植物乳桿菌DY6的生理特性及代謝機制分析

劉穎穎，盧艷波，楊小雁，馬忠瑪，毛銀，周勝虎，鄧禹*

1(江南大學，糧食發酵工藝及技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)2(山東省油脂油料精深加工技術重點實驗室，山東渤海實業集團有限公司，山東 濱州，256500)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)廣泛存在于動物、植物、人類體表和體內，以及眾多發酵食品等自然和人工環境中。植物乳桿菌具有較強的糖代謝和產酸能力，擁有大量的碳水化合物水解酶和糖基轉移酶等酶系[1]，因此可以利用糖類等碳源產生大量乳酸、乙酸和雙乙酰等，這些代謝產物對病原體和致病菌具有顯著的抑制作用[2]。此外，植物乳桿菌利用氨基酸可以合成眾多的風味化合物，主要依賴于氨基酸分解代謝途徑中氨基轉移酶和脫羧酶。植物乳桿菌因其豐富的益生代謝產物和酶系而常被廣泛應用于食品發酵、動物飼料、工業生產和醫療保健等領域。

自2001年第1株乳酸菌(Lactococcuslactissubsp.lactisIL1403)全基因組測序完成，乳酸菌基因組測序便進入了新時代[3]。多種植物乳桿菌全基因組信息得到破譯并進行了功能基因解析[1]。ZHANG等[4]使用全基因組學和蛋白質組學等技術，從植物乳桿菌P-8中篩選出大量與葡萄糖代謝相關的差異表達蛋白，并預測了其特異性功能。結果表明菌株主要通過減少葡萄糖消耗和增加葡萄糖生成，從而積累或消耗氨基酸、改變細胞膜等多種生存機制來應對葡萄糖饑餓反應。目前全球范圍內被廣泛用于研究的鼠李糖乳桿菌LGG、嗜酸乳桿菌NCFM和干酪乳桿菌代田株等都經過了多種益生特性和基因組的研究[5-6]。然而，國內目前對于植物乳桿菌資源的綜合開發和利用大多還集中在發酵菌株的篩選及菌株自身發酵工藝優化等領域，對于發酵菌種的功能特性與優異模式菌株的關聯研究還遠遠不足。因此，通過與模式菌株的基因序列比對和基因組結構分析，更深入地了解植物乳桿菌生理特性和表型具有重要意義。

目前，植物乳桿菌WCFS1是測序較早、遺傳信息較全面的乳桿菌菌株，具有代謝多樣性，生長速度快，糖攝取率高等特點，常被作為模式菌株進行研究[7-8]。本團隊前期篩選獲得了1株植物乳桿菌DY6，具有生長速率快、產酸能力強、代謝產物豐富等特點，具有成為乳桿菌模式菌株的潛質，但是缺少遺傳信息。因此，本研究首先對比了植物乳桿菌WCFS1和DY6的生理特性和益生功能，隨后通過基因組重測序和比較基因組技術，系統分析了植物乳桿菌WCFS1和DY6的遺傳差異，挖掘重要性狀相關的功能基因，對以植物乳桿菌DY6為模式菌株的系統生物學以及代謝工程研究和應用奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

植物乳桿菌DY6為實驗室保藏，植物乳桿菌WCFS1購自北京北納創聯生物技術研究院，大腸桿菌(ATCC25922)和沙門氏菌(ATCC14028)均購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養基

MRS培養基(g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨10，牛肉膏8，酵母浸出粉4，磷酸氫二鉀2，檸檬酸三銨2，醋酸鈉5，七水硫酸鎂0.58，四水硫酸錳0.25，吐溫80 1 mL，pH 6.3～6.5。發酵培養基(g/L)：碳源(分別選用蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖)20，胰蛋白胨10，牛肉膏8，酵母浸出粉4，磷酸氫二鉀2，檸檬酸三銨2，醋酸鈉5，七水硫酸鎂 0.58，四水硫酸錳0.25，吐溫80 1 mL，pH 6.3～6.5。所有培養基均經過115 ℃、30 min滅菌后使用，其中固體培養基需額外添加2%(質量分數)的瓊脂粉后進行滅菌。

1.1.3 儀器和試劑

UV-1800分光光度計，日本Shimadzu公司；CFX96實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；1260Ⅱ高效液相色譜，美國安捷倫公司；Master-S15實驗室純水系統，上海和泰儀器有限公司等。

葡萄糖、胰蛋白胨、牛肉膏、醋酸鈉、吐溫80、二甲苯、乙酸乙酯、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、氯化鈉、三氯乙酸、三乙胺、甲醇、乙腈、胃蛋白酶、豬膽鹽、胰蛋白酶等，國藥化學試劑有限公司。

1.2 乳酸菌生理學特性測定

1.2.1 菌株培養和菌懸液制備

挑取單菌落接種在MRS液體培養基中，在37 ℃、250 r/min條件下培養12～16 h，獲得種子液。將種子液按照2%的接種量轉接到裝有50 mL液體培養基的250 mL搖瓶中，在37 ℃、250 r/min條件下培養48 h。取上述24 h發酵液，在4 ℃、8 000 r/min條件下離心5 min，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2次后重懸，調至OD600值為0.8～0.9，獲得菌懸液。本研究所有檢測均進行了3次重復試驗，誤差線代表3次實驗的方差。

1.2.2 代謝產物檢測

發酵液在12 000 r/min離心10 min后取上清液與10%的三氯乙酸等體積稀釋，放置1 h后經雙層濾紙過濾，濾液在15 000 r/min離心30 min后采用Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色譜測定代謝產物。檢測乳酸和乙酸等有機酸時色譜柱為BIO-RAD Aminex HPX-87H Column 300 mm×7.8 mm，0.6 mL/min的5 mmol/L H2SO4洗脫，柱溫為35 ℃，采用示差檢測器。檢測氨基酸時采用Agilent Hypersil ODS柱40 ℃梯度洗脫，流動相A為27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃(體積比為500∶0.11∶2.5)，流動相B為80.9 mmol/L醋酸鈉-甲醇-乙腈(體積比為1∶2∶2)，流動相pH為7.2。洗脫程序：0 min，8% B；17 min，50% B；20.1 min，100% B；24 min，0% B；紫外檢測器檢測波長為338 nm，脯氨酸以262 nm檢測；氨基酸含量以1 nmol/μL的21種氨基酸標準品定量。

1.2.3 生理特性測定

植物乳桿菌的酸和膽鹽的耐受性測定參考王祎然等[9]的方法。將活化后的菌液按2%接種量分別接種于pH為2.0、2.5和3.0的MRS液體培養基中，對照組是pH為6.0的MRS培養基，37 ℃靜置培養4 h，取0 h和4 h樣進行平板菌落計數，計算不同酸性條件下的存活率(公式1)。將活化后的菌液按2%接種量分別接種于含0.1%、0.2%、0.4%、0.6%(質量分數)豬膽鹽的MRS液體培養基中，以不加豬膽鹽的MRS培養基為對照，37 ℃培養4 h，取0 h和4 h樣品進行平板菌落計數，計算不同豬膽鹽含量條件下的存活率(同公式1)。取1 mol/L 鹽酸溶液20 mL，用氫氧化鈉溶液將其pH調至3，加入胃蛋白酶使其終質量濃度為1 g/100mL，0.22 μm微孔濾膜除菌制備模擬胃液[10]。500 mL水溶解6.8 g磷酸二氫鉀，用氫氧化鈉溶液調pH至6.8，加入10 g胰蛋白酶后定容至1 000 mL，0.22 μm 微孔濾膜除菌制備模擬腸液[10]。將0.5 mL菌懸液加至4.5 mL模擬胃液或腸液[9]中37 ℃孵育3 h，利用平板計數法分別測定0 h及3 h時的菌數，以菌株的存活率評估植物乳桿菌對模擬胃腸液的耐受能力，計算如公式(1)所示。植物乳桿菌的自聚集和共聚集能力測定參考COLLADO等[11]的方法。將1 mL菌懸液旋渦振蕩10 s后37 ℃孵育5 h，輕取200 μL上層懸液，測量OD600值(A2)，A1為初始菌懸液的吸光值，自聚集能力計算如公式(2)所示。將等體積的乳桿菌與大腸桿菌和沙門氏菌菌懸液分別混合，渦旋振蕩10 s后37 ℃孵育5 h，輕取200 μL上層懸液，測量OD600值(A5)，A3和A4分別為受試菌與致病菌菌懸液單獨處理5 h的吸光值，共聚集能力計算如公式(3)所示。參照BURNS等[12]的方法，并稍作改動，取2 mL菌懸液于3支5 mL離心管中，依次加入2 mL二甲苯和乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min后在通風廚中靜置30 min，水相的吸光值(A2)和初始菌懸液吸光值(A1)計算如公式(4)所示：

(1)

(2)

(3)

(4)

1.3 基因組DNA重測序

菌株在37 ℃、250 r/min培養12 h后，采用磁珠法進行基因組DNA提取，用于基因組文庫構建。對測序得到的原始數據進行質量評估后，使用BWA將樣本有效數據比對到參考基因組上，利用GATK的Haplotype Caller分析樣品和參考基因組之間的基因型差異，并使用SnpEff軟件根據參考基因組的注釋信息對突變進行注釋和分析。

1.4 重要功能基因實時熒光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)驗證

使用RNApure Bacteria Kit試劑盒提取mRNA，去除基因組DNA、反轉錄和qRT-PCR用到的試劑盒分別是HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit和UltraSYBR Mixture，購自康為世紀生物科技有限公司。以乳桿菌cDNA為模板，16S作為內參基因，乙酸激酶(ack1)、丙酮酸羧化酶(pycA)、L-乳酸脫氫酶(ldhl2)、磷酸果糖激酶(fruK)、磷酸轉乙酰酶(pta)、丙酮酸脫氫酶系E1(pdhA)和丙酮酸脫氫酶系E2(pdhC)為目標基因，根據2-ΔΔct方法計算基因相對表達量[13]。所有的引物由金唯智生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物

2 結果與分析

2.1 體外益生特性評價

植物乳桿菌為宿主提供有益效果的前提是通過胃的酸性環境和腸液中的高膽汁鹽環境，以活菌狀態達到腸道。研究表明菌株的耐酸和膽鹽的脅迫主要與谷氨酸脫羧酶系統、氨的產生和表層蛋白的影響等相關[14]。已有研究報道WCFS1具有較好的膽鹽耐受力，在體外模擬胃腸液中表現出較高的存活率，以及在健康志愿者體內都顯示出較高的存活能力[15]。隨著pH的降低，WCFS1和DY6的存活率快速下降(圖1-a)，在不同酸性環境下兩株菌的存活率無顯著差異，說明DY6與WCFS1的耐酸性相當；在不同質量濃度的豬膽鹽脅迫4 h后，DY6菌株存活率均略高于WCFS1，在0.6%(質量分數)豬膽鹽條件下依然能保持30%以上的存活率(圖1-b)。通過人工配制胃液及腸液模擬益生菌進入人體后在腸胃中所處的消化環境，研究發現DY6在模擬胃液和腸液中的存活率均高于WCFS1，表明DY6對于耐受胃腸環境同樣具有較強的優勢地位。

胃的低pH環境和胃蛋白酶的共同作用也是抗菌的有效屏障，體內乳酸菌通過與病原菌共聚，使其在密切相互作用中釋放出抗病原體的物質，進一步防止腸道病原體黏附和腸道定殖，通常與細胞表面黏附蛋白有關[16]。本研究發現DY6的自聚集能力是WCFS1的1.58倍(圖1-d)，DY6和WCFS1分別與大腸桿菌和沙門氏菌的共聚集能力略高于DY6(圖1-e)，表明DY6在抑制病原菌的生長同樣具有優勢。乳酸菌的疏水性與細胞表面黏附性存在正相關，本研究中采用二甲苯和乙酸乙酯檢測表面疏水性[14]。與二甲苯相比，兩株菌對乙酸乙酯的疏水性最佳(圖1-f)；與WCFS1相比，DY6的疏水性能較差，因此WCFS1可能具有更佳的腸道上皮細胞黏附能力。

2.2 DY6和WCFS1的發酵特性評價

2.2.1 DY6和WCFS1的發酵特性

植物乳桿菌在利用葡萄糖發酵過程中的關鍵作用是產生具有防腐作用的乳酸和乙酸等，這些有機酸的積累導致pH值急劇下降，是抵御病原體的主要機制[2]。WCFS1基因組編碼的糖酵解和磷酸酮酶途徑的全部酶都屬于潛在的高表達基因類型，并且丙酮酸的代謝能力更強，產生較多的其他代謝產物如乳酸、乙酸和甲酸等[17]。圖2-a和圖2-b表示DY6和WCFS1以葡萄糖為唯一碳源的生長和代謝差異情況，整個發酵過程中DY6的生長性能優于WCFS1，發酵終點時OD600值相差25.27%。由于高數量和高活性的植物乳桿菌活菌是定植胃腸道發揮益生作用的前提，而DY6擁有優異的生長活性使菌株能夠更多的抵達腸道，進而才能通過合成抗菌物質和與其他菌群和宿主互作等方式維持腸道健康。植物乳桿菌產酸能力同樣是衡量菌株發酵活性的重要指標，DY6的乳酸產量比WCFS1高17.5%，并且發酵過程中DY6的乳酸糖酸轉化率比WCFS1更高。其中在8～12 h時，DY6的糖酸轉化率超過100%，表明菌株可以利用其他化合物轉化為乳酸。乳酸產量明顯增加的直接效應是周圍環境的pH值的降低，進而能夠抑制病原菌生長。DY6在以葡萄糖為碳源時的優異產乳酸性能可能與乳酸脫氫酶調控的乳酸合成途徑有直接關系。此外，兩株菌產生少量乙酸可能是由于葡萄糖限制導致丙酮酸轉化為乙酸，WCFS1發酵終點的代謝產物中乙酸的產量比DY6高了21.84%，推測是WCFS1的其余碳源主要流向乙酸，并導致乳酸的產量低于DY6，或者DY6代謝中產生的乙酸被機體消耗或合成其他物質。植物乳桿菌發酵產生的其他有機酸除了降低pH的作用外，在改善心血管代謝性疾病、維持健康血壓等方面也具有積極作用。DY6代謝產物中還有少量的其他有機酸如蘋果酸、草酰乙酸和丁酸，分別比WCFS1高了5.95%、69.54%和19.31%，丙酸比WCFS1低了7.87%?？傊?，DY6從整體上表現出具有較強的生長活性和產酸能力。然而，為最大限度的開發和利用菌株，還需要從基因層面對DY6的生長和發酵代謝特性相關機制做深入的研究。

2.2.2 DY6和WCFS1的碳源利用研究

乳酸菌屬于化能異養型微生物，缺乏對許多有機化合物的合成能力，菌株能否在不同環境下進行代謝活動很大程度上取決于營養物質的供給，因而不同碳源的培養基是影響菌株代謝的重要因素之一[18]。研究表明植物乳桿菌WCFS1可以有效代謝多種碳水化合物，并產生大量乳酸，在制備低糖酸奶等應用中顯示出巨大潛力[8]。為研究植物乳桿菌DY6對不同碳源的利用情況，以蔗糖(圖2-c)、半乳糖(圖2-d)、果糖(圖2-e)和麥芽糖(圖2-f)作為唯一碳源分別培養DY6和WCFS1。發現表型差異最明顯的是果糖為碳源時，兩株菌的乳酸產量和OD600值分別相差3 387.22%和69.22%，表明DY6具有優異的果糖代謝能力，能夠為菌株的生長提供能量。利用果糖為碳源時，除有機酸外還能產生其他高附加值產物，如甘露醇和山梨醇等。DY6在果糖代謝中碳源主要用于乳酸的生產，推測催化果糖磷酸化的果糖激酶對調控DY6的生長和代謝起著重要作用。半乳糖代謝中兩株菌的乳酸產量和OD600值分別相差46.98%和1.41%，推測半乳糖進入Leloir途徑后碳源主要用于乳酸的生產。麥芽糖和蔗糖代謝中DY6的乳酸產量和生長情況略高于WCFS1。DY6代謝產物中乙酸、檸檬酸、蘋果酸等其他有機酸含量基本都低于WCFS1，推測DY6代謝中碳源主要用于菌株的生長和乳酸的產生。基于DY6在利用碳水化合物方面表現出更高的效率和更強的能力，表明菌株在富含果糖和半乳糖的碳水化合物的環境中的適應能力更強。

2.2.3 DY6和WCFS1的氨基酸代謝差異

富含氨基酸的有機氮源具有調節胞內pH、提供營養成分的合成前體和產生代謝能量或氧化還原能力等多種作用，因此氨基酸的合成和分解直接影響菌體的耐酸性能、生長代謝和發酵產品特定風味的形成[19]。與WCFS1相比，DY6的精氨酸(1 036.03%)和天冬氨酸(488.83%)的需求量最為顯著(圖2-g)。精氨酸分解代謝途徑主要是精氨酸脫氨酶途徑(arginine deiminase pathway,ADI)，由精氨酸到鳥氨酸、氨氣和二氧化碳的轉化，同時產生ATP。當產能營養物質耗盡時，DY6大量消耗精氨酸生成的ATP可能用于延長細胞的存活時間。此外，ADI途徑也是菌體進行pH自我平衡的機制之一，代謝產生氨氣與胞質氫離子結合生成銨根離子，從而使pH升高。推測大量消耗的精氨酸對菌株較好的耐酸性能有積極的促進作用。天冬氨酸通過天冬氨酸脫羧酶等酶進行催化產生乙偶姻、富馬酸等產物，形成的脫羧反應作為能源來源和外邊酸性的pH保護系統。谷氨酸的脫羧反應也是增強細胞耐酸性的途徑之一，谷氨酸代謝消耗氫離子產生γ-氨基丁酸，使pH得到提升。DY6消耗的谷氨酸(86.18%)顯著低于WCFS1，WCFS1能夠產生大量γ-氨基丁酸86.44%，同時也提高了菌株對酸的耐受性。此外，甲硫氨酸(72.16%)的需求量明顯低于WCFS1，可能影響甲基的供給和甲基化反應。DY6的纈氨酸(80.52%)生產能力最強，有利于提高發酵中揮發性風味物質的產量。

a-發酵過程中的生長和有機酸生產水平;b-單位干重乳酸產量;c～f-蔗糖、半乳糖、果糖、麥芽糖分別為唯一碳源時DY6和WCFS1的菌株差異;g-DY6和WCFS1氨基酸代謝情況差異

2.3 DY6全基因組重測序

2.3.1 變異位點檢測和注釋

結合植物乳桿菌DY6基因組重測序數據(表2)與參考基因組(NC_004567.2)之間比對的結果，發現植物乳桿菌DY6樣品的差異基因的位點共20 368個，其中SNP 19 396個，INDEL 972個，注釋到的差異基因有4 331個，突變類型包括移碼框未改變的插入(84個)、移碼突變(190個)、終止密碼子丟失和拼接區變異(62個)、錯義突變(3 990個)和起始密碼子丟失(5個)，DY6中主要是發生錯義突變。

表2 基因組重測序數據統計

2.3.2 KEGG通路變異基因富集分析

在KEGG數據庫中植物乳桿菌DY6共注釋到的基因數目為1 350個，變異基因數目為701個，注釋的通路為27個，包括細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、新陳代謝和機體系統五個方面(圖3-a)。在新陳代謝方面占比超過一半，注釋的13個通路主要包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝和維生素代謝等。其中碳水化合物代謝途徑注釋的基因數目最多，主要包括丙酮酸代謝、果糖和甘露糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、磷酸戊糖代謝等，在基因水平上顯示出菌株利用碳源進行能量代謝和轉化中間產物的潛力。此外在氨基酸代謝途徑中注釋到82個基因，包含蛋氨酸、天冬氨酸和精氨酸等代謝途徑。

2.3.3 丙酮酸代謝途徑解析

乳酸菌的整個代謝過程主要是從糖中快速并且最大限度地生產乳酸等其他代謝產物的關鍵控制點在糖酵解中的丙酮酸代謝。本研究注釋到DY6中丙酮酸相關代謝途徑的大量基因(圖3-b)，fruK作為糖酵解途徑的限速變構調控酶，其酶活的高低可根據細胞對能量的需要進行調節，從而控制糖酵解代謝流和生長速率。DY6的生長活性顯著高于WCFS1，推測DY6代謝中fruK可能存在正突變，加快葡萄糖碳源流向糖酵解途徑，滿足細胞生長所需的能量和物質。此外，DY6代謝中丙酮酸通過Idhl2產生的乳酸含量明顯優于WCFS1，通過pta和ack1催化產生的乙酸低于WCFS1，由于其余有機酸含量顯著低于乳酸和乙酸，推測ldhl2可能存在正突變，使丙酮酸代謝流向乳酸代謝增多。丙酮酸通過pycA轉化為草酰乙酸后，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳，磷酸烯醇式丙酮酸水平的增加可以加強糖酵解的阻滯，降低葡萄糖攝取率，pycA和pck的基因變化是否對菌株的影響還需要進一步試驗證明。丙酮酸脫氫酶系催化丙酮酸到乙酰輔酶A是糖的有氧氧化和氧化磷酸化的連接結點，在能量代謝中起著重要的作用，催化該反應的pdhC中插入一段序列為LysAlaGluThrProAlaAla，以及pdhA中存在一個差異基因，但這些差異基因的變化是否導致了生長和代謝產物的變化則還需要進一步試驗證明。

2.3.4 碳水化合物代謝途徑解析

碳水化合物代謝能力是細菌培養和選擇的重要指標，乳酸菌利用多種碳水化合物的能力是居住在胃腸道或能夠居住在各種生態位的生物體的一個重要屬性[20]。乳酸菌利用磷酸轉移酶系統(phosphotransferase system,PTS)將單糖和雙糖轉運到細胞內代謝，WCFS1中編碼25個完整的PTS酶Ⅱ復合物(EⅡ)和幾個不完整的復合物，遠遠超過在其他微生物基因組中發現的PTS數量[17]。DY6中注釋到26個PTS轉運蛋白的EⅡ共發生93個突變位點。豐富的PTS轉運載體對植物乳桿菌DY6的碳源利用極為重要，這可能也是DY6具有優越的產酸和耗糖性能的重要原因。推測PTS中存在正向突變，使其具有較強的碳水化合物轉運能力，提高菌株在復雜環境中碳水化合物的利用率。DY6在果糖、蔗糖、麥芽糖和半乳糖代謝途徑中注釋的基因如圖3-b所示。果糖激酶屬于一種磷酸轉移酶，催化果糖形成果糖-6-磷酸后進入糖酵解途徑。由于果糖可以繞開糖酵解入口的己糖激酶和磷酸果糖激酶的限速酶，進而不受其他多種因素的嚴密調節，可以迅速進入代謝途徑，并且與葡萄糖氧化放出的能量相同[21]。結合DY6在果糖代謝中表型差異最為顯著，推測果糖激酶(sacK1、sacK2)、果糖特異性EIIABC(fruA)和EIIBC(PTS31BC)組分可能發生正突變，加快碳源流向乳酸的合成。乳糖經β-半乳糖苷酶(lacA)的作用下被水解為葡萄糖和半乳糖，隨后這兩種單糖分別進入糖酵解途徑和Leloir途徑。乳糖的不徹底分解造成的半乳糖積累，半乳糖的存也會影響發酵乳制品的品質和烘培制品的風味[22]。DY6中注釋到D-半乳糖進入Leloir途徑后，經醛糖1-表異構酶(galM)等酶催化生成UDP-葡萄糖后轉變為葡萄糖-1-磷酸進入糖酵解途徑中。DY6利用半乳糖具有較好的產乳酸性能，推測可能存在正突變加快半乳糖水解。蔗糖-6-磷酸水解酶(scrB)和α-葡萄糖苷酶(Ip_0193)分別水解蔗糖和麥芽糖為單糖，結合菌株表型代謝中的差異，推測scrB和Ip_0193可能存在正向突變，加快碳源代謝。

2.3.5 氨基酸代謝途徑解析

不同乳酸菌菌株由于其代謝路徑不完全相同，對其生長所需要的必需和非必需氨基酸的數量和類型也就不同，而氨基酸的合成分解又直接影響菌體的生長代謝。甲硫氨酸是生命體所必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸，為肌酸等轉甲基化反應、DNA等甲基化提供甲基及抗氧化防御[23]。甲硫氨酸和半胱氨酸的合成和代謝中注釋的差異基因有蛋氨酸腺苷轉移酶(metK)和S-腺苷同型半胱氨酸核苷酸酶(mtn)等酶(圖3-b)。在對數生長期中催化同型半胱氨酸合成甲硫氨酸所編碼的酶表達量具有明顯的上調，與甲硫氨酸生物合成相關的酶對菌株生長具有顯著影響[24]。結合甲硫氨酸消耗量較少推測可能是metK或mtn發生負突變造成甲硫氨酸代謝途徑抑制。谷氨酸脫羧酶(gadB)對L-谷氨酸具有專一性，在磷酸吡哆醛作為其輔酶因子的條件下，催化L-谷氨酸進行不可逆的α-脫羧反應合成γ-氨基丁酸。結合DY6的γ-氨基丁酸產生量低于WCFS1，推測gadB可能發生負突變，影響γ-氨基丁酸的合成，從而對菌株的耐酸性能產生影響。谷氨酸是其他氨基酸合成的關鍵中間體，在谷氨酸脫氫酶(gdh)催化下產生檸檬酸循環的中間代謝產物α-酮戊二酸和氨氣，并釋放能量。L-谷氨酸和谷氨酰胺代謝途徑中注釋到在氨甲酰磷酸合成酶(carB)和鳥氨酸氨基甲酰轉移酶(argF)等酶的催化下合成瓜氨酸。L-瓜氨酸和L-天冬氨酸共同反應得到L-精氨琥珀酸，隨后在精氨琥珀酸裂解酶(argH)催化下生成延胡索酸和精氨酸，后者繼續反應生成鳥氨酸參與反應。DY6的精氨酸大量消耗推測可能是argF發生正突變，造成精氨酸迅速被代謝。

a-KEGG通路變異基因功能注釋;b-果糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖和氨基酸代謝途徑;c-qRT-PCR測定丙酮酸代謝相關基因表達水平

2.4 對丙酮酸代謝相關突變基因的qRT-PCR驗證

為了在基因轉錄水平上解釋其發酵差異，選取產有機酸關聯緊密的丙酮酸代謝途徑(圖3-b)，對該過程中注釋的7個關鍵酶(pdhC、ack1、Idhl2、pta、fruK、pdhA和pycA)的基因表達量進行測定。以WCFS1的基因表達量為1作為標準，發現pdhC基因相對表達量最高，是WCFS1的20倍。此外ack1、Idhl2、pta、fruK、pdhA和pycA的表達水平依次是WCFS1的15、14、7、6、3、2倍(圖3-c)。ack1和Idhl2的基因表達情況與表型中乙酸和乳酸產量差異變化相一致，pdhC基因相對表達最為顯著，推測可能是該序列中插入一段LysAlaGluThrProAlaAla，與其結構和催化活性相關，進而影響丙酮酸向乙酰輔酶A的轉化。

3 結論

植物乳桿菌是一種具有良好生理特性及益生功能的細菌，被廣泛應用于食品、動物飼料、工業生產和醫療保健等領域。但早期的研究主要集中在單一菌株的表型特征，如碳水化合物、生長溫度和pH等方面的生長特性研究，以及多菌株的分類學、系統發育研究和食品安全性評估等方面，缺少與優秀模式菌株的表型關聯分析。通過分析同種不同來源的菌株的性狀差異，在基因水平上進一步揭示植物乳桿菌的菌種特性、生理功能和代謝機制。本研究經過體外益生特性試驗表明DY6擁有與WCFS1同樣較強的耐酸、耐膽鹽和與致病菌的共聚集性能，表明DY6可作為潛在的益生菌株進行進一步研究。此外，在富含葡萄糖、果糖和半乳糖的培養基中DY6的生長和代謝情況顯著優于WCFS1，產乳酸性能顯著優于WCFS1。隨后發現，在DY6基因組中與丙酮酸代謝關聯的pdhC、ack1和Idhl2的基因表達量具有顯著優勢，推測可能編碼了非常強的丙酮酸代謝能力，與其發酵過程產酸快、產酸強直接相關。本研究中依據基因組重測序獲取了大量差異基因，并全面關聯到與表型差異相關的代謝途徑的所有基因，為后續以植物乳桿菌為模式菌株進行代謝機制研究提供了理論支撐。