半固態(tài)發(fā)酵苦蕎黃酒工藝優(yōu)化及香氣分析

白永亮，林柔敏，王海燕，廖運(yùn)鵬，陳海強(qiáng)，白衛(wèi)東

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528200；2.廣東省食品低溫加工工程技術(shù)研究中心，廣東陽(yáng)江 529566；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225）

苦蕎（(L.) Gaertn），學(xué)名為韃靼蕎麥，雙子葉植物，蓼科蕎麥屬，大量種植于我國(guó)西南、西北和南部等地區(qū)。苦蕎種子含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、維生素、膳食纖維和碳水化合物等，還含有黃酮、酚類化合物等功能性成分,研究表明，苦蕎中黃酮類化合物主要由蘆丁和槲皮素等組成，具有抗氧化、抗腫瘤和降血糖、血脂、血壓等多種藥理作用。因此，苦蕎被認(rèn)為是自然界當(dāng)中少有的藥食兩用作物，被譽(yù)為“五谷之王”，具有保健價(jià)值與食療功效。

由于苦蕎的特殊性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均對(duì)苦蕎進(jìn)行了大量的研究，主要集中在苦蕎活性成分、營(yíng)養(yǎng)成分的提取和理化分析等方面，也有不少學(xué)者在加工開發(fā)方面對(duì)其做出延展，開發(fā)了苦蕎餅干、苦蕎面包，深加工食品如苦蕎茶、苦蕎醋等。酒在我國(guó)的歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，酒類作為深加工發(fā)酵食品中的高附加值產(chǎn)品，一直深受歡迎?？嗍w酒比苦蕎醋等產(chǎn)品具有更高的保健價(jià)值，得益于釀造過(guò)程中黃酮的不斷溶出。因此，苦蕎酒的開發(fā)逐漸成為苦蕎產(chǎn)品研究的熱點(diǎn)，也有助于進(jìn)一步提高苦蕎種植的經(jīng)濟(jì)效益，推動(dòng)產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。

苦蕎酒目前主要有苦蕎白酒和苦蕎黃酒，受限于白酒釀造的蒸餾工藝，苦蕎白酒中黃酮等營(yíng)養(yǎng)成分多殘留于酒糟，酒液中含量極低，苦蕎功能性成分未能得到合理利用。黃酒是世界三大古酒之一，因其獨(dú)特的壓榨工藝，能夠保留原料大量的營(yíng)養(yǎng)成分，又被譽(yù)為“液體蛋糕”。目前，苦蕎黃酒主要有液態(tài)發(fā)酵和半固態(tài)發(fā)酵兩種方式。高黃酮含量的苦蕎酒多為液態(tài)釀造法釀造，半固態(tài)純苦蕎釀造的高功能性苦蕎黃酒的研究鮮有提及。有研究表明，采用液態(tài)發(fā)酵的方式，同時(shí)將原料進(jìn)行發(fā)芽處理后，能有效地增強(qiáng)可發(fā)酵性并顯著增加黃酮含量，利用發(fā)酵罐進(jìn)行黃酒制作，可研制出總黃酮含量達(dá)103.30 mg/L 的蕎麥酒；采用100 %苦蕎原料進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，通過(guò)優(yōu)化液化工藝和糖化工藝，可釀造出黃酮含量高達(dá)940 mg/L以及1438 mg/L的苦蕎酒。采用半固態(tài)發(fā)酵的方法，可通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵時(shí)間、酒藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)、麥曲質(zhì)量分?jǐn)?shù)、沖缸加水、發(fā)酵溫度等因素優(yōu)化主發(fā)酵階段，獲得色香味俱佳的苦蕎干黃酒。采用帶殼苦蕎進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，不僅會(huì)影響風(fēng)味口感，而且會(huì)降低黃酮含量，這是由于在發(fā)酵過(guò)程中，苦蕎殼的存在阻礙了黃酮的釋放。傳統(tǒng)半固態(tài)發(fā)酵主要以提高酒體酒精度為優(yōu)化方向，目前以黃酮含量為優(yōu)化方向的苦蕎酒工藝研究較少。液態(tài)發(fā)酵使用酶制劑代替酒曲進(jìn)行糖化、發(fā)酵，具有操作簡(jiǎn)單、發(fā)酵速度快、黃酮含量較高的特點(diǎn)，但存在香氣寡淡的不足。采用半固態(tài)發(fā)酵的方法，具有豐富酒體香氣、增強(qiáng)風(fēng)味的優(yōu)點(diǎn)，此外，其釀造技術(shù)生產(chǎn)周期較短、產(chǎn)量大且加工成本低。李謠等以苦蕎和糯米為原料研制出了黃酮含量高達(dá)928.18 mg/L 的苦蕎酒。采用半固態(tài)發(fā)酵法釀造出的苦蕎小曲酒含有31 種揮發(fā)性物質(zhì)，口感豐富，酒體醇香。以玉米和高粱為釀酒原料進(jìn)行半固態(tài)發(fā)酵釀造出的酒具有品質(zhì)優(yōu)良、酒體醇和且發(fā)酵周期短的優(yōu)點(diǎn)。

本試驗(yàn)以傳統(tǒng)紹興酒及廣東客家酒釀造工藝為基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究苦蕎在半固態(tài)發(fā)酵工藝中的應(yīng)用情況，通過(guò)探索泡糧時(shí)間、蒸煮時(shí)間、拌曲量、糖化時(shí)間、糖化溫度、發(fā)酵料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等8 個(gè)因素對(duì)苦蕎黃酒酒精度及黃酮含量的影響，形成相對(duì)系統(tǒng)性的工藝研究，得到一套對(duì)于提高半固態(tài)發(fā)酵苦蕎黃酒的黃酮含量具有實(shí)際指導(dǎo)意義的工藝，為高功能性苦蕎黃酒的開發(fā)提供理論數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：苦蕎，云南朱提苦蕎生物科技開發(fā)有限公司；釀酒曲（紹興風(fēng)味T3），安琪酵母股份有限公司。

試劑及耗材：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98 %），合肥博美生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、無(wú)水葡萄糖、亞硝酸鈉，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、濃鹽酸、甲基藍(lán)、亞鐵氰化鉀，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：752紫外分光光度計(jì)，上海現(xiàn)科分光儀器有限公司；PHS-25 精密酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LB80T 糖度計(jì)，廣州市速為電子科技有限公司；HH-W420 數(shù)顯三用恒溫水箱，江蘇金怡儀器科技有限公司；BSA323S 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；DK-98-Ⅱ電子調(diào)溫萬(wàn)用電爐，天津市泰斯特儀器有限公司；酒精計(jì)，青縣燕河儀器儀表有限公司；TDL-50A 落地式大容量離心機(jī)，金壇市開發(fā)區(qū)吉特實(shí)驗(yàn)儀器廠；LHS-150HC-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；6890N-5973N氣相色譜-質(zhì)譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

操作要點(diǎn)：

泡糧：將微波加熱后的苦蕎冷卻后加水浸泡，瀝水，獲得的浸泡液煮沸后密封避光保存，備用，浸泡液面控制在高于苦蕎3～5 cm。

蒸煮：將經(jīng)過(guò)泡糧處理的苦蕎隔水蒸煮，每蒸煮15 min翻勻一次并重新插孔。

拌曲糖化：苦蕎冷卻至35～39 ℃，加入安琪釀酒曲，加入備用的浸泡液，混合，裝罐，糖化采用半密封糖化。

發(fā)酵：采用單向跑氣密封發(fā)酵，發(fā)酵第8 小時(shí)開一耙，第12小時(shí)開2耙，第14小時(shí)開3耙。

壓榨：發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行壓榨，獲得酒液和酒糟，加入蔗糖，經(jīng)混合、烘烤、冷卻、研磨、過(guò)網(wǎng)篩，分裝于紗袋中，制成茶包。

澄清：通過(guò)離心澄清，離心條件為4000 r/min離心20 min。

煎酒：裝罐后通過(guò)水浴加熱滅菌，70 ℃保持35 min，滅菌后迅速冷卻至20 ℃保存。

1.2.2 半固態(tài)發(fā)酵苦蕎黃酒的工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 泡糧時(shí)間的影響

泡糧時(shí)間分別為1 h、2 h、3 h、4 h 時(shí)對(duì)苦蕎酒質(zhì)量的影響，其他工藝參數(shù)為：蒸煮時(shí)間30 min；拌曲量0.3%；糖化時(shí)間18 h；糖化溫度30 ℃；發(fā)酵料液比0.6 mL/g；發(fā)酵時(shí)間2 d；發(fā)酵溫度30 ℃。

1.2.2.2 蒸煮時(shí)間的影響

蒸煮時(shí)間分別為20 min、30 min、40 min、50 min時(shí)對(duì)苦蕎酒質(zhì)量的影響，其他工藝參數(shù)為：泡糧時(shí)間2 h；拌曲量0.3 %；糖化時(shí)間18 h；糖化溫度30 ℃；發(fā)酵料液比0.6 mL/g；發(fā)酵時(shí)間2 d；發(fā)酵溫度30 ℃。

1.2.2.3 拌曲量的影響

拌曲量分別為0.1 %、0.3 %、0.5 %、0.7 %時(shí)對(duì)苦蕎酒質(zhì)量的影響，其他工藝參數(shù)為：泡糧時(shí)間2 h；蒸煮時(shí)間30 min；糖化時(shí)間18 h；糖化溫度30 ℃；發(fā)酵料液比0.6 mL/g；發(fā)酵時(shí)間2 d；發(fā)酵溫度30 ℃。

1.2.2.4 糖化時(shí)間的影響

糖化時(shí)間分別為6 h、12 h、18 h、24 h 時(shí)對(duì)苦蕎酒質(zhì)量的影響，其他工藝參數(shù)為：泡糧時(shí)間2 h；蒸煮時(shí)間30 min；拌曲量0.3%；糖化溫度30 ℃；發(fā)酵料液比0.6 mL/g；發(fā)酵時(shí)間2 d；發(fā)酵溫度30 ℃。

1.2.2.5 糖化溫度的影響

糖化溫度分別為27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃時(shí)對(duì)苦蕎酒質(zhì)量的影響，其他工藝參數(shù)為：泡糧時(shí)間2 h；蒸煮時(shí)間30 min；拌曲量0.3 %；糖化時(shí)間18 h；發(fā)酵料液比0.6 mL/g；發(fā)酵時(shí)間2 d；發(fā)酵溫度30 ℃。

1.2.2.6 發(fā)酵料液比的影響

發(fā)酵料液比分別為0.4 mL/g、0.6 mL/g、0.8 mL/g、1.0 mL/g 時(shí)對(duì)苦蕎酒質(zhì)量的影響，其他工藝參數(shù)為：泡糧時(shí)間2 h；蒸煮時(shí)間30 min；拌曲量0.3 %；糖化溫度30 ℃；糖化時(shí)間18 h；發(fā)酵時(shí)間2 d；發(fā)酵溫度30 ℃。

1.2.2.7 發(fā)酵時(shí)間的影響

發(fā)酵時(shí)間分別為1 d、2 d、3 d、4 d 時(shí)對(duì)苦蕎酒質(zhì)量的影響，其他工藝參數(shù)為：泡糧時(shí)間2 h；蒸煮時(shí)間30 min；拌曲量0.3%；糖化溫度30 ℃；糖化時(shí)間18 h；發(fā)酵料液比0.6 mL/g；發(fā)酵溫度30 ℃。

1.2.2.8 發(fā)酵溫度的影響

發(fā)酵溫度分別為27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃時(shí)對(duì)苦蕎酒質(zhì)量的影響，其他工藝參數(shù)為：泡糧時(shí)間2 h；蒸煮時(shí)間30 min；拌曲量0.3%；糖化溫度30 ℃；糖化時(shí)間18 h；發(fā)酵料液比0.6 mL/g；發(fā)酵時(shí)間2 d。

1.2.3 半固態(tài)發(fā)酵苦蕎黃酒工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化

結(jié)合單因素試驗(yàn)情況，選取發(fā)酵流程中的料液比（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)。以醪液黃酮含量為指標(biāo)，確定發(fā)酵過(guò)程中影響酒液黃酮含量的主次因素及最佳組合，最終結(jié)合單因素試驗(yàn)情況確定最佳釀造工藝。如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 黃酮含量的測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法，結(jié)合張迪等的研究方法并略做修改。

1.3.1.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制0.263 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液并分別取1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL 于25 mL 具塞試管，吸取30%乙醇溶液至具塞試管并定容至12.5 mL，再加入0.7 mL 的48 g/L 亞硝酸鈉溶液，5 min 后加入0.7 mL 的91 g/L 硝酸鋁溶液，6 min 后加入5 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液并用30%乙醇溶液定容至25 mL，混合均勻后放置10 min?？瞻讓?duì)照樣品未加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，于波長(zhǎng)510 mm 處測(cè)定其吸光度。以蘆丁體積為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.2 樣品黃酮的測(cè)定及含量計(jì)算

吸取1 mL 待測(cè)液于25 mL 具塞試管中，按照黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法測(cè)定，依照公式計(jì)算黃酮含量。

式中：X 表示測(cè)定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；0.263表示標(biāo)準(zhǔn)液濃度，mg/mL；V 表示定容體積，mL；25 表示稀釋倍數(shù)；1000表示換算系數(shù)。

1.3.2 吸收率的測(cè)定及計(jì)算

結(jié)合羅倉(cāng)學(xué)等的研究方法并略做修改?？嗍w稱重浸泡后瀝干，將苦蕎用4 層紗布吸干表面水分并自然晾干20 min，稱重，依照公式計(jì)算吸水率。

1.3.3 糖度、總糖的測(cè)定

糖度采用旋光糖度計(jì)測(cè)定，總糖參考文獻(xiàn)的亞鐵氰化鉀滴定法測(cè)定。

1.3.4 pH值、酒精度、總酸的測(cè)定

參考文獻(xiàn)的測(cè)定方法。

1.3.5 苦蕎黃酒揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

在最佳釀造工藝的基礎(chǔ)上，采用氣相色譜法，結(jié)合王家林等的研究方法并略做修改，測(cè)定苦蕎黃酒的揮發(fā)性成分。

氣相色譜（GC）條件：采用DB-WAX 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱箱升溫條件：初溫為40 ℃并保持1 min，以5 ℃/min 的速度升溫至120 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升溫至230 ℃；進(jìn)樣口溫度為230 ℃；載氣為氦氣，流速2 mL/min。

質(zhì)譜（MS）條件：離子源為電子電離（electronic ionization，EI）；電子能量70 eV；采集模式為全掃描;離子源溫度230 ℃;質(zhì)量掃描范圍30～550 amu。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)利用SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 半固態(tài)發(fā)酵苦蕎黃酒的工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 泡糧時(shí)間對(duì)苦蕎吸水率、浸泡液黃酮含量的影響

本實(shí)驗(yàn)比較了泡糧時(shí)間為1 h、2 h、3 h、4 h 時(shí)對(duì)苦蕎黃酒質(zhì)量的影響。泡糧時(shí)間對(duì)苦蕎吸水率、浸泡液黃酮含量的影響如圖2 所示。隨著泡糧時(shí)間的延長(zhǎng)，苦蕎吸水率逐漸增大，在1～2 h 由120.53%增大至141.80%，增幅達(dá)17.65%，2 h 后增速趨于平緩，4 h 苦蕎吸水率增大至146.27%，增幅為2.30 %?？嗍w吸水率變化趨勢(shì)與殷培蕾的研究基本一致，苦蕎吸水率過(guò)高的原因可能與苦蕎來(lái)源和測(cè)定前處理方式的不同有關(guān)。浸泡液黃酮含量隨著泡糧時(shí)間的延長(zhǎng)呈先逐漸增大后趨于平緩的變化趨勢(shì)，在1～3 h 浸泡液黃酮含量由503.2 mg/L 增大至681.8 mg/L，3 h 后增速趨于平緩，4 h 浸泡液黃酮含量比3 h 增加12.9 mg/L，達(dá)694.8 mg/L，增幅1.90 %。與液態(tài)發(fā)酵與固態(tài)發(fā)酵不同的是，半固態(tài)發(fā)酵法增加了泡糧的步驟，讓原料預(yù)先吸收水分，使淀粉結(jié)構(gòu)松弛，不僅利于后期蒸煮糊化，更有利于糖化和發(fā)酵。同時(shí)，對(duì)苦蕎浸泡液進(jìn)行回收，能減少黃酮的損失。浸泡液黃酮含量的增大可能是由于苦蕎淀粉吸水膨脹，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，水分進(jìn)入苦蕎的同時(shí)黃酮等營(yíng)養(yǎng)成分不斷流出?？嗍w在泡糧過(guò)程中對(duì)浸泡水的吸收，使浸泡液中黃酮含量增大，綜合考慮，泡糧時(shí)間以2 h為宜。

圖2 泡糧時(shí)間對(duì)苦蕎吸水率、浸泡液黃酮含量的影響

2.1.2 蒸煮時(shí)間對(duì)糖化醪液糖度、黃酮含量的影響

淀粉經(jīng)加熱會(huì)吸水糊化，糊化后的淀粉理化性質(zhì)發(fā)生改變，更易于被淀粉酶水解。本實(shí)驗(yàn)比較了蒸煮時(shí)間為20 min、30 min、40 min、50 min 時(shí)對(duì)糖化醪液糖度、黃酮含量的影響。如圖3 所示，蒸煮時(shí)間對(duì)糖化醪液中糖度、黃酮含量的影響基本保持一致，總體上呈先增大后減小的變化趨勢(shì)。蒸煮的目的是為了使原料在泡糧后進(jìn)一步吸水膨脹，使淀粉細(xì)胞破裂促進(jìn)糖化培菌。這也是半固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵的區(qū)別點(diǎn)之一。蒸煮需達(dá)一定的時(shí)間，淀粉才能糊化完全，蒸煮時(shí)間為20 min 時(shí)，淀粉糊化不完全，不利于淀粉酶對(duì)苦蕎淀粉的水解，糖化醪液糖度僅有16.8°Bx，黃酮含量為672.3 mg/L；蒸煮時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，苦蕎淀粉容易過(guò)度糊化，苦蕎趨于糜爛，造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失，糖化醪液糖度、黃酮含量降低。蒸煮30 min 時(shí)苦蕎糖化產(chǎn)生的醪液糖度和黃酮含量為最高點(diǎn)，糖度為18.0 °Bx，黃酮含量為986.0 mg/L。蒸煮40 min 后的苦蕎糖化產(chǎn)生的醪液的糖度變化趨于平緩，黃酮含量有小幅度的上升，據(jù)王麗娟等的研究，長(zhǎng)時(shí)高溫加熱黃酮可能會(huì)分解成酚羥基，致使吸光度升高，黃酮含量在數(shù)值上增大。

圖3 蒸煮時(shí)間對(duì)糖化醪液糖度、黃酮含量的影響

2.1.3 拌曲量對(duì)糖化醪液糖度、黃酮含量的影響

本實(shí)驗(yàn)比較了拌曲量為0.1 %、0.3 %、0.5 %、0.7%時(shí)對(duì)糖化醪液糖度、黃酮含量的影響。如圖4所示，隨著拌曲量的增加，糖化醪液糖度和黃酮含量均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，在0.3%拌曲量時(shí)有最高點(diǎn)，最高點(diǎn)糖度和黃酮含量分別為18.0°Bx和892.4 mg/L。拌曲量為0.1 %時(shí)，苦蕎混合的霉菌接種量小，生長(zhǎng)周期的遲緩期和對(duì)數(shù)期停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)生的糖化酶總量較少，造成苦蕎淀粉轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵性糖的速率低、黃酮溶出量少；拌曲量高于0.3%，霉菌與酵母接種量大，菌種數(shù)量在短時(shí)間內(nèi)劇增，在有限的空間內(nèi)相互抑制，產(chǎn)生過(guò)多的代謝產(chǎn)物使糖化環(huán)境惡化，菌種提前進(jìn)入衰亡期不利于糖化的進(jìn)行及黃酮的溶出，霉菌和酵母的生長(zhǎng)繁殖也會(huì)消耗大量的可發(fā)酵性糖，使糖化醪液糖度降低。

圖4 拌曲量對(duì)糖化醪液糖度、黃酮含量的影響

2.1.4 糖化時(shí)間對(duì)糖化醪液糖度、黃酮含量的影響

本實(shí)驗(yàn)比較了糖化時(shí)間為6 h、12 h、18 h、24 h時(shí)對(duì)苦蕎黃酒質(zhì)量的影響。如圖5所示，隨著糖化時(shí)間的延長(zhǎng)，糖化醪液糖度呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，糖化12 h出現(xiàn)最高點(diǎn)，最高點(diǎn)糖度為18.4°Bx。糖化醪液糖度的變化趨勢(shì)與李安等的研究結(jié)果一致，糖化時(shí)間較短可能與苦蕎淀粉比例有關(guān)，直鏈淀粉糊化難度較支鏈淀粉高，冷卻后易回生難以被微生物利用，據(jù)Fan的研究，苦蕎淀粉含量占干重的70%左右，直鏈淀粉達(dá)總含量的20%～28%，可以被高效利用的淀粉較少。糖化醪液黃酮含量隨著糖化時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)降低的變化趨勢(shì)，目前對(duì)于糖化過(guò)程黃酮含量變化情況的研究很少，猜測(cè)可能是采用開放式糖化，各類菌種生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)，產(chǎn)生了大量的代謝產(chǎn)物，致使黃酮類化合物被分解破壞，具體的作用機(jī)理仍需進(jìn)一步探究。由于糖化過(guò)程糖化醪液黃酮含量持續(xù)降低，綜合糖化醪液糖度的變化情況，糖化時(shí)間以12 h為宜。

圖5 糖化時(shí)間對(duì)糖化醪液糖度、黃酮含量的影響

2.1.5 糖化溫度對(duì)糖化醪液糖度、黃酮含量的影響

本實(shí)驗(yàn)比較了糖化溫度為27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃時(shí)對(duì)苦蕎黃酒質(zhì)量的影響。如圖6 所示，隨著糖化溫度的升高，糖化醪液糖度呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，糖化溫度為30 ℃時(shí)出現(xiàn)最高點(diǎn)，最高點(diǎn)糖度為17.9°Bx，糖化醪液黃酮含量的變化情況與糖度保持一致，最高點(diǎn)黃酮含量為900.6 mg/L。糖化過(guò)程中可發(fā)酵性糖的轉(zhuǎn)化主要依賴于霉菌產(chǎn)生的糖化酶對(duì)淀粉的轉(zhuǎn)化，糖化醪液糖度先上升后下降的變化趨勢(shì)表明，安琪釀酒曲（T3 風(fēng)味）中霉菌的最適溫度為30 ℃，過(guò)高或過(guò)低的溫度影響了霉菌的活性，糖化酶的產(chǎn)生量減少，導(dǎo)致可發(fā)酵性糖的轉(zhuǎn)化速率降低，溫度對(duì)霉菌活性的研究結(jié)果與段彬等的研究一致。糖化醪液黃酮含量的下降可能是糖化溫度的升高致使霉菌活性下降，造成苦蕎淀粉轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵性糖的速率減慢，間接造成苦蕎結(jié)構(gòu)破壞程度降低，影響了黃酮的溶出效果，導(dǎo)致糖化醪液黃酮含量降低。

圖6 糖化溫度對(duì)糖化醪液糖度、黃酮含量的影響

2.1.6 發(fā)酵料液比對(duì)發(fā)酵醪液酒精度、黃酮含量的影響

本實(shí)驗(yàn)比較了發(fā)酵料液比為0.4 mL/g、0.6 mL/g、0.8 mL/g、1.0 mL/g 時(shí)對(duì)發(fā)酵醪液酒精度、黃酮含量的影響。如圖7 所示，隨著發(fā)酵料液比的增大，發(fā)酵醪液的酒精度呈持續(xù)下降的變化趨勢(shì)，酒精的產(chǎn)生依賴于酵母對(duì)可發(fā)酵性糖的轉(zhuǎn)化，可發(fā)酵性糖的總量基本相同，發(fā)酵醪液中酒精度的下降主要由于發(fā)酵料液比的增大稀釋了酒精濃度。乙醇等有機(jī)溶劑可提取黃酮類化合物，過(guò)低的料液比無(wú)法完全浸潤(rùn)苦蕎，致使發(fā)酵產(chǎn)生的酒精與苦蕎接觸不充分，不利于苦蕎中黃酮的溶出，過(guò)高的發(fā)酵料液比會(huì)稀釋發(fā)酵醪液中的酒精、黃酮濃度。因此，發(fā)酵醪液中的黃酮含量隨著發(fā)酵料液比的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵料液比為0.6 mL/g 時(shí)出現(xiàn)最高點(diǎn)，黃酮含量為705.1 mg/L。發(fā)酵料液比的研究結(jié)果與曹冉等的研究總體上一致，由于隨著發(fā)酵料液比的增大酒精度持續(xù)降低，綜合發(fā)酵醪液黃酮含量的變化情況，發(fā)酵料液比以0.6 mL/g為宜。

圖7 發(fā)酵料液比對(duì)發(fā)酵醪液酒精度、黃酮含量的影響

2.1.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵醪液酒精度、黃酮含量的影響

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了發(fā)酵時(shí)間為1 d、2 d、3 d、4 d 時(shí)對(duì)發(fā)酵醪液酒精度、黃酮含量的影響。如圖8 所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵醪液酒精度呈先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵2 d 有最高點(diǎn)，最高點(diǎn)酒精度為11.1%vol。過(guò)高的酒精度會(huì)抑制酵母活性，醋酸菌對(duì)乙醇的利用轉(zhuǎn)化、乙醇轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性酸和酯等成分也會(huì)導(dǎo)致酒精度的下降。發(fā)酵醪液黃酮含量變化情況與酒精度一致，發(fā)酵2 d有最高點(diǎn)，最高點(diǎn)黃酮含量為712.0 mg/L，發(fā)酵2 d 后，發(fā)酵醪液黃酮含量下降，發(fā)酵4 d 時(shí)發(fā)酵醪液中黃酮含量明顯減少，僅有602.9 mg/L。黃酮含量的減少可能是發(fā)酵過(guò)程中微生物產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物，如丙酮酸、乙醛等與黃酮發(fā)生反應(yīng)，此外，黃酮自身的不穩(wěn)定性及殘余發(fā)酵菌種對(duì)其的分解，如發(fā)生聚合反應(yīng)生成黃酮醇配糖體，也會(huì)導(dǎo)致黃酮含量的降低。

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵醪液酒精度、黃酮含量的影響

2.1.8 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵醪液酒精度、黃酮含量的影響

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了發(fā)酵溫度為27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃時(shí)對(duì)發(fā)酵醪液酒精度、黃酮含量的影響。如圖9 所示，隨著發(fā)酵溫度的上升，發(fā)酵醪液中酒精度上呈先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵溫度為36 ℃時(shí)有最高點(diǎn)，最高點(diǎn)酒精度為11.9 %vol。酵母的活性受溫度影響較大，過(guò)高過(guò)低的溫度均會(huì)影響酵母的活性，當(dāng)溫度高于36 ℃，超出了酵母的最適生長(zhǎng)溫度區(qū)間，抑制了酵母菌的活性，使醪液酒精度降低。黃酮類化合物溶于乙醇等有機(jī)溶劑，酒精度的不斷提高使得發(fā)酵醪液中黃酮含量不斷增大，呈現(xiàn)與酒精度基本一致的變化趨勢(shì)。據(jù)CHO等的研究，適當(dāng)升高提取溫度有利于黃酮類化合物的提取，因此，發(fā)酵溫度的升高，能提高發(fā)酵醪液的黃酮含量，當(dāng)發(fā)酵溫度為36 ℃時(shí)，發(fā)酵醪液黃酮含量有最高點(diǎn)，最高點(diǎn)黃酮含量為837.1 mg/L。發(fā)酵溫度的研究結(jié)果與曹冉等的研究總體上一致。

圖9 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵醪液酒精度、黃酮含量的影響

2.2 半固態(tài)發(fā)酵苦蕎黃酒工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分析8 個(gè)因素對(duì)苦蕎黃酒質(zhì)量的影響程度，選擇料液比、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度3 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。結(jié)果見(jiàn)表2，由極差值R 可知，各因素對(duì)發(fā)酵醪液黃酮含量的影響主次順序?yàn)镃＞B＞A，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞料液比；由K值可知，最佳發(fā)酵料液比水平為A，即0.4 mL/g，最佳發(fā)酵時(shí)間水平為B，即2 d，最佳發(fā)酵溫度水平為C，即39 ℃，故苦蕎黃酒發(fā)酵的最佳組合為ABC。此組合未在9 組實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)，因此需要對(duì)該最佳組合做驗(yàn)證試驗(yàn)，進(jìn)一步確定最佳發(fā)酵效果。在此最佳條件下進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，發(fā)酵工藝組合ABC的發(fā)酵醪液黃酮含量為1107.8 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)差為18.6，高于正交試驗(yàn)4 號(hào)組，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)分析所得結(jié)果一致。因此，結(jié)合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，分析得出苦蕎黃酒的最佳釀造工藝為：泡糧時(shí)間2 h、蒸煮時(shí)間30 min、0.3 %釀酒曲添加量、糖化溫度30 ℃、糖化時(shí)間12 h、料液比0.4 mL/g、發(fā)酵溫度39 ℃、發(fā)酵時(shí)間2 d，此時(shí)，苦蕎黃酒的黃酮含量達(dá)1107.8 mg/L，酒精度為11.4 %vol，總糖為15.6 g/L，總酸為5.3 g/L，pH4.4。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3 苦蕎黃酒揮發(fā)性成分的結(jié)果與分析

用GC-MS對(duì)釀造的苦蕎黃酒進(jìn)行揮發(fā)性成分分離測(cè)定，測(cè)得常溫貯存的苦蕎黃酒(新酒)的揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖見(jiàn)圖10，分析結(jié)果見(jiàn)表3。查NIST（02.L）質(zhì)譜庫(kù)可得，苦蕎黃酒（新酒）共檢測(cè)出34 種揮發(fā)性成分，酯類成分種類最多，共15種，占比44.1 %；酚類、醛類、醇類各3 種，占比8.8%；酸類2種，占比5.9%；還含有芳香化合物、噻酚和吡咯等物質(zhì)。

圖1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 苦蕎黃酒揮發(fā)性成分GC-MS 分析結(jié)果

圖10 苦蕎黃酒揮發(fā)性成分的GC-MS分離色譜圖

揮發(fā)性成分含量以苯乙醇為主，相對(duì)含量為49.63 %。苯乙醇是由酵母利用糖或由苯丙氨酸代謝產(chǎn)生的高級(jí)醇，既能賦予苦蕎黃酒豐富的風(fēng)味，有丁香、玫瑰香、蜂蜜香的香味特征，又有抑菌作用。酯類、酸類、醛類和酚類的存在也豐富了酒體的風(fēng)味。例如，棕櫚酸乙酯具有蠟香、奶油香，辛酸具有脂肪香，壬醛具有玫瑰和柑橘香，愈創(chuàng)木酚具有煙熏和辛香味。

3 結(jié)論

本研究探索苦了蕎黃酒釀造過(guò)程中的泡糧時(shí)間、蒸煮時(shí)間、拌曲量、糖化時(shí)間、糖化溫度、發(fā)酵料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等8 個(gè)因素對(duì)苦蕎黃酒酒精度及黃酮含量的影響，得到了一套對(duì)于提高半固態(tài)發(fā)酵苦蕎黃酒的黃酮含量具有實(shí)際指導(dǎo)意義的工藝，為高功能性苦蕎黃酒的開發(fā)提供理論數(shù)據(jù)支持。通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)及最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果及分析，可得到以下結(jié)論：苦蕎黃酒的釀造原料應(yīng)選擇脫殼后的苦蕎，采用熱水浸泡，泡糧時(shí)間2 h、蒸煮時(shí)間30 min、釀酒曲0.3%、糖化時(shí)間12 h、糖化溫度30 ℃、料液比0.4 mL/g、發(fā)酵時(shí)間2 d、發(fā)酵溫度39 ℃的工藝釀造的苦蕎黃酒品質(zhì)最好。以最佳工藝釀造的苦蕎黃酒，黃酮含量達(dá)1107.8 mg/L，酒精度為11.4 %vol，總糖為15.6 g/L，總酸為5.3 g/L，pH4.4?？嗍w黃酒揮發(fā)性成分共34種，其中酯類成分最多，賦予了黃酒丁香、玫瑰香、蜂蜜香等香味特征，醇香濃郁。為得到富含黃酮的苦蕎黃酒產(chǎn)品提供了技術(shù)支持。