腎等重要器官[27-28]。有研究表明,PQ進入機體后,白細胞總數和中性粒細胞水平升高,分化簇(cluster of differentiation,CD)3、CD4等淋巴細胞受到抑制,直接影響免疫系統功能,降低機體免疫力[29]。也會導致巨噬細胞吞噬能力下降,免疫蛋白數量減少,進一步削弱細胞免疫屏障的保護功能[30]。同時,線粒體功能障礙促進細胞變性和凋亡。它還通過增加皮質醇和糖皮質激素受體水平干擾神經體液免疫,影響下丘腦-垂體-腎上腺軸的調節[31]。一般來說,PQ影響免疫系統與氧化應激有關。氧化應激影響細胞的調節機制,導致細胞凋亡和自噬,直接影響免疫系統。

4.3 氧化應激

氧化應激是一種由自由基介導的代償反應。PQ對機體各種器官和系統的毒性的本質是它能引起細胞損傷。造成細胞損傷的過程涉及多種因素,是一個復雜多變的過程。PQ的毒性機制與其誘導的氧化應激密切相關(見圖1)。PQ進入機體后可通過多種酶系統進行代謝,包括NADPH-細胞色素P450還原酶、黃嘌呤氧化酶、NADH-泛醌氧化還原酶和一氧化氮合酶等。PQ進入細胞后,通過電子供體NADPH還原為PQ2+,生成PQ+·,又稱百草枯自由基。PQ+·被氧化,然后回到最初PQ2+的形式,在這個過程中產生超氧自由基[32]。其他的ROS如羥基自由基可以通過Haber-Weiss反應產生。這個反應非常緩慢,但鐵和其他金屬離子可以催化這個反應,稱為芬頓反應。當自由基的產生增強時,脂質過氧化發生,最后導致細胞膜結構發生改變。

圖1 PQ中毒的分子機制Figure 1 Molecular mechanism of PQ poisoning

PQ誘導氧化應激產生的ROS破壞了防御系統和細胞功能。ROS通過干擾細胞器的正常工作,強化損傷機制,抑制細胞保護系統,進一步加重細胞損傷。PQ進入細胞后消耗氧化還原中的多種酶,包括細胞色素P450還原酶、NADPH等,破壞線粒體、內質網、過氧化物酶體膜等細胞內元素,產生大量的氧陰離子和活性氧自由基,如羥基自由基和過氧化氫。氧化應激在肺中最為明顯。有學者發現PQ可與肺還原酶相互作用產生PQ+、O2-、PQ2+等強氧化物質,隨后誘導ROS、一氧化氮合酶等強氧化物形成氧化應激,破壞肺泡表面活性分子,直接導致肺泡上皮細胞死亡,進而破壞肺泡結構[33]。PQ不僅破壞氧化還原循環,也抑制抗氧化系統來促進氧化應激的發生。此外,強氧化劑的靶器官也不同,主要是在肺、腦、肝和腎,使這些部位的氧化應激更加嚴重,對細胞造成更嚴重的損害[34]。同樣,腎ROS的增加將會破壞腎結構,神經系統ROS的存在可能會干擾肝X受體(liver X receptor,LXR)通路和Wnt/β-catenin通路導致神經髓鞘脫失,從而影響運動功能[35]。肝中的PQ也可導致氧化應激,致使細胞色素P4503A2(cytochrome P4503A2,CYP4503A2)基因表達增加和線粒體損傷,隨后導致凋亡誘導因子表達下降、線粒體腫脹和線粒體細胞色素C釋放[36]。PQ在生殖系統中引起的氧化損傷會抑制褪黑素的產生,從而影響生殖系統,增加氧化應激。與此同時,PQ也會影響免疫系統,改變炎癥因子和炎癥細胞的數量,進一步破壞機體的保護機制,對機體造成極大的損害。Rappold等[37]發現小膠質細胞氧化產生的超氧化物和多巴胺活性物質是PQ誘導神經毒性的重要原因。因此,PQ誘導的氧化應激是PQ毒性的重要原因。

5 鐵死亡在PQ中毒中的研究

5.1 氧化應激

一般來說,PQ的毒性與其引起的氧化應激密切相關。PQ可通過與肺等器官的相互作用產生大量ROS。這些ROS可以氧化周圍的脂質,誘導脂質過氧化。脂質過氧化會導致諸如滲透脆性、線粒體存活率降低和膜流動性降低等有害影響。肺泡表面的脂質在肺泡收縮和擴張時降低表面張力,也可作為肺泡表面氣體交換的介質,從而保護肺泡[33]。在PQ中毒期間,肺泡表面的脂質水平發生改變。小鼠注射PQ后脂質過氧化水平顯著升高,而服用抗氧化性食物(如維生素C)的小鼠能夠減輕PQ中毒[33]。其次,過量的ROS會消耗還原性分子(如GSH),干擾抗氧化途徑的正常調節,并進一步對肺和其他器官造成損害。PQ還可破壞GSH氧化還原循環,進而影響細胞抗氧化應激的功能[38]。據報道,鐵能夠增強PQ介導的多巴胺能細胞死亡[39],PQ以及鐵暴露可能是帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的協同環境危險因素[40],提示鐵死亡在PQ誘導的PD中起重要作用。脂質過氧化、ROS產生和抗氧化系統失衡是鐵死亡發生的重要機制,這些結果都暗示鐵死亡在PQ中毒中發揮重要的作用(見圖2)。而且,最近Hou等[2]證實,PQ能夠通過鐵死亡引起多巴胺能神經元的神經變性,抗鐵死亡治療可能在治療農藥神經毒性的過程中發揮一定的作用。

圖2 鐵死亡在PQ中毒中的作用機制Figure 2 Mechanism of ferroptosis in PQ poisoning

5.2 纖維化

PQ中毒一個重要的器官損傷就是肺纖維化。以往的研究表明,鐵死亡在肺纖維化中起重要的作用,抑制鐵死亡可以預防纖維化[41]。同時,轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和鐵死亡誘導劑伊拉斯汀誘導的肺纖維化的所有表型特征均可以通過使用鐵死亡抑制劑ferrostatin-1恢復[42]。在其他器官,如肝和心臟等,纖維化的誘導也伴有鐵死亡的發生。這些結果為鐵死亡在PQ中毒中可能發揮重要作用的假設提供了一定的理論支撐。

5.3 鐵死亡抑制劑在PQ中毒中的相關研究

Zuo等[3]的報道顯示在SH-SY5Y細胞中,PQ可以刺激鐵死亡的發生,引起細胞內鐵累積和鐵自噬,促進細胞內ROS的產生和脂質ROS的產生,損傷線粒體。抑制鐵死亡能夠顯著緩解PQ引起的損傷。這些研究提示,鐵死亡抑制劑在PQ中毒的治療中可能具有一定的應用價值。研究者對鐵死亡的認知主要是從這些抑制劑得來的,下面,我們也從鐵死亡抑制劑的角度探討鐵死亡在PQ中毒中的作用。

5.3.1 去鐵胺(Deferoxamine)

去鐵胺是一種用于治療急性鐵毒性和含鐵血黃素沉著的鐵螯合劑。鐵螯合劑是一種鐵死亡抑制劑,它通過抑制芬頓反應抑制脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)和脂質過氧化產物。鐵離子與PQ在與鐵相關的芬頓反應生成羥基自由基中具有協同作用。有報道稱,去鐵胺不僅可以通過抑制羥自由基的產生來發揮保護作用,還可以抑制II型肺泡細胞對PQ的攝取[13]。故此,鐵螯合劑可以用來防止PQ毒性。

5.3.2 維生素E

維生素E是一種脂溶性維生素,可以作為抗氧化劑清除自由基、穩定不飽和脂肪酸,與預防鐵死亡之間存在密切的聯系。維生素E等親脂抗氧化劑可通過捕獲自由基抑制脂質過氧化而對鐵死亡產生抑制作用[43]。據報道,維生素E缺乏會增加動物的急性PQ毒性,突出了維生素E在PQ毒性保護中的重要作用[44]。盡管維生素E對PQ中毒的保護機制尚未建立,但可能與維生素E防止脂質過氧化或消除自由基超氧化物方面的抗氧化特性有關[44]。維生素E作為一種鐵死亡抑制劑,其缺乏與PQ中毒敏感性之間的關系預示了鐵死亡在PQ中毒中的重要作用。

5.3.3 依達拉奉(Edaravone)

依達拉奉是一種用于治療肌萎縮性側索硬化癥和急性腦梗死的藥物。Homma等[45]在2019年發現,依達拉奉可在體外抑制鐵死亡。最近的一項研究表明,依達拉奉可通過減輕氧化應激和炎癥反應,有效地保護PQ中毒導致的肺、腎和肝損傷。依達拉奉治療后患者血清中白介素(interleukin,IL)-6、IL-10、MDA和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表達降低,超氧化物歧化酶活性升高[46]。在該研究中,依達拉奉雖沒有改善PQ引起的肺纖維化,但延長了肺纖維化發生所需的時間。

5.3.4 依布硒啉(Ebselen)

依布硒啉是一種有機硒鐵死亡抑制劑。一些研究提出依布硒啉能夠抑制NADPH-氧化酶的活性[47],而NADPH-氧化酶是鐵死亡的正調節因子。依布硒啉還被認為可以抑制谷氨酰胺酶的活性[48],而谷氨酰胺酶負責從谷氨酰胺中產生谷氨酸,谷氨酸激活N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR),隨后的興奮性毒性和鐵死亡的發生導致細胞損傷。此外,依布硒啉也顯示出抗炎、抗氧化和細胞保護活性,被認為是一種有效的ROS和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)清除劑,以及凋亡和鐵死亡的抑制劑[49]。依布硒啉可以抑制炎癥小體介導的炎癥通路[50],這是PQ毒性的必要條件。

5.3.5 GSH

GSH消耗與PQ中毒相關。GSH的消耗激活12-LOX,最終產生過氧化物和細胞死亡。雖然LOX不是鐵死亡發生的先決條件,但其在觸發鐵死亡的脂質過氧化物生成的細胞途徑中所起的作用是不容置疑的。而且,泛LOX抑制劑可以阻斷鐵死亡[51]。這些提示我們,鐵死亡在PQ中毒中可能發揮重要的作用。

6 結語

綜上所述,鐵死亡在PQ中毒造成的組織損傷中發揮重要作用。PQ中毒究竟是怎樣引起鐵死亡的機制目前尚未完全闡明。到目前為止,還沒有發現治療PQ中毒的安全有效的解毒劑。深入研究PQ引起鐵死亡的機制,為努力尋找阻斷劑,為PQ中毒的預防和治療提供新的治療策略和靶點。