小白鏈霉菌響應低pH脅迫的全局基因轉錄分析

張越，王開方，潘龍，陳旭升

(江南大學 生物工程學院,工業技術部教育重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

小白鏈霉菌(Streptomycesalbulus)是從土壤中分離得到的一株ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)產生菌，目前它成為ε-PL主要生產菌，其最大合成能力已經突破70 g/L[1]。因ε-PL對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌以及酵母均具有很好的抑制作用，故被日本、韓國、美國和中國批準用于飲料、肉制品、乳制品等食品的防腐與保鮮，是天然食品防腐劑取代化學食品防腐劑的關鍵品種[2-6]。

pH值是影響小白鏈霉菌高效合成ε-PL的最關鍵因素，控制發酵過程pH值保持在4.0左右是實現小白鏈霉菌大量合成ε-PL的先決條件。然而，鏈霉菌合成次級代謝產物的最適pH值一般為中性，例如子囊霉素、達托霉素合成的最適pH值為6.5和7.0[7-8]。已有的研究結果顯示，低pH值促進S.albulus積累ε-PL主要有兩方面原因：一是低pH值環境能有效抑制ε-PL分解酶活性。分離純化S.albulus的ε-PL分解酶，其降解活性在≤pH 4.0環境下幾乎完全喪失[9]，而ε-PL合成酶在該低pH環境下依舊能保持約20%的催化活性(最適pH 8.5)[10]。二是低pH環境有利于S.albulus胞內積累ATP。ε-PL合成酶催化活性發揮依賴胞內較高濃度ATP積累，而YAMANAKA等[11]發現在低pH環境下S.albulusNBRC14147胞內ATP濃度明顯高于較高pH值。因此，他們認為低pH環境會幫助細胞積累ATP到ε-PL合成酶啟動ε-PL合成所需的臨界值，進而實現ε-PL合成起始。令人遺憾的是，已有的研究僅關注低pH值對ε-PL合成起始與降解問題，卻忽略了小白鏈霉菌為何能在低pH值條件下進行生長和代謝？以及低pH值的環境脅迫對小白鏈霉菌造成了何種生理代謝改變？

近年來，隨著系統生物學技術發展，微生物響應低pH和酸脅迫的生理機制逐漸被揭示。研究發現，微生物面對低pH和酸脅迫環境時，首先是保持胞內pH值穩態(限制氫質子內流、提高質子泵活性、產生堿性物質消耗氫質子等方式)，其次是改變細胞膜組分以增強其流動性，三是改變細胞內代謝，四是產生保護和修復大分子等生理變化。由此可見，低pH或酸脅迫往往會對微生物造成全局性的生理影響。為此，本文借助比較轉錄組學研究方法，考察S.albulusM-Z18在恒化培養方式下響應低pH脅迫所做出的全局基因轉錄變化，以期揭示低pH環境脅迫對S.albulus造成的生理代謝影響。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養基

S.albulusM-Z18由本實驗室保藏。MS固體培養基(g/L)：甘露醇20，大豆粉20，瓊脂粉20。種子培養基(g/L)：葡萄糖 50，酵母粉 5，(NH4)2SO410，KH2PO41.36，K2HPO4·3H2O 0.8，ZnSO4·7H2O 0.04，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.05，pH 6.8。分批發酵培養基(g/L)：葡萄糖 60，酵母粉 10，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.8，FeSO4·7H2O 0.05，KH2PO44，pH 6.8。

1.2 試劑和儀器

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit RNA提取試劑盒，寶日醫生物技術(北京)有限公司;UV-2100分光光度計，優尼科儀器有限公司;T&J-Miniskid迷你平行生物反應器(1 L×4)，迪必爾生物工程(上海)有限公司。

1.3 分批發酵

使用迪必爾1 L生物反應器進行分批發酵。接種量為8%，裝液量0.7 L，發酵過程中通過調節通氣量和轉速使溶氧維持在30%。接種前，分別將溫度、通氣量以及攪拌轉速設為30 ℃，1 m3/(m3·h)，300 r/min。隨著發酵的進行發酵液pH會自發下降，用體積分數為25%的氨水調節培養基至所需pH。發酵過程中每隔6 h取1次樣，測定發酵液中ε-PL濃度、pH、菌體量及殘余葡萄糖濃度。

1.4 樣品制備

在pH 4.0、5.5環境中對S.albulusM-Z18進行恒化培養，其中具體的實驗方法參考本實驗室之前的報道[12]。待菌株達到穩定狀態時，從發酵罐中取出20 mL發酵液，離心去上清液后用9 g/L KCl洗滌2次，最后用液氮處理，保存于-80 ℃冰箱備用。使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取樣品總RNA，質檢合格RNA樣品寄送至華大基因生物有限公司完成轉錄組的測序。

1.5 分析方法

菌體干重(dry cell weight, DCW)測定：取10 mL發酵液，經10 000 r/min離心8 min后棄去上清液并全部抽濾至濾紙上，于105 ℃烘干12 h。隨后，放置在干燥器中冷卻稱取其質量，通過計算其與濾紙質量之差計算菌體干重。

ε-PL濃度測定：采用甲基橙比色法[13]。

2 結果與分析

2.1 不同pH值對S.albulus M-Z18菌體生長和ε-PL合成的影響

S.albulusM-Z18作為ε-PL生產菌，在搖瓶發酵過程中pH值會從6.8自動下降至3.0左右，極低的pH嚴重影響菌株的生長。當在發酵罐中控制培養基的pH時，S.albulusM-Z18在pH值3.5以上能很好地維持細胞生長，而且細胞的生物量隨著pH值的增加而增加(圖1-a)。但ε-PL的合成受到pH值的嚴格調控，只有在pH≤5時才會積累ε-PL，而且隨著pH的降低ε-PL產量逐漸升高(圖1-b)。因此，S.albulusM-Z18發酵ε-PL過程需要嚴格的控制在低pH環境中。

a-菌體量；b-ε-PL產量

2.2 低pH脅迫條件下S.albulus M-Z18基因表達差異與分析

本研究通過恒化培養控制S.albulusM-Z18在不同pH值(5.5、4.0)條件下達到穩態[溶解氧(dissolved oxygen，DO)、DCW、ε-PL濃度、殘余葡萄糖濃度等基本不變]。這將消除菌株在不同pH值(5.5、4.0)條件下的生長差異，更好的比較菌株之間生理差異。取穩態時的樣品提取RNA進行全基因轉錄組測序及分析。

以Q<0.05且基因差異表達量倍數在2倍以上為篩選條件，篩選顯著差異表達基因。結果如圖2所示，共有3 893個基因顯著差異表達，其中1 786 個上調顯著基因，2 107個下調顯著基因，顯著差異基因數目占檢測到基因數目的53.97%，說明S.albulusM-Z18基因表達發生了顯著的變化以應對低pH脅迫。

圖2 顯著差異表達基因數目統計圖

pH 5.5和pH 4.0兩個樣本的GO功能富集分析結果如圖3所示，差異表達基因主要集中于生物過程(biological process)，此外分子功能(molecular function)和細胞成分(cellular components)也富集了大量的差異表達基因。生物過程顯著富集的條目是代謝過程(metabolic process)、細胞過程(cellular process)和單生物代謝過程(single-orgnism process)。對pH 5.5和pH 4.0兩個樣本進行KEGG富集分析。由圖4可知差異基因主要集中于代謝(metabolism)這一大類中，其中多數基因注釋到碳代謝(carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)和萜類化合物和聚酮化合物的代謝(metabolism of terpenoids and polyketides)通路上。此外，跨膜運輸(membrane transport)和信號轉導(signal transduction)通路中多數基因也發生了顯著差異表達。總之，S.albulusM-Z18的代謝、物質轉運和信息交互在低pH脅迫環境中發生了顯著的差異變化。對這些代謝通路展開具體分析以探究S.albulusM-Z18響應酸脅迫的具體分子機制。

圖3 顯著差異表達基因的GO功能分類圖

圖4 顯著差異表達基因KEGG Pathway分類圖

2.3 S.albulus M-Z18響應低pH脅迫生理機制

2.3.1 糖代謝途徑

糖代謝過程主要包括糖酵解途徑、三羧酸循環和戊糖磷酸途徑。葡萄糖分子活化階段、葡萄糖降解階段和氧化產能階段為糖酵解途徑的三個階段。如圖5所示，pH 4.0條件下，糖酵解第一、二階段過程中所有的酶都沒有顯著上調，而且己糖激酶[(glk，SAZ_RS 25070(-5.86倍)，SAZ_RS14035(-5.21倍)]顯著下調，糖酵解途徑的第一、二階段是受到抑制的。在糖酵解的第三階段，即從3-磷酸甘油醛到丙酮酸的過程需要4個酶催化，其中3個酶的表達顯著上調[gapA(2.83倍)、eno(6.96倍)、pyk(2.83倍)]，糖酵解的第三階段增強。另外，從丙酮酸到乙酰-CoA途徑的相關酶基因均顯著上調。這表明在低pH環境中丙酮酸的代謝加速，S.albulusM-Z18可能需要大量的ATP供能。

三羧酸循環作為能量供應和物質氧化的主要途徑，如圖5所示，檸檬酸合酶(gltA, 3.03倍)和α-酮戊二酸脫氫酶復合體[(sucA(2.14倍)、sucB(2.3倍)和(old, 3.03倍)]這兩個關鍵酶顯著上調。此外，琥珀酸脫氫酶[frdB(3.73倍)、frdC(2.3倍)]也顯著上調，這表明低pH環境下三羧酸循環增強，這有助于菌株獲得大量能量抵御酸脅迫。

圖5 糖代謝途徑

戊糖磷酸途徑是NADPH和核糖合成的主要途徑[14]。氧化階段和非氧化階段為戊糖磷酸途徑的兩個階段。在pH 4.0環境中，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因(zwf, 2.3倍)表達上調，葡萄糖-6-磷酸內脂酶基因(pglS, -13.93倍)卻顯著下調，推測低pH條件下S.albulusM-Z18的NADPH合成增加。在非氧化階段，核酮糖-5-磷酸異構酶基因(rpiA, 6.32倍)顯著上調、轉酮酶(tktA, -17.03倍)基因大幅下調，其余基因沒有顯著變化，說明戊糖磷酸途徑的非氧化階段在低pH環境下是減弱的。綜上，低pH條件下S.albulusM-Z18通過增強糖酵解途徑第三階段、戊糖磷酸途徑中NADPH合成、減弱戊糖磷酸途徑非氧化階段，使丙酮酸更多的進入檸檬酸循環以增加糖代謝產能來應對低pH脅迫。

2.3.2 氧化磷酸化途徑

需氧微生物主要通過氧化磷酸化產生ATP來進行胞內的代謝反應。完成這一過程的是電子傳遞鏈，其主要由4種蛋白質復合物組成，分別是復合體Ⅰ(NADH-Q還原酶)、復合體Ⅱ(琥珀酸-Q還原酶)、復合體Ⅲ(泛醌-細胞色素c還原酶)和復合體Ⅳ(細胞色素c氧化酶)。pH 4.0條件下，S.albulusM-Z18呼吸鏈復合體Ⅱ和復合體Ⅳ顯著上調，這說明菌株的呼吸強度增強。pH 4.0條件下ATP合酶的δ亞基(atpH, -6.32倍)、B亞基(atpF, -2.51倍)和C亞基(atpE, -2.71倍)下調，推測這些基因的下調有可能限制酸性條件下H+流入胞內防止胞內環境酸化。但總體上來說，低pH條件下氧化磷酸化增強，呼吸產能增加，這將有助于菌株抵御低pH脅迫(表1)。

表1 氧化磷酸化相關的差異表達基因

2.3.3 氨基酸合成途徑

低pH環境對細胞內氨基酸合成相關基因轉錄的影響如圖6所示。組氨酸是一種堿性氨基酸，它的合成起始物是5-磷酸核糖-1-焦磷酸鹽(phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP)。由于戊糖磷酸途徑中的轉酮酶(tktA, -17.03倍)基因表達下調，非氧化階段主要合成5-磷酸核糖，因此PRPP的合成可能是增強的。從PRPP到組氨酸的合成途徑中4個基因發生顯著變化，磷酸核糖-ATP二磷酸酶(hisE, 9.2倍)顯著上調、磷酸核糖甲酰胺-5-氨基咪唑甲酰胺核糖異構酶[(hisA, -2.46倍)、轉氨酶(hisC, SAZ_RS43525(-4.6倍)、SAZ_RS12845(-2.64倍)]和組氨酸脫氫酶(hisD, -2.46倍)都顯著下調。后續基因顯著下調可能是合成組氨酸的量太大造成了反饋抑制，組氨酸合成最終可能是增強的。羥基丙酮酸和3P-D-甘油酸是絲氨酸氨基酸家族的合成起始物。由圖6可知，丙氨酸乙醛轉氨酶(agxT, -4.2倍)和D-3-磷酸甘氨酸脫氫酶(serA，-15.14倍)都顯著下調，這將整體限制了絲氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的合成。4-磷酸赤蘚糖是芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的前體物質。前文的分析顯示，pH 4.0條件下，S.albulusM-Z18的戊糖磷酸途徑非氧化階段整體減弱，而且從4-磷酸赤蘚糖到苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成途徑的多個基因顯著下調，這說明整個芳香族氨基酸合成整體減弱。乙酰乳酸合成酶、丙酮酸是丙酮酸族氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)生物合成的限速酶[15]和前體。經前文分析，pH 4.0條件下丙酮酸更多的流向糖酵解途徑，而乙酰乳酸合酶(livB, -3.78倍)和2-異丙基蘋果酸合酶(leuA, -4.0倍)也顯著下調，這使得丙酮酸族氨基酸合成整體上被削弱。雖然后續合成途徑中酮醇酸還原異構酶(livC, 2.2倍)、3-異丙基蘋果酸脫水酶小亞基(leuD, 2.2倍)顯著上調，但是合成途徑的最后一步，支鏈氨基酸轉氨酶[livE, SAZ_RS38250(-3.03倍)、SAZ_RS38655(-3.03倍)和SAZ_RS10355(-2.46倍)]和亮氨酸脫氫酶(leu, -4.92倍)顯著下調。總之，低pH條件下丙酮酸族氨基酸的生物合成也會減弱。天冬氨酸族氨基酸的合成起始物是草酰乙酸，從圖6可知天冬氨酸氧化酶(nadB, -4.59倍)顯著下調，這將限制了天冬氨酸族氨基酸的合成。天冬氨酸激酶(lysC, 3.71倍)、蘇氨酸合酶(thrC, 3.25倍)和5-甲基四氫葉酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶(metH, 3.73倍)顯著上調，天冬氨酸更多的流向蘇氨酸和甲硫氨酸，天冬氨酸的含量可能減少。令人驚訝的是pH 4.0條件下天冬氨酸β-半醛脫氫酶基因(asd)上調了2 164.77倍，而后續賴氨酸合成途徑的基因幾乎都發生下調，考慮到S.albulusM-Z18只有在低pH條件下大量合成ε-PL，所以賴氨酸的合成一定是增強的。推測賴氨酸合成途徑酶基因的下調可能是低pH條件下賴氨酸的大量合成，反饋抑制賴氨酸合成途徑中酶的合成。α-酮戊二酸是谷氨酸族氨基酸(谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸)的前體，低pH條件下谷氨酸合酶[gltB, SAZ_RS13535(4.6倍)、SAZ_RS13540(2.46倍)]和谷氨酸脫氫酶(gdhA, 2.64倍)基因表達上調，證明谷氨酸的合成可能增強。而谷氨酰胺酶(glsA, 5.28倍)和谷氨酰胺合酶(glnA, 8倍)也表達上調，證明谷氨酰胺與谷氨酸之間轉換強度增加，谷氨酰胺合酶的合成也可能增強。谷氨酸、谷氨酰胺是耐酸系統(谷氨酸脫羧酶系統和谷氨酸-谷氨酸轉運蛋白系統)的底物，其含量增加有助于S.albulusM-Z18在低pH條件下存活。另外，pH 4.0條件下從谷氨酸到精氨酸和脯氨酸的合成途徑多個基因顯著下調，精氨酸和脯氨酸的合成可能減弱。綜上，低pH條件下，絲氨酸家族氨基酸、芳香族氨基酸、丙酮酸族氨基酸、天冬氨酸、脯氨酸和精氨酸的合成被削弱，而組氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的合成可能增強。總之，低pH條件下大部分氨基酸合成削弱了，但是堿性氨基酸組氨酸、賴氨酸的合成增強，這將有助于菌株抵御酸脅迫。

圖6 氨基酸合成途徑

2.3.4 細胞壁肽聚糖合成途徑

細胞壁作為細胞最外層的保護屏障，對于維持菌體的正常形態和抵抗滲透壓具有重要作用。在低pH條件下，細胞壁可以通過限制H+或酸性物質進入細胞來抵御酸脅迫。小白鏈霉菌細胞壁主要由多層肽聚糖囊狀結構和嵌插、鑲嵌其中的磷壁酸(teichoic acid，TA)、蛋白質等物質組成。作為小白鏈霉菌細胞壁主要成分——肽聚糖的生物合成可大致分為三個階段：細胞質中UDP-N-乙酰壁酰五肽(UDP-N-acetylmuramic acid-pentapeptide，UDP-MurNAc-pentapeptide)的合成、細胞膜中雙糖肽亞單位的形成和胞外肽聚糖鏈的交聯[16-17]。6-磷酸果糖是肽聚糖合成起始物，UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc)和UDP-N-乙酰胞壁酸(UDP-MurNAc)是肽聚糖聚糖鏈的基本組成單位，在低pH條件下，果糖磷酸激酶[scrk, SAZ_RS13190(-2.83倍)、SAZ_RS15195(-4.29倍)]和UDP-N-乙酰壁酸脫氫酶(glmM, -2.3倍)下調，使得肽聚糖合成整體受限。相較于pH 5.5，UDP-N-乙酰壁氨酰丙氨酸-D-谷氨酸連接酶(murD,-3.89倍)和UDP-N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酰-D-谷氨酸-2,6-二氨基吡啶連接酶[murE, SAZ_RS37110(-2.64倍)、SAZ_RS13835(-2.14倍)]下調，這會導致UDP-MurNAc-五肽的肽尾合成削弱。此外，低pH時，磷酸-N-乙酰壁氨酰五肽轉移酶(mraY, 2.3倍)和甘氨酸轉移酶[femX, SAZ_RS00170(4.93倍)和SAZ_RS41770(4.93倍)]，揭示肽聚糖合成第二階段的增強。令人驚訝的是，關于肽聚糖交聯的糖基轉移酶、DD-轉肽酶和DD-羧肽酶多個同工酶表現出顯著上調，說明低pH條件下肽聚糖的初級交聯、次級交聯的速度增加(圖7)。

圖7 細胞壁肽聚糖合成途徑

2.3.5 細胞膜脂肪酸合成途徑

脂肪酸的合成可分為兩個階段：初始反應和循環反應。在起始反應中，乙酰-CoA羧化酶和丙二酰轉移酶首先催化乙酰-CoA形成丙二酸單酰ACP，然后β-酮酰基ACP合成酶Ⅲ催化丙二酸單酰ACP和乙酰ACP縮合形成β-酮酰基ACP，這些反應完成后，脂肪酸的合成進入循環反應階段[18]。循環反應階段是在在Ⅱ型脂肪酸合酶的催化下經縮合、β還原、脫水、烯酰還原4個反應重復進行脂肪酸的合成，每進行1次循環脂肪酸碳鏈長度增加2個碳原子，形成的脂肪酸有4～18個碳不等。而乙酰-CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)是脂肪酸合成的第一個限速酶[19]。如圖8所示，pH 4.0條件下，乙酰-CoA羧化酶基因下調(acc, -2.07倍)，表明在低pH環境下脂肪酸合成起始反應階段受到限制。此外參與脂肪酸循環反應階段的酶也出現不同程度下調，表明脂肪酸循環反應階段也受到限制。然而酰基載體蛋白基因[acp, SAZ_RS36395(10.27倍)、SAZ_RS15400(10.06倍)和SAZ_RS03525(7.73倍)]在pH 4.0條件下顯著上調，在脂肪酸合成受限的情況下這將有助于增加脂肪酸的合成速度。環丙烷脂肪酸有助于微生物抵御酸脅迫[20]，在pH 4.0時，環丙烷脂肪酰磷脂合酶(cfa, 4.99倍)顯著上調，表明S.albulusM-Z18可能通過增加細胞膜中環丙烷脂肪酸含量抵御酸脅迫。此外，在pH 4.0條件下，脂肪酸去飽和酶(desA, 3.23倍)基因上調，推測細胞膜脂肪酸的不飽和度增加。綜上，S.albulusM-Z18脂肪酸合成整體減弱，但是細胞膜中不飽和脂肪酸的比例、環丙烷脂肪酸的含量可能增加。

圖8 細胞膜脂肪酸合成途徑

2.3.6 蛋白質和核苷酸修復分子

分子伴侶對細胞中的蛋白質在生理和壓力條件下的正確折疊至關重要，其可以防止未折疊多肽的聚集和變性多肽的正確再折疊[21]。在低pH環境中，分子伴侶蛋白DnaK[SAZ_RS39120(8.57倍)、SAZ_RS21050(2.41倍)和SAZ_RS43735(2.04倍)]、DnaJ(2.95倍)和GroES(2.31倍)均表達上調，而水解錯誤折疊錯誤蛋白的Clp蛋白酶基因全部上調，表明低pH環境中S.albulusM-Z18修復折疊錯誤蛋白質能力的增強(表2)。

在酸脅迫環境中細菌DNA通常會受到損傷，因此細菌通常有DNA的修復機制以保持基因組的完整性。當DNA結構有較大損傷或DNA鏈多處嚴重損傷會誘導核苷酸的切除修復。在低pH環境中，參與核苷酸片段切除修復的Uvr A(3.07倍)、UvrB(5.28倍)、DNA聚合酶I(4.5倍)和連接酶(2.81倍)基因表達上調，S.albulusM-Z18的核苷酸切除修復能力增強。而當DNA雙鏈發生斷裂，則需要非同源末端連接的修復及基因的同源重組。pH 4.0時，Ku蛋白(11.24倍)、DNA聚合酶(6.11倍)RecA蛋白(6.77倍)這些參與非同源末端連接修復和同源重組的基因顯著上調(表2)。綜上，在低pH環境中S.albulusM-Z18通過增強蛋白質和DNA修復能力以應對低pH脅迫造成的蛋白質和DNA損傷。

表2 蛋白質、DNA保護與修復相關的差異表達基因

2.3.7 耐酸系統

為了維持胞內環境中pH的穩態，微生物主要通過阻礙細胞外H+的進入、增強細胞內酸性物質的排出和消耗來實現。微生物細胞可以通過氨基酸脫羧、脫氨反應、尿素水解反應來消耗、中和胞內的H+。經轉錄組數據的分析，在S.albulusM-Z18中存在完整的谷氨酸脫羧酶系統、谷氨酸-谷氨酰胺轉運蛋白系統、不完整的賴氨酸脫羧酶系統、胍基丁胺脫亞氨酶系統、尿素酶系統和精氨酸脫氨酶系統。如圖9所示，低pH環境中尿素酶系統相關基因顯著上調，其中尿素酶亞基α(urease subunit alpha ，UreC)、鎳轉運蛋白(nickel permease，NixA)上調了84.64倍和47.97 倍。在低pH環境中，尿素酶系統可能對維持胞內環境中pH的穩態起著重要作用。

圖9 耐酸系統組分

此外，谷氨酸脫羧酶系統中的谷氨酸脫羧酶(gadB, 2.85倍)、谷氨酸-GABA反向轉運體[gadC, 3.68倍)、SAZ_RS03735(5.28倍)]，谷氨酸-谷氨酰胺轉運蛋白系統中的谷氨酰胺酶(glsA, 5.39倍)，胍基丁胺脫亞氨酶系統中的胍基丁胺脫亞氨酶[augA, SAZ_RS39900(7.89倍)、SAZ_RS39905(2.75倍)]在pH 4.0環境中都顯著上調。綜上，在低pH環境中S.albulusM-Z18可能通過增強多種耐酸系統來抵御低pH的脅迫。

3 結論與討論

小白鏈霉菌是工業生產ε-PL的主要生產菌，其發酵過程中pH會自發下降至3.0左右，需要流加氨水維持發酵過程中pH的穩定。通過不同pH的分批發酵培養，其可以在pH 3.5及以上的培養基中正常生長，這證明S.albulusM-Z18具有較強的酸耐受性。

通過恒化培養，使得菌體達到穩定狀態以消除S.albulusM-Z18在不同pH環境中因比生長速率造成的生長差異。取此時的樣品用于分析菌株在不同pH值(4.0和5.5)下基因轉錄的差異。pH 4.0條件下，共有3 893個基因差異表達達到顯著，其中顯著上調的基因有1 786個，顯著下調的基因有2 107個。GO分析顯示顯著差異表達基因主要集中于生物過程，而KEGG分析顯著差異表達基因集中在代謝途徑。具體分析顯著差異表達基因富集的代謝途徑，低pH環境中S.albulusM-Z18通過增強糖代謝中糖酵解第三階段、三羧酸循環途徑、氧化磷酸化途徑和戊糖磷酸途徑的氧化階段來增強能量的合成，這將有助于菌株在低pH條件下存活；pH 4.0條件下大部分氨基酸的合成被削弱，但堿性氨基酸組氨酸和賴氨酸的合成增加了。細胞壁作為阻礙胞外H+的第一道屏障，據報道酸脅迫中細菌細胞壁的厚度會減小[22-23]。轉錄組分析顯示pH 4.0條件下S.albulusM-Z18肽聚糖的合成整體上削弱，這與文獻報道一致，但是催化肽聚糖交聯的酶的基因幾乎全部上調，推測菌株可能是通過增加肽聚糖的組裝速度以維持酸脅迫環境中完整的細胞形態。除了細胞壁，細胞膜也是阻礙胞外H+進入胞內的外界屏障，很多研究報道顯示微生物在面對酸脅迫時，細胞膜脂肪酸會發生相應的改變以適應不利環境，這包括增加脂肪酸的不飽和度、平均碳鏈長度和環丙烷脂肪酸的含量[24-25]。本文研究發現，低pH環境中S.albulusM-Z18關于合成不飽和脂肪酸、環丙烷脂肪酸相關基因顯著上調，說明低pH環境中S.albulusM-Z18可能改變細胞膜脂肪酸成分，以適應酸脅迫環境中和外界之間物質和信息的交互。低pH脅迫時往往會造成微生物中蛋白質折疊錯誤、變性，DNA堿基錯配、插入或缺失等損傷。同樣發現pH 4.0條件下S.albulusM-Z18中分子伴侶、Clp蛋白酶上調、核苷酸切除修復和非同源末端連接相關基因也表達上調，說明低pH環境下蛋白質和DNA損傷的修復增強。胞內pH穩態對于耐酸微生物在低pH環境中維持正常生理生化反應具有重要意義。耐酸系統通過消耗胞內的H+、產生堿性物質來維持胞內pH穩態。革蘭氏陽性菌中已報道的多數耐酸系統基因在S.albulusM-Z18基因組中都可以找到。pH 4.0條件下，谷氨酸脫羧酶系統、谷氨酰胺酶-谷氨酰胺轉運蛋白系統、胍基丁胺脫亞氨酶系統、尿素酶系統和精氨酸脫氨酶系統都發生不同程度的上調，其中尿素酶系統相關基因上調最為顯著，尿素酶系統可能起著重要的作用。通過以上研究，確定S.albulusM-Z18有著不同于一般鏈霉菌的酸耐受能力。發現在低pH環境中，S.albulusM-Z18可能通過增強胞內代謝產能、堿性氨基酸的合成，改變細胞膜成分，維持細胞壁完整性，加強蛋白質、DNA損傷修復的能力，上調耐酸系統相關基因表達以應對低酸脅迫。然而，關于S.albulusM-Z18的耐酸分子機制還需要進一步分子生物學水平的驗證。