協同兩類腈水合酶高效催化煙酰胺及丙烯酰胺生物合成

趙凱陽，黃微煜，蔡宋佳，陳員慶，吳超城，周麗，程中一，周哲敏

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

腈水合酶(nitrile hydratase，NHase)是一種可以將腈類物質通過水合作用轉化生成更有利用價值的酰胺類化合物的金屬酶[1]。在工業生產中主要用于生產丙烯酰胺和煙酰胺等[2]。其中，煙酰胺是維生素B族的一員，廣泛應用于醫藥、化妝品及食品等行業；丙烯酰胺及其聚合物主要應用于凝結劑、土壤改良劑及石油回收劑等行業。因此，開發高性能的腈水合酶催化劑，實現酰胺類產物的高效合成具有重要的工業應用價值和經濟價值。

根據腈水合酶多聚體的分子質量大小，可將其分為低分子質量腈水合酶(low-molecular-mass nitrile hydratase，L-NHase)和高分子質量腈水合酶(high-molecular-mass nitrile hydratase，H-NHase)。L-NHase由B、A、E 3個亞基構成，而H-NHase由B、A、G 3個亞基構成，它們的催化反應性能有較大差異。如在大腸桿菌中表達R.rhodochrousJ1來源的L-NHase，重組L-NHase 以煙腈為底物的比酶活力比重組H-NHase(234 U/mg)高42%[3]。熱穩定性方面，H-NHase在50 ℃下放置30 min仍然具有完全的活性，在60 ℃下放置1 h則能保存50%的活性，而L-NHase穩定性則稍差。WANG等[4]用含有H-NHase的重組菌全細胞催化煙腈合成煙酰胺，在添加菌體終濃度OD600值為8時，可在105 min合成390 g/L煙酰胺；添加菌體濃度OD600值為160時，煙酰胺產量提高為508 g/L，是目前文獻報道的最高值。對底物和產物的耐受性方面，L-NHase用煙腈底物或者煙酰胺產物孵育后會導致酶活力大幅度降低，耐受性遠遠低于H-NHase。此外，不同的NHase具有不同的底物特異性，NHase的底物主要有芳香型底物(包括雜環型)、脂肪型底物兩類。H-NHase對脂肪型底物的親和性較高，尤其是丙烯腈；而L-NHase對帶有芳香環及雜環的腈類物質(例如煙腈)具有較高的活力。可見，不同類型的腈水合酶在催化反應中各有其明顯的優勢和劣勢。目前，主要通過篩選不同菌株來源的腈水合酶或對腈水合酶進行改造以獲得具有高穩定性和/或耐受性的腈水合酶，還沒有通過協同表達不同類型的腈水合酶以提供更高效的腈水合酶[5]細胞催化劑的報道。

本研究協同表達H-型腈水合酶與L-型腈水合酶，構建兼具對底物和產物耐受性高以及催化活性高的基因工程菌，實現全細胞催化合成煙酰胺及丙烯酰胺。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒與引物

克隆宿主菌株大腸桿菌JM109、表達宿主菌株BL21(DE3)為本實驗室保藏菌株。質粒pRSFDuet以及含有腈水合酶編碼基因的重組質粒BAE、BAG由本實驗室保藏。

1.2 試劑與培養基

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母粉5、氯化鈉10。

培養基中根據質粒上攜帶的抗性基因，選擇添加相應的抗生素，抗生素添加量為：卡那霉素終質量濃度為50 μg/mL，氯霉素終質量濃度為34 μg/mL。

本研究所用引物如表1所示。

表1 本研究所用引物

1.3 儀器與設備

PCR儀、凝膠成像儀、蛋白電泳儀，BIO-RAD公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計，上海美普達有限公司；pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；生物傳感儀，山東省科學院；高效液相色譜儀，日立(HITACHI)公司；Organic Acid色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，Prevail公司。

1.4 重組質粒的構建

1.4.1 BAE-BAG質粒的構建

以BAE質粒為模板，用DT7-BAE-F和DT7-BAE-R引物PCR擴增BAE基因；以pRSFDuet質粒為模板，用DT7-BAE-S-F和DT7-BAE-S-R引物PCR擴增質粒骨架；用In fusion方法組裝，構建pRSFDuet-BAE重組質粒。以BAG質粒為模板，用DT7-BAG-F和DT7-BAG-R引物PCR擴增BAG基因；以pRSFDuet-BAE重組質粒為模板，用DT7-BAG-S-F和DT7-BAG-S-R引物PCR擴增質粒骨架；用In fusion方法組裝，構建BAE-BAG重組質粒(圖1)，并經DNA測序驗證。

1.4.2 BAG-BAE的質粒的構建

以BAG質粒為模板，用DT7-BAG-F和DT7-BAG-2引物PCR擴增BAE基因；以pRSFDuet-BAE質粒為模板，用DT7-GE-S-1和DT7-BAG-S-R引物PCR擴增質粒骨架；用In fusion方法組裝，構建BAG-BAE重組質粒(圖1)，并經DNA測序驗證。

圖1 重組菌株質粒結構示意圖

1.5 重組蛋白誘導表達方法

挑取重組菌株單菌落接種于含有相應抗生素的LB液體培養基，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養至OD600值為0.6～0.8。加入終濃度為0.2 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，在24 ℃、200 r/min繼續培養20 h左右誘導目的蛋白表達。

1.6 細胞催化活力的測定方法

400 μL 125 mmol/L煙腈底物中加入100 μL OD600值為1.0的菌體細胞，25 ℃反應10 min，加入500 μL乙腈終止反應。HPLC檢測煙酰胺含量。

單位酶活力定義：25 ℃條件下，單位毫升細胞1 min 催化煙腈產生煙酰胺的量(U/mL)。

1.7 細胞耐受性測定方法

將100 μL OD600值為6.0[6]的重組菌細胞分別加入900 μL不同濃度的煙腈、煙酰胺、丙烯腈、丙烯酰胺溶液中，25 ℃下放置30 min，用10 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(KPB)(pH 7.4)清洗細胞2次，測定細胞殘余酶活。相對酶活力計算如公式(1)所示：

(1)

未經過有機試劑處理的細胞其相對酶活力為100%。

1.8 全細胞催化方法

將重組菌株用去離子水重懸，并將吸光度OD600值調整為8[7]。取50 mL菌液置于燒杯中，邊攪拌邊反應，并控制反應溫度低于30 ℃。以第一次加底物(2 g煙腈/次或者1.5 mL丙烯腈/次)為起點計時，每隔2 min取10 μL反應液加到加入990 μL乙腈中終止反應。用高效液相分析樣品中煙酰胺或者丙烯酰胺產物的量，并測定底物是否有剩余，待沒有底物剩余時繼續加底物。重復前面步驟，直到底物不能繼續被消耗。

1.9 煙腈、煙酰胺、丙烯腈、丙烯酰胺含量檢測方法

采用C18色譜柱及液相色譜，檢測煙腈、煙酰胺、丙烯腈、丙烯酰胺的含量。流動相為水和乙腈(體積比2∶1)的混合溶液。檢測波長設定220 nm，柱溫為40 ℃。流速設定為0.8 mL/min，進樣體積10 μL。

2 結果與分析

2.1 協同表達BAG和BAE菌株的構建

將含有BAE、BAG的重組質粒轉化E.coliBL21菌株[8]，獲得5種重組菌株(圖1)。重組菌株經誘導表達腈水合酶，全細胞SDS-PAGE如圖2所示。BAE和BAG都具有α和β 2個亞基，其β亞基大小略有差別，而α亞基大小相近。BAE菌株表達量明顯低于BAG菌株。BAG+BAE雙質粒菌株中，同時實現了2種類型腈水合酶的表達，其中BAE的表達水平與BAE單酶菌株相似，而BAG的表達水平低于BAG的單酶菌株。BAG-BAE菌株和BAE-BAG菌株中BAG的表達水平與BAG單酶菌株相仿，而BAE的表達水平較低。

M-標準蛋白marker

2.2 重組菌株耐受性分析

由圖3可知，BAG菌株對4種化合物的耐受性顯著優于BAE菌株。BAG+BAE、BAG-BAE、BAE-BAG菌株中協同表達BAG與BAE，使得其耐受性優于BAE菌株。其中，BAG-BAE、BAE-BAG菌株在一個質粒上同時表達了BAE和BAG兩種酶，它們對4種化合物的耐受性顯著優于將BAE和BAG兩種酶分別放在2個質粒上表達的BAG+BAE菌株，達到了與BAG菌株相仿的水平。因此，本研究協同表達BAG與BAE兩種腈水合酶，提高全細胞催化反應速率的同時，仍保留了重組菌株對底物和產物較高的耐受性。

2.3 全細胞催化合成煙酰胺

利用重組菌株細胞催化煙腈底物合成煙酰胺[9]的反應過程如圖4-a所示。反應前期BAG+BAE與BAE的反應速率基本相同；但是在反應后期，BAE由于對產物耐受性較差，反應速率明顯降低，且反應會較早停止，而BAE+BAG比BAE的耐受性更好，而且后期反應速率也很高，最終產物煙酰胺[10]的合成量高于BAE。BAG的反應速率較慢，但是耐受性最強，可以持續反應較長時間，產物量高。該結果表明通過協同表達BAG與BAE，實現了提高反應速率的目的。

由圖4-b所示，反應前期BAE-BAG反應速率很快；在反應后期，BAE-BAG由于對產物耐受性較好，反應速率也較高，但隨時間延長，底物不斷被消耗，產物不斷積累，反應速率減弱，最終產量顯著高于BAE+BAG雙質粒菌株。該結果表明將BAE和BAG構建在同一質粒上，實現了提高反應速率和產量的目的。

a-BAE、BAG、BAG+BAE菌株；b-BAE-BAG、BAG-BAE菌株

郭軍玲等[11]報道了用含有BAG的重組大腸桿菌細胞催化煙腈合成煙酰胺，在添加菌體終濃度OD600值為8時，可在105 min合成390 g/L煙酰胺；添加菌體濃度OD600值為160時，煙酰胺產量提高為508 g/L，是目前文獻報道的最高值。本文將BAG與BAE協同表達，菌株BAE-BAG在反應70 min就可以產生400 g/L煙酰胺，反應速度顯著高于文獻報道；同時，最終煙酰胺產物的產量可以提高為516 g/L；表明成功實現了協同提高催化速率和產量的目標。

2.4 全細胞催化合成丙烯酰胺

利用重組菌株細胞催化丙烯腈底物合成丙烯酰胺[12]的反應過程如圖5所示。BAE催化丙烯腈合成丙烯酰胺的速率高于BAG菌株。協同表達BAE與BAG使得催化速率接近BAE菌株。其中BAE-BAG與BAG-BAE菌株在產物達到較高濃度后，仍能繼續反應，最終產物濃度比BAE菌株提高了19.1%。該結果表明協同表達BAE、BAG同樣協同提高了催化丙烯腈合成丙烯酰胺[13]的催化速率和產量。

圖5 全細胞催化合成丙烯酰胺

3 結論

本文協同表達H-Nhase與L-Nhase型腈水合酶，成功構建了兼備這兩種腈水合酶優勢的BAE-BAG菌株。該菌株對底物、產物耐受性較強并具有較高催化反應速率。最終煙酰胺產量可達到516 g/L，是目前報道的最高產量；丙烯酰胺產量比原始BAE或BAG菌株提高19.1%以上，有利于工業化應用。