仙草膠對淀粉-魚糜凝膠特性和體外消化性的影響

游剛，賴玉坪，牛改改*，曾達，郭德軍

1(北部灣大學 食品工程學院，廣西高校北部灣特色海產品資源開發與高值化利用重點實驗室，欽州市特色果蔬發酵重點實驗室，廣西 欽州，535011)2(北部灣大學 石油與化工學院，廣西 欽州，535011)

魚肉經漂洗、斬拌等工藝制成魚糜，魚糜富含肌原纖維蛋白，可用于生產魚丸、魚糕和魚醬等產品。魚糜產品因其營養價值高、味美而備受消費者喜愛。為滿足魚糜產品感官和質構特性多樣化，向魚糜中添加多糖(淀粉、魔芋膠、卡拉膠等)、蛋白質(大豆蛋白、明膠)和酚類化合物(茶多酚)以改善魚糜凝膠特性[1]，利用多糖-蛋白質、蛋白質-蛋白質和多酚-蛋白質相互作用促進凝膠網絡結構形成[1]。近年來，人們充分認識到膳食和健康的緊密關聯性，在追求食品帶來的感官享受同時，更加注重健康膳食和營養功能性。研究者向魚糜中添加功能性物質(燕麥麩皮[2]、菊粉[3]、β-葡聚糖[4]等)以改善魚糜凝膠特性，同時增加其營養功能性，以滿足魚糜凝膠產品營養多樣化需求。此外，魚糜產品加工常采用兩段式加熱法，熱誘導蛋白質變性聚集增強表面疏水性，蛋白質結構發生變化，導致蛋白質消化率降低[5]，因此蛋白質消化率對評價添加功能性物質的凝膠產品質量具有重要意義。

仙草膠(hsian-tsao gum，HG)主要成分是一種從藥食兩用草本植物(仙草，又稱涼粉草)中提取的陰離子雜多糖，分子呈桿狀構象和剛性結構[6]，不同于其他商用膠(果膠、黃原膠等)。HG具有良好的生物活性(抗氧化性、降血脂、保肝等活性)[6]和促凝膠性[7]，能夠與淀粉產生協同增效作用[8]，可用于制作的龜苓膏等凝膠產品，產生了巨大經濟效益。然而HG在蛋白質凝膠產品中的應用研究較缺乏。近年來，HG與蛋白質相互作用研究引發關注。研究發現HG能夠改善畜禽肉蛋白凝膠質構特性，例如增大凝膠彈性、咀嚼性和硬度等，提高持水性[7, 9]。淀粉是魚糜制品常用的添加物，然而關于HG對淀粉-魚糜凝膠特性和體外消化性的影響鮮有報道。因此，本實驗以淀粉-魚糜為研究對象，探討添加HG對淀粉-魚糜復合凝膠感官特性、凝膠特性(凝膠強度、質構特性、凝膠形成作用力、微觀結構)和體外消化性的影響，為HG在淀粉-魚糜凝膠產品的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羅非魚(體重約1.5 kg)，廣西欽州市東風市場;仙草膠由實驗室自制;小麥淀粉(食品級)，上海源葉生物科技公司；牛血清蛋白(生化試劑)，上海金穗生物科技有限公司；無水乙醇、氯化鈉、尿素、β-巰基乙醇(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CT3質構儀，美國Brookfield公司；Evolution201紫外分光光度計，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；BX53熒光顯微鏡，日本Olympus公司；KN580全自動凱氏定氮儀，濟南阿爾瓦儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機，上海標本模型廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

參考LIN等[10]報道方法制備仙草膠，并稍作修改。稱取100 g粉碎仙草，加入1 L乙醇(體積分數80%)浸泡，分離沉淀后加入1 L 0.14 mol/L碳酸氫鈉溶液，95 ℃浸提120 min，過濾收集上清液，加入無水乙醇至乙醇體積分數為80%、4 ℃過夜，離心(5 000×g，5 min)收集沉淀，復溶、醇沉、離心(重復1次)，凍干制得涼粉草膠。仙草膠基本成分分析(干基)：多糖(68.21±3.51) g/100g，蛋白質(6.94±0.35) g/100g，脂肪(1.52±0.08) g/100g，灰分(18.36±1.27) g/100g。

參考CHEN等[11]報道方法制備復合魚糜凝膠，并稍作修改。新鮮羅非魚去頭、皮、內臟、骨刺，清洗(肉水質量比1∶5，攪動10 min)后離心脫水(2 500 r/min，15 min)，攪碎(1 800 r/min，2 min)，加鹽(2.5%，質量分數)斬拌(1 800 r/min，3 min)，分別加入仙草膠HG(0.5%、1.0%、2.0%，質量分數)和3.0%(質量分數)淀粉繼續斬拌(2 500 r/min，4 min)，調整水分含量至80%，灌入塑料腸衣(直徑45 mm)、封口。采用二段加熱法(40 ℃，30 min；90 ℃，20 min)制備魚糜凝膠，冰浴、冷卻后于4 ℃貯藏過夜，備用。斬拌操作過程采用冰浴控制樣品溫度不超過10 ℃。所有制備樣品的pH為6.9～7.1。未添加仙草膠組設為對照組(HG-0)，樣品分別為HG-0.5、HG-1、HG-2。

1.3.2 凝膠強度測定

參考文獻[3]，并稍作修改。用不銹鋼圓形刀片將樣品切成圓柱體(直徑為30 mm，高20 mm)，采用質構儀測定。測定條件：壓縮模式，TA18球形探頭，底座TAPA，壓縮距離16 mm，測試速度1.0 mm/s，觸發值5.0 g。

1.3.3 質構特性(texture profile analysis，TPA)測定

參考文獻[11]，并稍作修改。用不銹鋼圓形刀片將樣品切成圓柱體(直徑為30 mm，高20 mm)，采用質構儀測定。測定條件：TPA模式，壓縮距離10 mm，探頭TA11/1000，底座TAPA，測試速度1.0 mm/s，觸發值5.0 g。

1.3.4 凝膠形成作用力測定

參考ZHANG等[12]方法測定。

1.3.5 體外消化性測定

參考文獻[5]，并稍作修改。取1.0 g樣品(干基)加入25 mL去離子水，10 000×g均質1 min，分別進行胃蛋白酶和胃蛋白酶+胰蛋白酶消化實驗。對于胃蛋白酶消化實驗，用1 mol/L HCl將樣品調至pH 2.0(胃蛋白酶最適pH)，根據樣品質量，以1∶100的質量比加入胃蛋白酶(>400個單位/mg的蛋白質)， 37 ℃ 振蕩消化2 h，然后用1 mol/L NaOH將pH調至7.2滅酶(且為胰蛋白酶最適pH), 離心收集沉淀(10 000×g，20 min)。對于胃蛋白酶+胰蛋白酶消化實驗，在完成胃蛋白酶消化實驗的基礎上，根據樣品質量，以1∶50的質量比添加胰蛋白酶(1.645個單位/mg蛋白)，37 ℃下振蕩消化2 h，調pH>9滅酶，離心收集沉淀(10 000×g，20 min)。樣品分解率和樣品中蛋白質消化率計算如公式(1)、公式(2)所示(以干基計算)：

(1)

(2)

式中：Wi，消化后樣品質量，g；Wt，消化前樣品質量，g；W0，消化前樣品中蛋白質的含量(g/g 樣品);W1，消化后樣品中蛋白質含量(g/g 樣品)。

1.3.6 凝膠微觀結構

參考文獻[3]，并稍作修改。樣品切成5 mm×5 mm×5 mm薄片，置于-80 ℃冷凍30 min，然后用組織切片機將其切成10 μm厚，置于載玻片上，用1%溴酚藍溶液(蛋白染料)染色3 min，用蒸餾水沖洗過量的染料，采用BX53顯微鏡觀察魚糜凝膠結構，圖像采用高清數碼相機(DP12)拍攝(10×目鏡、10×物鏡)。

1.3.7 感官評價

參考文獻[4,13]，并稍作修改。依據《GB/T 16291.1—2012感官分析 選拔、培訓與管理評價員一般導則》，組建感官評價小組。評價小組成員是由年齡為20～35歲，食品專業的5名男性和3名女性組成。感官評價前，評價員熟悉樣品特性，并經充分討論后，確定主要評價指標(彈性、硬度、組織狀態、風味、色澤)，按表1進行感官評價。

表1 感官評價標準

1.4 數據處理

采用SPSS 19.0軟件對3次重復實驗數據進行統計分析，顯著性水平設為P<0.05，采用Origin 2021進行主成分分析和Pearson相關性分析，并作圖。采用Image J軟件處理微觀結構圖并計算孔隙率。

2 結果與分析

2.1 HG對淀粉-魚糜凝膠感官特性的影響

添加HG對淀粉-魚糜凝膠感官特性的影響如圖1所示。與對照組(HG-0)相比，添加HG可增大淀粉-魚糜的感官彈性和硬度，其中HG-0.5組魚糜感官硬度增加12.91%，HG-2組魚糜感官硬度增大42.12%，其與質構特性中的彈性和硬度變化一致(表2)。添加HG影響淀粉-魚糜組織狀態，與HG、淀粉和魚糜蛋白質之間相互作用引起的凝膠微觀結構變化有關。另外，添加HG減弱淀粉-魚糜凝膠魚腥味歸因于多糖影響蛋白質與風味成分相互作用，進而影響風味物質的吸附和釋放[14]。添加HG降低了魚糜凝膠白度，但HG可改善魚糜凝膠質地和風味，且HG具有良好的生物活性，例如抗氧化性、保肝和降血脂等活性[6]，在改善魚糜質地和功能性方面具有較好的應用前景。

圖1 添加HG對淀粉-魚糜凝膠感官特性的影響

2.2 HG對淀粉-魚糜凝膠強度的影響

凝膠強度定義為破斷力與凹陷深度(形變)的乘積，可作為魚糜產品質量分級依據。添加HG對魚糜凝膠破斷力、凹陷深度和凝膠強度的影響如圖2所示。隨著HG添加量增加，魚糜凝膠強度、破斷力和凹陷深度均呈現先增加后減小的趨勢，且在HG添加量0.5%時均達最大值。破斷力反映魚糜凝膠強度和抵抗凝膠破裂的能力，形變與凝膠彈性呈現一定的正相關性[15]，其形變值變化與表2凝膠彈性變化趨勢一致。與對照組相比，添加HG可增強淀粉-魚糜凝膠破斷力、形變和凝膠強度，與HG的親水性、溶脹性和分散性以及蛋白質-多糖互作有關。HG是一種含糖醛酸結構的陰離子多糖，富含親水性基團，例如—OH、—COOH等，其與魚糜蛋白質競爭性結合水分，有效提高魚糜蛋白質濃度，進而增大凝膠強度，同時HG吸水溶脹對魚糜基質產生局部壓力，促使形成緊湊、穩固的凝膠網絡結構[4]；HG可作為一種有效填充物，均勻分散到魚糜凝膠基質中，并與淀粉產生協同作用[8]，有效增強凝膠網絡結構；另外，HG可與魚糜蛋白質發生相互作用，例如靜電作用、疏水相互作用等，改變蛋白質結構，增強魚糜凝膠強度[16]。然而，繼續增加HG降低了魚糜凝膠強度和破斷力，表明過量HG阻礙魚糜蛋白質交聯，擾亂魚糜凝膠網絡結構形成[13]。研究發現添加酵母β-葡聚糖[4]、可德膠和明膠[11]對魚糜凝膠破斷力和形變值的影響均呈現先增加后減小的趨勢，支持本研究結果。結果表明HG在改善淀粉-魚糜凝膠強度方面具有較好效果。

圖2 添加HG對淀粉-魚糜凝膠破斷力、陷深度和凝膠強度的影響

2.3 HG對淀粉-魚糜凝膠質構特性的影響

添加HG對魚糜凝膠質構特性的影響如表2所示。與對照組相比，添加HG可改變魚糜凝膠質構特性，其中硬度、黏性、膠著性和咀嚼性呈現先增加后減小的趨勢，而彈性呈現逐漸增加的趨勢。添加0.5%HG時魚糜凝膠硬度、膠著性和咀嚼性均最大，分別較對照組增加11.35%、10.08%和10.74%；添加2.0%(質量分數)HG時凝膠彈性和黏性均最大，分別較對照組增加2.63%和100%。另外，前期試驗發現添加HG對不含淀粉的魚糜凝膠彈性影響無明顯差異(P>0.05)，而添加HG顯著增加魚糜凝膠彈性(P<0.05)，與HG-淀粉-蛋白質3種物質相互作用有關：(1)HG-淀粉相互作用可產生協同效應[8]，例如增大淀粉黏彈性；(2)HG-蛋白質[7]、淀粉-蛋白質[17]均發生相互作用。多糖-蛋白質相互作用改變蛋白質結構，增強凝膠網絡結構形成作用力(疏水相互作用和二硫鍵)(圖3)，改善魚糜凝膠質構特性；而結冷膠[16]和綠藻硫酸基多糖[13]對魚糜凝膠彈性無明顯影響，結果差異歸因于不同結構的多糖-蛋白質相互作用。結果表明HG可改善淀粉-魚糜凝膠質構特性，具有一定的應用價值。

表2 添加HG對淀粉-魚糜凝膠質構特性的影響

2.4 HG對淀粉-魚糜凝膠形成作用力的影響

圖3顯示添加HG對淀粉-魚糜凝膠可溶性蛋白質濃度的影響，間接反映凝膠形成過程中分子間作用力變化[12]。以未添加HG和淀粉的純魚糜凝膠為對照，只添加3%淀粉顯著增大了凝膠形成二硫鍵和疏水作用(P< 0.05)，表明淀粉和魚糜蛋白質發生相互作用。親水性淀粉競爭性減弱蛋白質-水互作，蛋白質疏水性環境增強，蛋白質分子間疏水相互作用增大[18]；另外，蛋白質結構改變暴露更多的活性基團，促進了分子間交聯形成二硫鍵[18]。在此基礎上添加HG，凝膠形成二硫鍵呈現先增加后降低趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；添加0.5%HG時，凝膠強度、形變和破斷力均最大(圖1)，此時二硫鍵作用力最大，且疏水作用較HG-0組差異不顯著(P>0.05)，表明二硫鍵和疏水相互作用是HG-淀粉-魚糜凝膠的主要作用力。魚糜凝膠化過程中，蛋白質分子伸展并形成凝膠網絡結構，包絡HG、淀粉和水等，且HG和淀粉均吸水溶脹并產生協同增稠效應，壓迫蛋白凝膠基質，形成穩固凝膠網絡結構[19]；然而，過量的HG與淀粉和蛋白質相互作用阻礙蛋白質分子鏈伸展、聚積和交聯[19]，減弱二硫鍵和疏水作用，進而降低凝膠強度，與圖1顯示結果一致。此外，隨著HG和淀粉的加入，魚糜凝膠形成氫鍵作用力呈現先降低后升高的趨勢，歸因于HG和淀粉與魚糜蛋白質競爭性結合水分，減弱了蛋白質-水相互作用[20]，因此氫鍵作用力減弱，與YUAN等[20]發現脫乙酰魔芋葡甘聚糖減弱魚糜凝膠氫鍵作用一致；當添加2%HG 時，HG和淀粉減弱了蛋白質分子間疏水相互作用，蛋白質分子與水分子作用加強，因此氫鍵作用力增強。隨著HG和淀粉的加入，離子鍵作用力較對照組均降低，表明魚糜凝膠化過程中蛋白質結構出現破壞[18]，受加熱溫度和添加物(HG、淀粉)等因素影響。因此，添加HG可顯著增加淀粉-魚糜凝膠形成作用力(疏水相互作用和二硫鍵)，增強凝膠網絡結構，改善凝膠質構特性。

圖3 添加HG對淀粉-魚糜凝膠形成作用力的影響

2.5 HG對淀粉-魚糜凝膠體外消化性的影響

采用體外消化模型，探究添加HG對淀粉-魚糜凝膠樣品分解率和蛋白質消化率的影響，結果如圖4所示。隨著HG添加量增加，樣品分別經胃蛋白酶、胃蛋白酶+胰蛋白酶消化后，樣品分解率均呈現先減小后增加的變化趨勢，但均顯著小于對照組(P<0.05)，且均在添加0.5%HG時樣品分解率最低。進一步分析樣品的蛋白質含量變化，與對照組相比，添加HG顯著降低了樣品蛋白質消化率(P<0.05)，且隨著HG添加的增加，樣品蛋白質消化率呈現現增加后減小的趨勢。另外，經胃蛋白酶+胰蛋白酶消化后的樣品分解率和蛋白質消化率均高于胃蛋白酶組。由于添加HG影響復合魚糜凝膠強度和質構特性，改變凝膠形成作用力和微觀結構，進而影響復合魚糜凝膠的體外分解率和蛋白質消化率。添加0.5%HG時樣品體外分解率和蛋白質消化率最低，可能與樣品硬度較大有關；SEMEDO等[21]證實了蛋白質消化性與硬度呈現顯著負相關性，支持本研究結果。然而，與HG-0組相比，添加HG均降低淀粉-魚糜凝膠樣品分解率和蛋白質消化率，這可能與HG對消化酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)有一定的抑制作用有關。已有研究報道HG對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性產生非競爭性抑制作用[22]，然而，HG-消化酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)相互作用研究鮮有報道，后續實驗將進一步探討HG結構特性、消化酶活性和樣品消化性之間的關系。此外，添加仙草膠后蛋白質的體外分解率和蛋白質消化率下降，對于魚糜制品有何益害？研究報道餐后蛋白質的增加取決于攝入蛋白質的消化率，快消化蛋白質(如乳清蛋白)會導致機體不能最佳化利用其分解的氨基酸，而自然慢消化蛋白質(如酪蛋白)不能平衡供給氨基酸[23-24]。BALLEVRE等[23]發明了一種利用陰離子多糖(黃原膠、阿拉伯膠、瓜爾膠等)減慢蛋白質消化速率的方法，旨在將快消化蛋白質轉變為慢消化蛋白質，以增加餐后蛋白質的攝入和利用，同時慢消化蛋白質產生的飽腹效應可減少食物攝入量。因此，仙草膠減緩了魚肉蛋白質消化速率，可增加餐后飽腹感，有利于機體充分吸收利用其分解的氨基酸，對于魚糜制品有一定益處。

a-樣品分解率；b-蛋白質體外消化率

2.6 HG對淀粉-魚糜凝膠微觀結構的影響

添加HG對淀粉-魚糜凝膠微觀結構的影響如圖5所示。圖5-a～圖5-d藍色部分為魚糜蛋白質結構，圖5-e～圖5-h中的白色部分分別為圖5-a～圖5-d對應的孔隙。添加HG可明顯促進聚集結構物質形成，同時凝膠中的孔隙數量(圖5-e～圖5-h中白色部分)較對照組明顯增加，孔隙率大小為：HG-2(19.41%)>HG-0.5(10.36%)>HG-1(9.07%)>HG-0(6.43%)，表明HG、淀粉、魚糜蛋白和水分子間發生相互作用。由于HG和淀粉的強親水作用，減弱了蛋白質-水相互作用，增大了蛋白質疏水相互作用力，同時，由于相鄰蛋白質表面聚集產生排空作用[25]，進而促進蛋白質聚集，形成凝膠網絡結構。ZHANG等[4]發現β-葡聚糖可增加魚糜凝膠微觀結構孔洞數量和尺寸，支持本研究結果。HG-0和HG-1較HG-0.5和HG-2具有較高的蛋白質體外消化率，與蛋白質形成聚集結構的程度具有一定的關聯性；HG-0.5和HG-2微觀結構圖顯示有較多的孔隙，表明HG可促進淀粉-魚糜蛋白形成更多聚集物，這些聚集物中的蛋白質較難被蛋白酶消化；同時較多聚集物的形成也解釋了HG-0.5硬度和HG-2彈性較大的原因。另外HG-0.5具有較大凝膠強度與其形成均一的凝膠網絡結構有關，表明添加0.5%HG能夠與3%淀粉產生較好協同效應，并作為有效填充物均勻分散到魚糜凝膠基質中，有效增強凝膠網絡結構。因此，添加適量HG可促進魚糜凝膠網絡結構形成，改善凝膠質構特性。

a、e-HG-0；b、f-HG-0.5；c、g-HG-1；d、h-HG-2

2.7 魚糜凝膠特性、感官特性與體外消化性相關性分析

經主成分分析，PC1和PC2的總貢獻率超過80%，表明主成分分析能較好反映原始高維矩陣數據信息。樣品出現在3個不同區域，可分為3組(HG-0；HG-0.5；HG-1和HG-2)，表明添加HG顯著影響復合魚糜凝膠特性。凝膠感官彈性與凝膠質構特性(硬度、膠著性和咀嚼性)和疏水相互作用存在正相關性，與質構特性(黏性、彈性)、凝膠強度和二硫鍵存在負相關性；而凝膠感官硬度與感官彈性存在負相關性。疏水相互作用與凝膠質構特性(硬度、膠著性和咀嚼性)呈現正相關性，二硫鍵與凝膠質構特性(黏性、彈性)和凝膠強度呈現正相關性。綜合分析復合魚糜凝膠強度、質構特性(硬度、彈性、黏性、膠著性和咀嚼性)、凝膠形成主要作用力(疏水作用、二硫鍵)、感官特性(硬度-SC、彈性-SC)與凝膠樣品分解率和蛋白質消化率之間的關系，結果表明蛋白質消化率與疏水相互作用之間呈現正相關性，與樣品硬度、膠著性、咀嚼性、黏性、彈性和凝膠強度呈現負相關性，而蛋白質體外消化率與二硫鍵呈現負相關性，這與FANG等[26]研究奶酪消化性與硬度、咀嚼性、黏性呈現負相關性結果一致。

圖6 魚糜復合凝膠特性和消化性之間的主成分分析雙標圖

3 結論

研究HG對淀粉-魚糜復合凝膠感官特性、凝膠特性(凝膠強度、質構特性、凝膠形成作用力、微觀結構)和體外消化性的影響，并進行相關性分析。添加HG可改善魚糜凝膠質地和風味，增加淀粉-魚糜凝膠破斷力、形變和凝膠強度，且添加0.5%HG時達最大值。添加HG可促進蛋白質聚集，增加淀粉-魚糜凝膠形成作用力(疏水相互作用和二硫鍵)，增強凝膠網絡結構，改善淀粉-魚糜凝膠質構特性，表現為凝膠硬度、彈性、黏性、膠著性和咀嚼性均增大，添加0.5%(質量分數)HG時淀粉-魚糜凝膠硬度、膠著性和咀嚼性均最大。添加HG降低了淀粉-魚糜凝膠體外分解率和蛋白質消化率，與凝膠結構特性有關。經主成分分析發現，疏水相互作用與樣品硬度、膠著性和咀嚼性呈現正相關性，二硫鍵與樣品彈性、黏性和凝膠強度呈現正相關性；樣品分解率和蛋白質消化率與疏水相互作用之間呈現正相關性，與樣品硬度、膠著性、咀嚼性、黏性、彈性和凝膠強度呈現負相關性。因此，HG可改善淀粉-魚糜凝膠感官特性和凝膠結構特性，具有潛在的應用價值。后續實驗將進一步從HG結構特性和HG-消化酶相互作用兩個角度探討HG對魚糜凝膠結構特性和消化性的影響機制，為HG在淀粉-魚糜凝膠中的應用提供參考。