表面活性劑對茫崖諾卡氏菌降解鄂爾多斯盆地富油煤過程的影響

申文盛，劉向榮，吳燕，趙順省，楊再文，盧璇

(1.西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710054；2.自然資源部煤炭資源勘查與綜合利用重點實驗室，陜西 西安 710021)

富油煤是一種特殊的煤炭資源，通過微生物降解能有效提取其高附加值產(chǎn)物，但降解率低限制了該技術(shù)在工業(yè)上的推廣[1-7]。Fakoussa等學(xué)者先后報道了表面活性劑能促進煤的生物增溶程度，為提高煤的生物轉(zhuǎn)化提供了一個新的思路[8-11]。

本研究利用茫崖諾卡氏菌降解鄂爾多斯盆地富油煤，探究了降解時間、菌液用量、加煤量、SDS、LAS、Tw-80和Triton X-100 4種表面活性劑和對茫崖諾卡氏菌降解富油煤的影響，對降解產(chǎn)物的組成進行紅外光譜、氣質(zhì)聯(lián)用色譜分析。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

煤樣，采自鄂爾多斯盆地武家塔礦區(qū)，焦油產(chǎn)率9.9%，屬富油煤；茫崖諾卡氏菌(N.mangyaensis)，購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號為：11046；甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯為色譜純；蛋白胨、酵母粉、NaCl、硝酸等均為分析純。

XMB-70A型棒磨機；SW-CJ-1FD型單人單面超凈工作臺；BL-50A型立式壓力蒸汽滅菌器；HZQ-F100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱；TU-1900型紫外可見分光光度計；Agilent 7890A/5975 C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；Spectumn GX型傅里葉變換紅外光譜儀。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基組成以供貨商提供配比制取：蛋白胨10 g， 酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.4～7.6。

1.3 實驗方法

1.3.1 煤樣的預(yù)氧化處理 對煤樣進行氧化預(yù)處理是促進煤微生物降解的有效方式[12]。將煤樣粉碎、篩分，選取粒度100～150 mm。煤樣和8 mol/L硝酸按照1∶2.5 g/mL的比例浸泡氧化24 h。去離子水沖洗至pH>5.6，抽濾、烘干備用。

1.3.2 微生物降解實驗 茫崖諾卡氏菌以供貨方所提供的培養(yǎng)方法進行活化，經(jīng)3代培養(yǎng)后留存?zhèn)溆谩Ｔ?50 mL的錐形瓶中加入50 mL液體培養(yǎng)基、富油湈，錐形瓶用紙包好，用立式壓力蒸汽滅菌鍋滅菌。滅菌后接種復(fù)壯好的菌液，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，設(shè)置溫度30 ℃，振蕩轉(zhuǎn)速160 r/min。降解結(jié)束，煤樣烘干(剩煤)。利用差減法計算煤的微生物降解率。

式中η——細菌溶煤率，%；

m1——起始加入的煤樣質(zhì)量，g；

m2——細菌作用后剩煤質(zhì)量，g。

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1.4 分析方法

利用紫外分光光度計測定降解液450 nm吸光度(A450)，A450與降解效果正相關(guān)[13-15]。利用傅里葉變換紅外光譜儀對原富油煤(原煤)、硝酸氧化富油煤(氧化煤)、剩煤進行紅外光譜分析，采用KBr壓片法，測試范圍為4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。將表面活性劑作用下最優(yōu)工藝得到的液相產(chǎn)物，使用不同極性的甲苯、二氯甲烷和乙酸乙酯進行萃取。對萃取液的組成利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 煤的氧預(yù)化

原煤和氧化煤的工業(yè)分析和元素分析見表1。

表1 煤樣的工業(yè)分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analysis of coal samples

由表1可知，富油煤經(jīng)硝酸氧化處理后，灰分含量較原煤減少，可見硝酸預(yù)處理起到了脫灰作用；揮發(fā)分較原煤增加，可能是原煤中大分子結(jié)構(gòu)被硝酸氧化斷裂，氧化煤中易降解小分子化合物增多。另外，經(jīng)硝酸處理的富油煤中氧含量明顯增加，硫含量減少，可見氧化效果明顯。

2.2 單因素實驗

降解條件設(shè)置見表2。保持其它條件不變，考察降解時間、菌液用量和加煤量對煤樣降解效果的影響,見圖1。

表2 單因素實驗Table 2 Single factor experiment

由圖1(a)可知，降解時間<15 d時，對降解效果影響顯著，>15 d時，影響較小，最佳降解時間為15 d。分析原因，微生物生長15 d后，可從培養(yǎng)基和煤樣中攝取營養(yǎng)成分已耗盡，細菌不能生存。

由圖1(b)可知，當(dāng)菌液用量為160 mL/L時，茫崖諾卡氏菌對煤降解效果最佳。分析原因，細菌與煤樣作用受傳質(zhì)作用影響，當(dāng)煤樣接觸面達到飽和時，細菌數(shù)量的增加不能強化傳質(zhì)；此外，細菌增加到一數(shù)量，煤樣中可降解物質(zhì)已耗盡，對降解效果影響不顯著。

由圖1(c)可知，當(dāng)加煤量為18 g/L時，降解效果最佳。原因可能是當(dāng)培養(yǎng)基和細菌數(shù)量不變時，煤樣的增加會加大菌種與煤樣的可接觸面積，降解效果顯著增加。同時，當(dāng)細菌可攝取營養(yǎng)源耗盡后，不能僅以煤為營養(yǎng)源生長繁殖，加煤量達到一定值后，降解效果不再增強。

2.3 正交實驗

保持其它實驗條件不變，取降解時間、菌液用量和加煤量3個因素，進行正交實驗，水平見表3，實驗結(jié)果見表4。

表3 因素水平表Table 3 Factor and level table

由表4可知，3個因素對實驗的權(quán)重影響為C>A>B，即加煤量、降解時間、菌液用量對降解效果影響依次減弱。最佳工藝條件為A2B3C2，即降解時間為15 d，菌液用量為200 mL/L，加煤量分別為18 g/L， 此時降解效果最好，降解率為34.2%。

表4 實驗結(jié)果Table 4 Test results

2.4 表面活性劑對降解影響

2.4.1 不同表面活性劑對茫崖諾卡氏菌生長的影響 實驗不加煤樣，滅菌前加入50 mL濃度為400 mg/L 的表面活性劑，通過觀察茫崖諾卡氏菌菌液的A450和pH，研究表面活性劑對微生物生長的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，加入LAS、Tw-80和TritonX-100后，菌液始終保持在堿性環(huán)境下，有利于菌種的生長，茫崖諾卡氏菌接種后生長迅速,在對數(shù)生長期，茫崖諾卡氏菌以最快的速度生長繁殖，穩(wěn)定期的細菌生長速度開始放緩。而加入SDS后，菌液顯酸性，不利于菌種的生長。茫崖諾卡氏菌在培養(yǎng)的最初24 h內(nèi)未觀察到明顯的生長，這表明茫崖諾卡氏菌很難適應(yīng)SDS環(huán)境，SDS延緩了茫崖諾卡氏菌的生長，不利于茫崖諾卡氏菌快速繁殖。

2.4.2 表面活性劑對煤樣微生物降解影響 在最佳工藝條件下，降解實驗滅菌前加入50 mL LAS、Tw-80、Triton X-100的表面活性劑，測定經(jīng)離心處理后的液相降解產(chǎn)物的pH、表面張力和A450，結(jié)果見圖3～圖5。

圖3 4種表面活性劑濃度對降解液pH的影響Fig.3 Effects of concentrations of four surfactants on pH of degradation liquids

圖4 4種表面活性劑濃度對降解液表面張力的影響Fig.4 Effects of concentrations of four surfactants onsurface tension of degradation liquids

圖5 4種表面活性劑濃度對降解液A450的影響Fig.5 Effects of concentrations of four surfactants on A450 of degradation liquids

由圖3～圖5可知，隨著加入表面活性劑SDS濃度的增大，降解液pH變小，不利于菌種生長，茫崖諾卡氏菌對氧化煤的降解效果越差；而隨著加入表面活性劑LAS、Tw-80和Triton X-100濃度的增大，降解液始終保持堿性，液體表面張力變小，茫崖諾卡氏菌對氧化煤的降解效果先增強后減弱，最佳加入濃度分別為800，800，1 000 mg/L。其中Triton X-100增加效果最為明顯，降解效果見表5，降解率為57.8%。

表5 Triton X-100作用下茫崖諾卡氏菌對煤樣降解率的提高Table 5 Improvement of degradation rate of coal samples by N.Mangyaensisunder Triton X-100

實驗結(jié)果表明，低濃度的表面活性劑可以促進煤炭的微生物降解，高濃度作用不明顯。分析原因，多環(huán)芳烴是煤中大分子結(jié)構(gòu)主要組成，隨著其環(huán)數(shù)增加、疏水性增強，不利于菌種降解。低濃度的表面活性劑能改變煤炭的表面性質(zhì)，增加煤炭的親水性，有利于細菌及其分泌物與煤炭接觸。在表面活性劑的膠束水溶液中，水相中煤樣能夠直接被微生物捕獲而降解，見圖6。

圖6 表面活性劑膠束中煤樣向微生物和酶傳質(zhì)過程Fig.6 Mass transfer of coal in surfactant micelles to microorganisms and enzymes

添加的表面活性劑形成穩(wěn)定膠束，增溶的煤被運送到微生物細胞附近，微生物和煤的傳質(zhì)作用得到增強。這一機理與圖4觀察到的結(jié)果一致，低濃度的表面活性劑可以有效降低降解后液體的表面張力，表面活性劑的加入對茫崖諾卡氏菌降解氧化煤的效果明顯。同時，表面活性劑濃度過高時，溶液滲透壓會破壞細胞完整性，影響微生物的生長和代謝，降解效果降低[16]。

2.5 原煤、氧化煤和剩煤的紅外光譜分析

圖7為原煤、氧化煤和剩煤的紅外光譜。

圖7 原煤、氧化煤和剩煤的紅外光譜圖Fig.7 FTIR of raw coal,oxidized coal,biodegradation residual coal

2.6 富油煤降解液組成分析

分別用甲苯、二氯甲烷和乙酸乙酯對降解液相產(chǎn)物進行萃取，總離子色譜依次見圖8～圖10。

圖8 甲苯萃取物的GC-MS圖Fig.8 GC-MS spectra of of toluene extract

圖9 二氯甲烷萃取物的GC-MS圖Fig.9 GC-MS spectra of of dichloromethan extract

圖10 乙酸乙酯萃取物的GC-MS圖Fig.10 GC-MS spectra of of ethyl acetate extract

由圖8可知，甲苯萃取液含有40種化合物，分子量在92～493之間，其中烷烴類物質(zhì)含量最高。

由圖9可知，二氯甲烷萃取液含有27種化合物，分子量在134～647之間，其中烷烴類含量為63.65%，醇、酯類含量為16.45%，羧酸類含量為1.93%，胺類含量為3.01%。

由圖10可知，乙酸乙酯萃取液含有3種化合物，分子量在278～338之間。

綜上所述，茫崖諾卡氏菌對煤樣的降解產(chǎn)物中主要含有烷烴類、酯類、醇類、羧酸類、胺類等小分子物質(zhì)，降解液組成見表6，相對分子量在92～647之間。

表6 煤樣的微生物降解液中有機化合物組成Table 6 Composition of organic compounds in microbial degradation solution of coal samples

3 結(jié)論

(1)在茫崖諾卡氏菌降解煤樣過程中，加煤量對降解效果影響最大，降解時間次之菌液用量影響最小。最佳降解條件：降解時間為15 d，菌液濃度為200 mL/L，煤樣濃度為18 g/L，此時降解效果最好，降解率為34.2%。

(2)表面活性劑LAS、Tw-80和Triton X-100隨著濃度增加，降解效果先增大后降低，最佳加入濃度分別為800，800，1 000 mg/L，其中Triton X-100增加效果最為明顯，降解率為57.8%，提高了23.6個百分點；SDS也增加煤炭表面的親水性，但對菌種生長有抑制作用，不能促進菌種對煤樣的降解。

(3)原煤、氧化煤和剩煤的紅外光譜顯示，微生物作用后，氧化煤的部分芳香環(huán)和羧基被降解，煤中的有機大分子已很大程度被茫崖諾卡氏菌降解成小分子。

(4)茫崖諾卡氏菌對氧化煤的降解產(chǎn)物中主要含有烷烴類、酯類、醇類、羧酸類、胺類等小分子物質(zhì)，相對分子量在92～647之間。