糯米酒源貝萊斯芽孢桿菌的體外安全性評價

黃芷珊，任紅,2,3,4,5，黃煒健，劉少韻，謝卓珊，鐘先鋒,2,3,4,5，黃桂東,2,3,4,5*

1(佛山科學技術學院 食品科學與工程學院，廣東 佛山，528231)2(廣東省傳統發酵食品工程技術研究中心，廣東 佛山，528231)3(廣東省食品流通安全控制工程技術研究中心，廣東 佛山，528231)4(佛山市釀造工程技術研究中心，廣東 佛山，528231)5(佛山市農業生物制造工程技術研究中心, 廣東 佛山，528231)

糯米酒是我國傳統發酵酒之一，其釀造過程多采用開放式發酵，故釀造過程形成了復雜的微生物環境，擁有豐富的微生物資源[1]，從中篩選出對酒風味物質形成和成品酒品質起作用的性能良好菌株已成為釀酒行業重要研究方向之一。

貝萊斯芽孢桿菌是芽孢桿菌屬中的新種，廣泛存在于土壤、水體、空氣等自然環境中[2]。國內外科學家也相繼從白酒[3]、豆豉[4]等發酵食品中分離篩選出貝萊斯芽孢桿菌。研究表明：貝萊斯芽孢桿菌具有生長繁殖速率快、抗逆性強、產酶能力強等特點，可作為發酵劑等應用于食品生產中[5]，具有廣闊應用前景。但是芽孢桿菌在其應用過程中的安全風險仍未明確。劉純等[6]以商用益生芽孢桿菌為基礎，對其安全性展開研究，結果顯示被檢測菌株都攜帶有一種或多種腸毒素基因。歐洲某飼料添加劑中的蠟狀芽孢桿菌因攜帶含tetB基因的質粒，存在潛在的安全風險而被停止使用[7]。由此可見，貝萊斯芽孢桿菌生物安全性評價仍是值得深入探討的科學問題，對其后續進一步深入研究與資源開發尤為必要。

本實驗室前期從糯米酒中分離得到抗逆性強且產蛋白酶特性優良的貝萊斯芽孢桿菌共4株，但尚不了解其生物安全性，為充分開發其使用價值，本文從耐藥性檢測、耐藥質粒檢測、溶血實驗、毒力基因PCR檢測4個方面開展體外安全性評價，以期為糯米酒中貝萊斯芽孢桿菌菌株資源的挖掘與利用奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗菌株：貝萊斯芽孢桿菌B1、B2、B7、B8，均為本實驗室前期從糯米酒中分離得到。參照美國臨床實驗室標準化委員會標準，實驗對照用標準菌株：金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923)，南京茂捷微生物科技有限公司。

細菌基因組DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；Plasmid Minikit試劑盒，美國OMEGA Bio-tek公司；哥倫比亞血平板，廣東環凱微生物科技有限公司；藥敏紙片(四環素、慶大霉素、卡那霉素、萬古霉素、紅霉素、氯霉素、鏈霉素)，杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ALLEGRA-64R臺式高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；SY-1220恒溫水浴鍋，美國精騏有限公司；EPOCH-2 721BR超微量酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；FlexCycler2 PCR儀，德國耶拿分析儀器股份公司；DYY-7C凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司；721BR 16103凝膠成像系統，美國 Bio-Rad 公司；GR60DA全自動滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；ME104電子分析天平，梅特勒—托利多精密儀器公司；LRH-150恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；428830數顯式游標卡尺，寧波長城精工實業有限公司。

1.3 材料與試劑

1.3.1 貝萊斯芽孢桿菌菌液的制備

將4株貝萊斯芽孢桿菌接種于LB液體培養基中，37 ℃、160 r/min下活化2代后待用。

1.3.2 耐藥性檢測

根據文獻方法[8]，適當修改如下：采用藥敏紙片擴散法對本研究實驗菌株進行藥敏分析。實驗使用的藥敏紙片種類為慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環素、紅霉素、氯霉素、萬古霉素共7種。參照美國臨床實驗室標準化委員會標準[9]，通過測量各藥敏試紙產生的抑菌圈直徑大小判斷菌株對不同抗生素的敏感性，如表1所示。

表1 耐藥性檢測實驗判斷標準

1.3.3 耐藥質粒檢測

根據文獻方法[6]，適當修改如下：使用Plasmid Minikit試劑盒對上述藥敏實驗分析結果中呈耐藥結果的菌株進行質粒提取。以不含質粒的大腸桿菌DH5α為陰性對照，以含質粒的大腸桿菌PET-28a為陽性對照，使用0.8%(質量濃度)的瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒存在情況。

1.3.4 溶血實驗

根據文獻方法[10]，取本研究實驗菌株于血瓊脂培養基上接種，37 ℃培養14～18 h，觀察是否產生溶血環。若菌落四周出現草綠色環，則為α-溶血；若菌落四周出現透明溶血環，則為β-溶血；若菌落四周無任何變化，則為γ-溶血，即不溶血。

1.3.5 毒力基因PCR檢測

根據文獻方法[6]，采用PCR擴增技術對本研究實驗菌株進行芽孢桿菌常見毒力基因檢測，檢測的毒力基因包括與腸毒素相關的溶血性腸毒素Hbl(hblA、hblC、hblD)、非溶血性腸毒素Nhe(nheA、nheB、nheC)、腸毒素T(bceT)、細胞毒素K(cytK)基因以及與嘔吐毒素相關的ces和cer基因。通過檢測實驗菌株中所含毒力基因的情況，對菌株的安全性進行評價。

1.4 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 耐藥性檢測結果與分析

為評估實驗室篩選所得的貝萊斯芽孢桿菌的安全性，本文使用了慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環素、紅霉素、氯霉素以及萬古霉素等7種抗生素進行測定。由表2可知,對照菌株金黃色葡萄球菌對7種抗生素均敏感；4株貝萊斯芽孢桿菌對慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、萬古霉素敏感；菌株B1、B7、B8對四環素中度敏感，菌株B2對四環素耐藥。這與高艷俠[11]和AMOAH等[12]對貝萊斯芽孢桿菌進行耐藥性檢測實驗結果基本一致，前者研究表明貝萊斯芽孢桿菌LF01對慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、萬古霉素和四環素皆敏感；后者對貝萊斯芽孢桿菌GPSAK4進行耐藥性檢測，表明GPSAK4對慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素、萬古霉素、四環素敏感。這可能是由于氨基糖苷類抗生素慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素可與細菌核糖體的30S亞基形成不可逆結合[13]，大環內酯類抗生素紅霉素和氯霉素類氯霉素可透過細胞膜與細菌核糖體的50S亞基形成可逆結合[14]，來抑制細菌蛋白質合成；糖肽類抗生素萬古霉素可通過作用于細胞壁上的D-丙氨酰-D-丙氨酸、阻礙多肽的形成，來干擾細菌細胞壁的合成[15]，從而對細菌起到抑制作用。

表2 藥敏實驗判斷結果 單位：mm

4株貝萊斯芽孢桿菌對同一種抗生素敏感程度有所差異。如圖1-a所示，4株貝萊斯芽孢桿菌對慶大霉素、卡那霉素、四環素、紅霉素、氯霉素的耐藥性均呈顯著差異(P<0.05)，對鏈霉素、萬古霉素的耐藥性則無顯著差異(P>0.05)。慶大霉素對B8的抑制效果最強，對B7的抑制效果次之，對B1、B2的抑制效果最弱，且慶大霉素對金黃色葡萄球菌的抑制效果與B1、B2、B7、B8呈顯著性差異(P<0.05)；卡那霉素對B7、B8的抑制效果最強，對B1、B2的抑制效果最弱，且卡那霉素對金黃色葡萄球菌的抑制效果與4株菌皆呈顯著性差異(P<0.05)；四環素對B1的抑制效果最強，對B2的抑制效果最弱；四環素對金黃色葡萄球菌的抑制效果與4株菌株皆呈顯著性差異(P<0.05)；紅霉素對B2的抑制效果最強，對B7的抑制效果次之，對B8、B1的抑制效果最弱，紅霉素對金黃色葡萄球菌的抑制效果與4株菌株皆呈顯著性差異(P<0.05)；氯霉素對B8的抑制效果最強，對B7、B1的抑制效果次之，對B2的抑制效果最弱，且氯霉素對對金黃色葡萄球菌的抑制效果與4株菌株皆呈顯著性差異(P<0.05)。

7種抗生素對同一菌株的抑制效果亦有所不同。如圖1-b所示，氯霉素對4株菌的抑制效果最強，四環素對4株菌的抑制效果最弱。此外，紅霉素與氯霉素對B2、慶大霉素與氯霉素對B8的抑制效果無顯著差異(P>0.05)，說明紅霉素對B2、慶大霉素對B8的抑制效果也是最強的。

a-不同菌株同一抗生素的耐藥性分析；b-不同抗生素同一菌株的耐藥性分析

隨著抗生素的廣泛使用，細菌抗生素耐藥性問題逐漸成為社會關注的熱點，減少耐藥菌株的傳播成為維護公共衛生安全的關鍵之一。2013年，歐洲食品安全局安全資格認證列表中提出，將抗生素耐藥性測定列為微生物菌種通用安全評估項目[16]，因此對菌株進行耐藥性測定尤為重要。

2.2 耐藥質粒檢測結果與分析

圖2為對上述存在耐藥性的菌株的質粒提取電泳圖，B2所在的泳道(泳道1)和陰性對照泳道(泳道2)上并未出現條帶，而陽性對照所在的泳道上(泳道3)上出現了熒光條帶，表明B2中無攜帶耐藥基因的質粒存在，不具備通過質粒轉移耐藥性的可能性，故可初步判斷B2在耐藥性轉移方面為安全菌株。

1-B2；2-陰性對照；3-陽性對照；M-15 000 DNA marker

細菌耐藥性存在轉移風險，在自然條件下，耐藥基因可通過質粒在不同種屬間發生水平轉移[17]。已有研究表明，當含有耐藥基因菌株作用于腸道時，耐藥基因不僅可以在腸道菌群間進行交換，還可以轉移到短暫通過腸道的細菌中，當腸道中的條件致病菌獲得耐藥性時，將會對宿主健康造成一定危害[18]。

目前關于芽孢桿菌通過質粒等移動元件將耐藥基因傳遞至其他菌株的現象已有報道。AGERS?等[19]發現蠟狀芽孢桿菌中的四環素耐藥基因可通過移動元件轉移至枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和腸球菌中。盧俊杰[20]的實驗結果也表明耐藥枯草芽孢桿菌質粒中的四環素類耐藥基因tet(K)可通過接合的方式轉移至大腸桿菌中。因此，為避免篩選所得的貝萊斯芽孢桿菌抗生素耐藥性向其他菌株、動物甚至人類轉移的風險，對具有耐藥性的菌株進行耐藥質粒檢測實驗尤為重要。

2.3 溶血實驗結果

溶血素是一類作用于細胞膜，能使細胞膜結構和功能發生紊亂、細胞內容物外泄、細胞死亡的蛋白毒素[21]。研究表明，溶血素除了對血細胞有溶解作用外，還能對有核細胞和血小板造成損傷和致死[22]，因此，菌株是否產生溶血素是檢驗菌株安全性的一個重要環節，對菌株的開發與利用至關重要。圖3為實驗室篩選所得的4株貝萊斯芽孢桿菌溶血實驗結果，由圖可知，4株菌株菌落周圍無產生透明溶血環及草綠色環情況，這與BORAH等[23]的結果一致，因此可判斷菌株為γ-溶血，菌株B1、B2、B7、B8為安全菌株。

a-貝萊斯芽孢桿菌B1；b-貝萊斯芽孢桿菌B2；c-貝萊斯芽孢桿菌B7；d-貝萊斯芽孢桿菌B8

2.4 毒力基因PCR檢測結果

芽孢桿菌中是否攜帶毒力基因是判斷菌株是否安全的一個重要方面。圖4與表3為4株芽孢桿菌進行毒力基因PCR的檢測結果。

1～10-毒力基因hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、bceT、cytK、ces、cer；M-2 000 DNA marker

表3 貝萊斯芽孢桿菌B1、B2、B7、B8毒力基因PCR檢測結果

結果顯示，除菌株B2外，B1、B7、B8均檢測出一種或兩種毒力基因。在產溶血性腸毒素基因檢測方面，除菌株B2、B7外，菌株B1、B8皆檢測出攜帶有溶血性腸毒素hblA(1 154 bp)基因，4株菌株皆不攜帶溶血性腸毒素hblC(740 bp)和hblD(829 bp)基因；在非溶血性腸毒素基因檢測方面，除菌株B2外，菌株B1、B7、B8皆攜帶有非溶血性腸毒素nheC(683 bp)基因，4株菌株皆不攜帶非溶血性腸毒素nheA(755 bp)、nheB(743 bp)基因。在其他產腸毒素基因檢測方面，4株菌株皆不攜帶有腸毒素TbceT(924 bp)基因，不攜帶有產細胞毒素KcytK(809 bp)基因；在產嘔吐毒素基因檢測方面，4株菌株皆不攜帶有產嘔吐毒素ces(699 bp)以及cer(370 bp)基因。貝萊斯芽孢桿菌的安全性與其攜帶的毒力基因直接相關，溶血性腸毒素和非溶血性腸毒素均為復合型毒素，溶血性腸毒素分別由hblA、hblB、hblC、hblD4個毒力基因編碼，非溶血性腸毒素由nheA、nheB、nheC3個毒力基因編碼，當所有組分共同參與時，毒性達到最大[24]。研究表明，溶血性腸毒素需要hblA、hblC、hblD共同表達時才能產生溶血素[6]，單獨或成對的非溶血性腸毒素Nhe成分無法對蛋白起到抑制作用[25]，故可判斷本實驗中4株菌株為安全菌株。

3 結論

本研究對分離自糯米酒中的4株抗逆性強且產蛋白酶特性優良的貝萊斯芽孢桿菌進行了體外安全性研究。在耐藥性檢測中，抗生素慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、萬古霉素對菌株有較強的抑制作用，4株菌均對上述抗生素敏感；四環素對菌株的抑制效果較弱，菌株B1、B7、B8對四環素表現為中度敏感，菌株B2對四環素表現為耐藥。對耐藥性檢測中具有四環素耐藥性的菌株B2進行耐藥質粒檢測，結果顯示，菌株B2中不存在耐藥基因的質粒，不具備耐藥性通過質粒轉移的可能。在溶血實驗中，4株菌株在血瓊脂培養基上正常生長且菌落四周不產生透明溶血環及草綠色環，可判斷菌株不是溶血性菌株。在毒力基因PCR檢測中，部分菌株攜帶一種或兩種復合型毒素毒力基因，但由于復合型毒素需所有組分共同參與才能產生毒性作用，可判斷菌株不具備產生相關毒素的可能，故4株菌株不具備產生腸毒素和嘔吐毒素的可能性，表現出了良好的安全性，可用于后續進一步的深入研究，為后續貝萊斯芽孢桿菌菌株資源的開發與利用奠定科學基礎。在后續的實驗中將進一步通過動物實驗對其安全性進行評價，以期為貝萊斯芽孢桿菌作為發酵劑用于發酵食品生產中的應用安全性提供科學理論依據。