干細胞制備過程中倫理風險的系統性綜述*

李 欣 陸東哲 張懿中 吳朝暉 李 昂 王曉熙 薛 迪 周 萍

與一般的生物制品不同，干細胞來源于活的生物體組織，其生產制備過程包括干細胞采集、組織分離、原代細胞的培養與純化、細胞擴增、凍存、運輸等復雜程序。確保細胞活性、生物功能穩定性、遺傳穩定性和質量可控性，關系到干細胞臨床應用的安全性和有效性[1]。本文通過系統性綜述，分析不同類型干細胞(主要是間充質干細胞)制備過程中的倫理問題，為干細胞大規模生產的質量控制、干細胞產品臨床應用的安全性評估和干細胞生產制備技術的不斷完善提供參考依據。

1 資料來源

本研究通過國內外的6個主要文獻數據庫(中國生物醫學文獻數據庫、中國知網、萬方、PubMed、Ovid-EMBASE、Cochrane Library)的相關文獻檢索，根據文獻的納入和排除標準，獲得2010年1月～2020年7月發表的涉及干細胞制備倫理風險的相關文獻。具體文獻篩選過程見《干細胞生物材料來源及其倫理風險的系統性綜述》一文[2]。

2 結果

2.1 涉及干細胞制備過程中倫理風險的文獻分析

64篇納入分析的涉及干細胞制備過程中倫理風險的文獻中，發表文獻較多的年份為2011年～2015年，占所有文獻的64.06%；第一作者所在國家主要來自中國(占89.06%)；文獻類型主要是評述或一般綜述類(占59.37%)，原始研究和學位論文均占17.19%。見表1～表3。

表1 干細胞制備過程中倫理風險的文獻發表年份

表2 干細胞制備過程中倫理風險的文獻作者國別

表3 干細胞制備過程中倫理風險的文獻類型

2.2 間充質干細胞制備過程中的倫理問題

2.2.1 供者和組織來源的選擇

不同供者來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，其增長率、分化能力、染色體穩定性、植入機體后的活性等有所差異。一般來說，供者年齡較大的MSCs老化較快，其生物學活性也會變差，從而使誘導成功率降低，如隨著年齡的增長，骨髓數量顯著減少，MSCs的增殖及分化能力變弱[3]。不同細胞來源和培養方式，細胞攜帶傳染性疾病的風險和傳染的后果不同。供者攜帶隱性遺傳病的異常染色體，由于其缺乏可供檢測的細胞表型，增加了受者引入相關遺傳疾病的風險[4]。此外，不同組織源性的MSCs受特定基因表達的影響，其表面特征和功能也會有所不同，有必要根據其組織來源進行選擇[5]。

2.2.2 鑒定、分離、純化

目前，MSCs鑒定、分離、純化的難度仍較大，而難以找到特異性的表面標記使MSCs鑒定困難。MSCs分離方法有多種，包括貼壁培養法、免疫磁珠法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法等，每種方法都有不足之處。如貼壁培養法獲得的MSCs純度不夠高，免疫磁珠法和流式細胞儀分選法價格高昂，且會損傷細胞而影響存活率。因此，MSCs分離需要多種方法結合使用。MSCs的定向分化對分化微環境有嚴格要求，但有時取自供者不同組織的MSCs不能分化為目標細胞(targeted cells)而分化為其他細胞，可控性不夠高[5]。MSCs的鑒定、分離、純化問題對干細胞制備過程中的安全性和效果構成了挑戰。

2.2.3 添加物使用

MSCs培養過程中需要使用血清、抗生素、誘導劑等添加物，這些可能成為MSCs體外培養過程中外源性污染的來源。胎牛血清屬異種蛋白，可能含有動物攜帶的細菌、病毒、感染性蛋白質、朊病毒、生長因子及多種成分不明的促細胞分化因子，且不同批次間的胎牛血清高度變異，組成成分尚不十分清楚。針對胎牛血清存在的諸多弊端，越來越多的研究開始探索使用無動物性成分的添加劑(如血小板裂解液、富血小板血漿、人血清、人臍血清等)替代胎牛血清，但這些添加劑也存在缺陷，如血液來源有限、血小板裂解液擴增的MSCs在臨床應用于免疫調節劑方面具有局限性、人血清中可能含有病原體等[6]。

干細胞制劑在應用之前需要冷藏，而常用的冷凍保護劑二甲基亞砜具有潛在的毒性，特別在高于4℃的溫度下，可致基因型改變、分化潛能受損，對受者產生副作用(如惡心、嘔吐，甚至死亡)[7-8]。

2.2.4 永生化、表型改變和致瘤性問題

干細胞的多次傳代會使干細胞的生物學特性發生改變，如老化、多向分化潛能退化、分泌能力降低，甚至出現永生化傾向或癌變能力。如隨著培養代數的增加，骨髓MSCs表面標志物逐漸丟失，第9代已檢測不到標志物；也有發現骨髓MSCs長期體外擴增培養后，可能突破壽命調控而呈現出永生化傾向[9]。MSCs經體外培養、傳代后，可能出現染色體變異，雖然目前尚未證實染色體的異常改變與致瘤性相關，但這種改變提示了培養環境可導致遺傳不穩定性的發生，遺傳不穩定性則是細胞癌變的重要生物學基礎之一[10]。臍帶MSCs也可能存在異常的染色體核型。此外，經體外培養的MSCs在特定的微環境下(如低氧、化學物質誘導、生物因素等)可能發生惡變，生物因素會影響MSCs的增殖、分化和促進惡性轉化[5]。

MSCs的致瘤性仍存在諸多爭議，有學者認為MSCs移植前進行了廣泛的體外擴增增加了基因突變的風險，最終導致惡性轉化；但是也有學者認為體外擴增出現的惡變是由于在實驗室中使用的細胞株的交叉污染導致[11]。

2.3 人胚胎干細胞制備過程中的倫理問題

人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)制備過程的倫理問題包括：(1)衍生過程中使用動物培養基或滋養細胞(feeder cells)成分有傳播感染和異種抗原的風險；(2)經體外培養后，容易發生遺傳和表觀遺傳性狀的改變，也觀察到一些印跡基因的表達發生改變[12]，還可能發生染色體拷貝數的改變及雜合丟失[10]；(3)在培養中可能表現出基因組不穩定性和無法預判的分化結果，導致下一代出現某些生理缺陷；(4)疾病不能通過植入前遺傳診斷識別，因此僅能建立罕見的單基因突變或單染色體畸變的疾病特異性hESCs；(5)hESCs的定向誘導分化仍存在挑戰，不同的hESCs發育潛力不同；(6)由hESCs分化得來的多巴胺能神經元可能存在質量問題；(7)體外長期培養是影響hESCs和人孤雌胚胎干細胞臨床應用安全性的首要因素。

2.4 其他干細胞制備過程中的倫理問題

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)是神經外胚層細胞系的多能干細胞，形成過程中可能出現細胞變異，包括突變、表觀遺傳重組異常、X染色體失活、拷貝數異常、DNA堿基的改變、出現免疫原性等[13]。

脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)的增殖能力較強，具有多向分化潛能，但是脂肪組織中含量有限，并且在制備過程中也存在一些亟待解決的問題。如ADSCs缺乏特異性的表面標志物，分離純化困難；定向多向分化的機制目前尚不清楚，體內外誘導機制還未成熟和完善[14]；ADSCs長期體外培養的安全性問題仍未獲得準確評估和保障，可能引發自發的惡性轉化[15]。

骨髓干細胞(bone marrow derived stroma cells,BMSCs)是重要的肝外肝細胞來源，但是BMSCs分化過程存在癌變和促纖維化的風險，且BMSCs向肝細胞轉化的過程非常緩慢[16]。

近年來，精原干細胞(spermatogonial stem cells，SSCs)的研究也取得一定的突破，但是SSCs數量極少，組織來源有限，若患者缺乏SSCs，則難以獲取SSCs用于治療不育；SSCs穩定性低，且各批次間差異大，不具備高重復性，因此SSCs富集和保存難度均較大；針對SSCs表面標志物和分化抗原特征的研究仍未取得進展，因而獲得高純度的SSCs十分困難。雖然目前已經實現了人SSCs的體外增殖培養，但培養難度較大，SSCs在長期培養過程中會發生表型改變，并且尚未實現人SSCs在體外誘導分化形成精子，離臨床應用還很遙遠[17]。

3 討論

3.1 人類對干細胞制備過程的認識尚處在發展階段

現階段，干細胞制備過程仍存在許多亟待完善的方面。不同供者來源的干細胞分化能力、生物學活性、老化速度等存在較大差異，因此在制備過程中應該嚴格選擇干細胞來源生物材料的供者，特別是供者需進行嚴格體檢，充分了解供者遺傳背景和既往病史，確定是否有遺傳病以及健康狀況是否符合要求等，盡量排除可能對干細胞受者產生不良影響的因素，如人體免疫缺陷病毒、人類T淋巴細胞病毒等[5]。干細胞的制備技術尚未成熟，干細胞的鑒定、分離、純化仍存在很大挑戰，非目的性分化、無功能性分化、不能有效擴增等問題亟待解決，體內外誘導機制仍未完善，這些都阻礙了干細胞臨床應用的進展。

3.2 制備安全性是臨床應用倫理關注的重要方面

干細胞制備的安全性問題涉及多個方面，包括外源性微生物污染、異種蛋白引入；批次之間產品的穩定性差；多次傳代后干細胞的生物學特性改變，出現老化、多向分化潛能退化、分泌能力降低，甚至出現永生化傾向；經體外長期培養還會出現染色體變異，特定的微環境也可能影響干細胞的增殖、分化和促進惡性轉化等。干細胞制備的安全性是影響干細胞大規模臨床應用的重要原因，也是干細胞臨床應用倫理關注的重要方面。

3.3 干細胞制備過程需嚴格控制質量，不斷改進工藝

不同于傳統的藥物，干細胞制劑的制備技術具有多樣性、復雜性和特殊性。為了確保干細胞制劑臨床應用的安全性和有效性，需要對干細胞的采集和分離、干細胞系的建立、干細胞制劑制備的整個過程進行質量監控[18]。此外，還需繼續改進制備工藝，盡可能使用無動物源性成分的添加物或使用無血清的培養基，減少添加物殘留量，降低微生物污染的風險；在干細胞產品用于臨床治療之前，對長時間擴增過程中的干細胞進行安全性評估，了解基因組及表觀遺傳穩定性的相關因子是否發生變化，確保人體移植的安全性。