沉水植物化感抑藻效應及作用模式研究進展

朱麗萍,孫丹焱,林曉虎,黃菊文,2,李光明,2,徐竟成,2

(1.同濟大學 環境科學與工程學院，上海 200092；2.長江水環境教育部重點實驗室，上海 200092)

當前我國湖泊及城市緩流河道富營養化仍十分嚴重，藻類頻繁爆發導致水體光補償層變淺、透明度降低、活性藻毒素含量增加[1]，對生態環境和飲用水安全造成威脅[2]。作為重要的初級生產者，沉水植物在抑制藻類生長和修復水體生態方面均具有廣闊的應用價值[3]，其生理結構獨特，根、莖、葉均可有效吸收營養物質[4]，且能夠通過化感作用影響鄰近藻類生長，保持自身生存優勢。

化感作用是植物(及微生物)產生的次生代謝產物影響生物系統中物種生長和發展的過程[5]，本文主要指與周圍生物進行信息傳遞與相互作用、調節不利因素脅迫的機制。早在1949年，Hasler等[6]便發現，有眼子菜生長的淺水湖泊里藻類數量明顯較低，并首次提出水生植物具有特殊抑藻作用。隨著水污染加劇、水體富營養化情勢嚴峻，在尋找持久、低毒的生物治理藻類生態控制方法的過程中，揭示大型水生植物化感抑藻原理的研究逐漸引起科研人員的重視。

當前對沉水植物化感作用的研究已取得一定進展，但還缺乏對不同樣本化感物質檢測結果的差異性比較及對化感物質特殊作用模式的系統總結，而此二者對于沉水植物水生態修復、保育的實踐具有重要意義。因此，本文嘗試從化感物質成分分析與抑藻機理入手，詳細介紹化感物質五種特殊作用模式，以期為未來研究及工程實踐中優化沉水植物的類型、數量及應用策略提供一定借鑒意義。

1 沉水植物主要化感抑藻物質

化感物質作為化感作用重要的物質基礎，其分離實驗始于上世紀80年代。隨著分離與檢測技術的快速發展，目前已確定了諸多具體的化感物質成分，大多是分子量較小、結構簡單的次生代謝產物(酚類、萜類、有機酸、生物堿等)，部分研究結果見表1。

表1 部分常見沉水植物化感物質Table 1 Allelochemicals of some common submerged macrophytes

同時，沉水植物化感物質通常從植物本體、植物種植水、沉水植物與藻類共同培養體系(下文簡稱草藻共培養體系)水樣三種樣本中提取，具體成分的檢測結果隨樣本種類、實驗條件等的變化而有所不同。

1.1 沉水植物本體化感物質成分分析

Gross等[16]采用水、甲醇、丙酮幾種溶劑及其混合物分別進行了沉水植物化感物質提取，結果發現具有中度親脂性的溶劑(如50%v/v丙酮或70%v/v甲醇)提取到的物質抑藻效應最好，證明了化感物質多具有中度親油性和一定的水溶性。Xian等[17]在研究金魚藻對銅綠微囊藻的化感作用時，將清洗后的新鮮植物直接提取揮發物或進行風干研磨，而后均采用0.05%的DMSO溶劑(二甲基亞砜，已被證明此濃度下不會對藻類生長造成影響)提取其中的高脂肪族化合物，檢測得出其主要成分為脂類化合物、萜類化合物、酚類化合物和鄰苯二甲酸酯類化合物。

面向植物本體進行化感物質提取、分離、檢測是最直接、最基礎的方式，可以最大限度排除其他外界物質的干擾，但鑒定出的具有抑藻活性的物質經植物產生后是否被釋放到水環境中、釋放量的多少，以及在實際抑藻中發揮作用的大小都較難明確。

1.2 沉水植物種植水化感物質成分分析

基于上述問題，有研究人員認為水環境作為化感物質轉運和作用的媒介，從沉水植物種植水或水浸提液中提取化感物質進行分析可能更加科學。例如有研究對比了金魚藻本身與種植水中的化感物質，發現前者含有較強的酚酸類抑藻物質，在后者中則沒有檢出[18]。但水體中化感物質濃度很低，往往需要多種技術聯用才能夠從其復雜的有機和無機化合物基質中進行化感物質的識別、富集、分離和鑒定，如黃新穎等[19]先后通過過濾、固相萃取、乙酸乙酯液相萃取、旋轉蒸發和氮氣流吹脫等步驟，才利用GC-MS技術檢測得出以醇、脂肪酸、酚酸、羥基酸為主的21種化感物質，必要時甚至需要人工合成某些典型物質以進一步進行結構驗證和生物測試[18]。

然而種植水化感物質成分分析也存在一定的問題，如實際水體環境藻類脅迫作用下，沉水植物釋放的化感物質種類及含量是否有變化仍需進一步探究。

1.3 草藻共培養體系化感物質成分分析

雖然與種植水中化感物質成分分析的方法基本一致，但由于存在沉水植物與藻類在光、營養等方面的競爭作用，草藻共培養體系本身不能直接證明由化感作用引發抑藻效果[16]，且無法證明水中物質來源是植物還是藻類。許多研究優化條件設計試圖消除光照、營養等干擾因素的脅迫，如控制光照和連續補充營養元素以保持系統中的氮磷恒定，然而這往往會降低植物化感物質的分泌和釋放，導致實驗結果偏離實際情況。徐潔等[20]通過固相萃取、甲醇洗脫以及高效液相色譜分析得出，金魚藻在有無銅綠微囊藻共同培養的實驗中釋放的化感物質組成不同，藻類脅迫會導致檢測結果強極性物質含量下降、弱極性物質含量增加。而藻類與植物釋放物質的區分顯然需要補充各自單獨培養條件下的水中成分檢測并進行對比分析才能得出。

2 沉水植物化感抑藻機理分析

沉水植物化感物質進入環境的方式主要包括根系滲出和揮發、淋洗等[21]，其化感活性取決于植物產生量和釋放頻次[22]、自身特定的毒理學機制[23]以及目標藻類的敏感性[24]，具有作用快、選擇性強、有效作用濃度低等優點[18]。目前研究得出沉水植物化感物質抑藻作用機理示意(以藍藻細胞為例)見圖1，主要包括抑制浮游藻類光合作用、造成浮游藻類氧化損傷、影響浮游藻類及其他生理生化過程等。

圖1 沉水植物化感抑藻物質主要作用部位及影響(以藍藻細胞為例)Fig.1 The main action sites and effects of submerged plant allelopathic algae inhibitors (taking cyanobacteria cells as an example)說明：非化感物質主要抑制位點的部分細微結構未在圖中繪制和標注

2.1 抑制浮游藻類光合作用

光合作用是植物重要的代謝活動，也是生態系統賴以生存的基礎。降低光合效率可以有效抑制藻類生物量增加，是化感抑藻主要機理之一。首先，化感物質會影響對環境波動較為敏感的光系統 Ⅱ(PSII)。朱俊英等[21]在進行草藻共培養實驗時分析了銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)葉綠素含量，以及有效量子效率(YII)、最大光能轉化效率(Fv/Fm)等葉綠素熒光參數，結果表明處理組銅綠微囊藻光合能力明顯下降，PSII為作用位點之一。其次，陳國元等[25]發現銅綠微囊藻葉綠素a含量顯著降低的時間明顯早于生物量急降的時間，表明化感物質會抑制光合色素合成或對其造成破壞。Zhu等[13]也通過脈沖幅度調制熒光儀證明了化感物質對藻類光合系統活性及電子傳遞鏈具有顯著抑制作用。

2.2 造成浮游藻類氧化損傷

超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)能使藻細胞內活性氧(ROS)的產生與消除處于動態平衡，是重要的保護酶[21]。當藻類受到脅迫時，ROS會因為超過歧化能力而累積并抑制SOD和POD的活性。張庭廷等實驗中用酚酸類化感物質處理水華魚腥藻(Anabaenaflos-aquae)以及蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)后發現，細胞SOD活性先上升后下降，且下降速度與細胞受損情況呈正相關；膜脂過氧化分解產物丙二醛(MDA)在實驗初期升高、后期逐漸下降，推測化感物質導致藻細胞膜結構解體后死亡[26]。魯志營[27]也發現焦性沒食子酸能夠顯著誘導銅綠微囊藻的胞內ROS累積并造成DNA斷鏈，同時ROS水平升高會導致半胱氨酰天冬氨酸蛋白水解酶(即Caspase-3(like)酶)激活，觸發銅綠微囊藻細胞程序性死亡。

2.3 影響浮游藻類其他生理生化過程

除以上兩種主要作用途徑外，化感物質也會對藻細胞微觀結構、氮磷代謝和呼吸作用等其他生理生化過程產生影響。Wang等[28]采用流式細胞儀和熒光探針PI分析得出，高濃度化感物質會顯著損傷細胞膜完整性并改變細胞內部粒度。化感物質處理前期也會導致銅綠微囊藻呼吸速率明顯升高[29]，為藍藻適應脅迫提供更多能量。鄧平[30]發現小茨藻(Najasminor)可明顯抑制斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)硝酸還原酶活性，增加其堿性磷酸酶活性，從而影響氮磷代謝。馬浩天等[31]實驗處理后的藻類可溶性蛋白含量下降，可溶性糖含量則明顯增加，認為化感作用可能破壞了藻細胞蛋白合成機制并產生了用于增強抗氧化功能的糖類。劉輝[32]實驗結果表明，金魚藻處理組中銅綠微囊藻藻藍蛋白相關基因、細胞分裂蛋白、ATP酶表達量等均有下降，而與生命節律相關的基因、部分氧化還原酶基因表達上升。

3 沉水植物抑藻的特殊作用模式分析

3.1 毒物興奮效應

較多研究表明，沉水植物化感物質對藻類并非是完全的抑制作用，而是表現出“低濃度促進、高濃度抑制”的毒物興奮(Hormesis)效應。相較于鮮有關注的促進情況，抑制類實驗作為達到抑藻生態目的的重點研究更多，即超過某一毒性閾值后，隨著化感物質濃度的增加，對藻類的抑制作用也逐漸增強。劉碧云[33]實驗中，含2.5,4.5,6.5,8.5 mg/L的焦性沒食子酸培養液中銅綠微囊藻Fv/Fm值分別為對照的93.9%,83.7%,66.3%和28.3%。魯志營[27]也發現銅綠微囊藻DNA斷鏈情況隨暴露環境中焦性沒食子酸濃度的升高而顯著增加。

鮮啟鳴等[34]認為出現毒物興奮效應是由于化感物質作為植物的次生代謝產物，在低濃度時會被降解成易于為藻類所利用的物質，故達到一定濃度后才能發揮抑制作用。張庭廷等[26]則發現酚酸類化感物質在低濃度時影響了細胞膜通透性，使藻細胞易于吸收營養物質，高濃度時導致細胞膜受損和細胞腫脹、破裂，從而抑制藻細胞生長。具體嚴謹的毒理學分析還有待深入。

3.2 持續作用

研究發現，如果將植物與藻類分別培養，通過向藻類培養液中外加植物種植水進行抑藻實驗，穗狀狐尾藻密度需達到65 g/L才能有效抑制銅綠微囊藻生長，且少量多次添加效果要好于大量單次添加。而草藻共培養系統中，穗狀狐尾藻僅需1 g/L便可顯著抑藻[35]。由此分析，長期持續暴露下，沉水植物釋放的低濃度化感物質的抑藻效果能得到顯著加強。

Nakai等[12]檢測了穗花狐尾藻8種化感物質的每日釋放量，發現這些物質在水體中的濃度能夠長期保持在一定范圍內甚至有所增加，直接證明了化感物質的釋放是一個動態持續過程。孫雪梅等[36]則以焦性沒食子酸為對象，比較了低劑量多次暴露(0.25 mg/L×4次×5 d，間隔4 h)與單次暴露(5 mg/L) 下銅綠微囊藻的細胞密度、ROS水平及膜系統損傷情況，發現當前者累積暴露量僅為設計暴露量一半時就已超過單次暴露的抑藻水平，驗證了前述推斷。

因此條件允許的情況下，在實際水體中恢復沉水植物群落，充分發揮化感物質產生和釋放的持續作用能使抑藻實踐取得更好的效果。

3.3 聯合作用

實驗系統中藻類與多種植物或多種化感物質共存時，受抑制情況比單獨培養某種植物或單獨投加某種化感物質更強。同時，實驗室生物急性毒性測試顯示單種純化感物質有效抑藻劑量的EC50值約在0.65 ～ 5.5 mg/L之間[13]，而高云霓等[37]測得沉水植物釋放到水環境中的化感物質濃度僅能達到μg/L的水平。通過上述研究都可間接推斷化感物質相互之間應該存在聯合作用，主要表現為加和或協同，即兩種或兩種以上物質對生物體產生的影響等于或大于其單獨作用效果[38]。

化學結構相似的同類化感物質之間聯合作用已被證實。Zhu等[13]將4種已知的多酚類化感物質制備了不同組成和比例的混合物，利用TI模型分析它們對銅綠微囊藻的綜合影響，模型數值計算大于、等于和小于1分別指示拮抗、加和和協同效應，實驗結果為0.36～0.49，表現為明顯的協同作用。不同類別的化感物質間也存在聯合作用，有研究使用壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸3種化感物質制備等濃度比例混合物，其聯合毒性表現出顯著協同作用，具體效果與單種物質抑藻活性及混合比例有關[39]。

綜上可得，憑借化感物質不同種類、不同濃度比例的聯合作用，沉水植物可在降低單種活性物質作用劑量的同時達到更好的抑藻效果[2]，這一作用對實際應用具有重要的指導意義。

3.4 選擇特性

沉水植物化感作用對象具有選擇性，往往為特定的某一種或幾種目標生物[8,40]。普遍認為浮游藻類對化感物質表現出不同的敏感性，藍藻受到的抑制最強，其次是硅藻，綠藻受影響較小[41-42]，這對以藍藻水華為主的富營養化水體較為有利。如姚遠等[43]在20 d培養過程中發現，苦草、金魚藻、狐尾藻處理的實驗組與空白組相比，藍藻比例明顯先下降后上升，硅藻相反，綠藻比例相對穩定。這可能是由于藍藻作為原核生物進化位較為低級[43]，導致化感物質對其光合作用和電子傳遞活性的抑制更加強烈[13]。Sabine Hilt[42]認為除卻細胞壁和細胞膜特性、吸收機制以及目標生理過程(如光合作用)敏感性的差異，藻類附生微生物的膜結構或能源分配也有影響。另有研究認為，藻類對化感物質的敏感性還受到溫度[44]、pH等[45]因素的影響，因此選擇特性是否可按物種進行評判仍有待驗證。

3.5 抗性特性

有研究認為長期共存于同一生境中的浮游藻類可能經由共同進化和自然選擇，在個體遺傳水平和物種群落水平對沉水植物的化感物質產生抗性[41-42]。Reigosa等[46]認為，化感作用只能發生在不同棲息地的生物之間，如來自不同湖泊、溪流甚至不同地理區域，即同一生態系統內的生物會彼此適應，化感物質很難發揮作用，此類觀點使得化感作用的原位重要性受到質疑。

而Maarten等[41]研究了有無伊樂藻的生態系統中浮游植物群落對伊樂藻化感物質耐受性的差別，在對浮游植物來說足夠長的培養周期(4～8周)后，兩系統中藻類群落對伊樂藻分泌物的敏感性并無明顯差異。原因可能是水體中多種沉水植物釋放了不同化感物質，且彼此之間存在聯合作用，使得藻類抗性進化受阻。類似的野外研究結果同樣表明，有害藻類對化感物質的抗性產生并不顯著，加之沉水植物兼具的營養物質吸收作用，利用沉水植物進行抑藻仍有較大的應用潛力和研究價值。

4 實踐應用啟示

近年來，在受污染的淺水湖泊和城市內河等緩流水體的環境修復和水質保育中，沉水植物展現出重要的生態效應，在控制藻華方面也發揮了較大的作用。有野外研究得出，即使營養物質充足，在夏季長達50 d的大規模培養期內，伊樂藻足以化感控制浮游藻類生長，且后者并未進化出對應抗性，植物抑藻長期穩定應用頗具潛力[41]。在基本排除氣候、湖泊規模、群落組成和營養物質濃度等條件的干擾下，沉水植物覆蓋率在3%～100%之間均顯示出不同程度的化感抑藻效應，且隨覆蓋率的增加化感作用潛在影響增大[42]。

本研究團隊已成功將沉水植物應用在淺水湖泊、城市景觀水體生態修復和水質維護、污水廠再生水回用的城市河道水生態控制以及藻華預防的研究與工程實踐中，并取得了一定的成果。從研究與應用層面而言，沉水植物對反映藻類最大光能轉化效率指標Fv/Fm值的控制，以及對藻華的實際抑制都有顯著效果[47]。但對其抑藻機理的深入研究和分析表明，以化感作用為切入點，對于不同地區、不同水體、不同水質特征，結合不同沉水植物的化感特征，依據水體實際情況選擇和搭配植物類別，構建多樣化的植物修復環境，精細高效地發揮沉水植物的抑藻作用，仍有諸多細節值得深入思考與探索。

除此之外，由于水生植物培育具有生長周期長、管理復雜等問題，短時間內重構受污水體水生植物群落、實現其自然更新十分困難。同時植物釋放化感物質過程、活性與作用效果受到多種因素不同程度的干擾，如水中氮磷等營養元素[16,48]、光照和微生物降解作用[42]、溫度與季節等[1]。針對這些問題，直接添加易于人工合成的化感活性物質進行抑藻也可納入考慮范圍內。例如，向藻華狀態下的云南滇池水樣添加L-賴氨酸，可以使其藍藻生物量在2 d內迅速減少69%～83%[49]。顯然，直接添加純凈化感物質具有儲存、操作、管理優勢，適用水體范圍更廣，限制因素更少，自然條件下生物降解性好[50]，但由于作用有效劑量明顯增大，是否會對水體生態安全造成威脅仍有待進一步評估。

5 展望

針對沉水植物化感抑藻效應，結合未來在水環境中更準確高效地發揮其抑藻功能的需求，可以從以下方面進一步研究探索科學原理與應用策略。

(1)沉水植物的抑藻效果影響因素眾多，其化學及生物作用過程相對復雜，有必要應用現代科技手段，在分子尺度和基因層面對化感物質作用機理及作用模式進行深入探究。

(2)針對不同水體水質特征及沉水植物化感特性，將沉水植物化感抑藻效應研究拓展至群落和生態系統水平，為高效、低毒的原位抑藻技術推廣提供實現途徑和工程應用策略。

(3)植物與藻類之間的化感作用是相互的，已有研究表明藻細胞釋放的藻毒素等活性物質也會對沉水植物和生態系統其他生物產生毒害，化感物質脅迫是否會加劇有毒物質釋放造成二次污染尚未可知，因此有必要開展相應的機理研究和生態安全性評價。