多功能性玉米麩質阿拉伯木聚糖芥子酸酯的制備及性能

李顏利,王麗聰

1(四川輕化工大學 化學工程學院, 四川 自貢，643000)2(江陰職業技術學院 環材系，江蘇 江陰，214405)

玉米加工過程中最主要的副產物就是玉米麩質，約占玉米產量的14%～20%，其中含有大量的纖維素、淀粉、半纖維素、多糖、酚酸等物質，阿拉伯木聚糖(arabinoxylan, AX)在玉米麩質中含量較大[1-2]。AX由主鏈木聚糖、側鏈阿拉伯呋喃糖連接而成，還有一定量的羥基肉桂酸(hydroxycinnamic acid, HA)，如阿魏酸(ferulic acid, FA)或對香豆酸(p-coumaric acid,p-CA)通過酯鍵連接在阿拉伯呋喃糖的C(O)-5位上[3-4]。AX的提取方法很多，由于AX的結構特點，易與其他細胞壁物質間存在物理交聯或化學結合[5]。AX與玉米麩質中的纖維素和木素以氫鍵和酯鍵連接，非常緊密，很難溶出，堿液可以破壞細胞壁間與AX的交聯和結合，使AX游離出來的同時不降低相對分子質量[6-8]。因此，通常采用堿液提取AX。雖然堿提取AX的提取率較高，但是同時會降低FA和p-CA含量。FA和p-CA在AX中含量雖少，但卻是AX的重要組成部分，它們的存在極大地影響了AX的性能，不僅改變AX本身的物化性能，包括黏度、溶解性、氧化凝膠性等，還使AX具有一定的生物活性[9-10]。

HA屬于酚酸類，除了FA、p-CA之外，主要還包括芥子酸(sinapic acid, SA)、咖啡酸(caffeic acid, CA)等。芥子酸廣泛存在于各種植物中[11]。近年來，國內外對SA的研究越來越多，研究發現芥子酸及其衍生物具有多種生物活性，可應用于化妝品、食品、保健品、制藥等多個領域[12]。

有研究報道，芥子酸衍生物的結構和生物活性都比游離的SA高[13-14]，因此芥子酸衍生物的應用前景更為廣闊，開發芥子酸衍生物更具有實際意義。本文用SA對玉米麩質中提取的阿拉伯木聚糖(corn arabinoxylan, CAX)進行化學改性，得到芥子酸衍生物玉米麩質阿拉伯木聚糖芥子酸酯(SA-CAX)，從而提高CAX的酚酸含量進而改變CAX的物理化學性質和生物活性等。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據文獻[15]中的方法從玉米麩質中提取并分級出阿拉伯木聚糖(CAX)；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，trolox)、D2O (AR)，北京百靈威科技有限公司；2,2′-偶氮雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(2,2′-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochloride，AAPH) (分析純)，美國Sigma公司；SA、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、NaOH、乙醇、LiCl、吡啶、SOCl2、四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)等 (AR),上海易恩化學技術有限公司；熒光素鈉鹽(AR)，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

OMNISEC凝膠滲透色譜儀，英國馬爾文儀器有限公司；Frontier Near/Mid-IR Std傅里葉紅外、Varioskan LUX多功能酶標儀、Haake MARS iQ流變儀，美國賽默飛世爾科技公司；LC 1100高效液相色譜，美國安捷倫公司；Bruker DRX 400核磁共振，德國布魯克公司；UV5紫外可見分光光度計，瑞士梅特勒托利多。

1.3 實驗方法

1.3.1 SA-CAX的制備

用50 mL絕干THF溶解0.5 g (2.2 mmol)芥子酸，加入到三口燒瓶中，Ar保護，用10 mL絕干THF稀釋0.32 mL(4.4 mmol) SOCl2，加入到恒壓滴液漏斗中，0～5 ℃下，30 min內逐滴滴加SOCl2，70 ℃反應6 h，旋蒸除去THF和過量的SOCl2，得到中間體芥子酸酰氯，無需進一步純化，干燥密封保存待用。

取1 g CAX和30 mL含4%(質量分數)LiCl的絕干DMSO溶劑于250 mL三口燒瓶中，N2保護，加熱至80 ℃待CAX溶解后冷卻至室溫，向反應液中加入一定量吡啶(吡啶的用量為芥子酸酰氯摩爾量的1.5倍)，分別將不同量的芥子酸酸酰氯溶解在DMSO中，在冰浴下用恒壓滴液漏斗逐滴滴入反應液，撤除冰浴，緩慢升溫至100 ℃持續反應14 h，反應結束，冷卻至室溫，向反應液中緩慢加入4倍量體積的無水乙醇，大量白色絮狀物析出，室溫下靜置24 h，過濾，固體冷凍干燥得到SA-CAX。

1.3.2 SA-CAX的芥子酸取代度測試

精確稱量1 g SA-CAX，加入25 mL 1 mol/L NaOH溶液和30 mg無水Na2SO3，室溫攪拌2 h，用HCl (1 mol/L)調節溶液pH使pH=3，過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，定容。用高效液相色譜檢測SA的含量，色譜條件參照文獻[15]進行。將不同濃度的芥子酸標準品繪制出標準曲線，然后按照公式(1)計算取代度(n)，SA-CSX用SA-CAX-n表示。

(1)

式中：m為SA的質量，M為SA的分子質量，m′為SA-CAX的質量，MX為木糖的分子質量，MA為阿拉伯糖的分子質量，A/X為指阿拉伯糖和木糖的比值。

1.3.3 分子質量分布測試

將CAX和SA-CAX-n配制成1.0%(質量分數)水溶液，標樣為普魯蘭，測試方法參照文獻[15]。

1.3.4 紅外光譜檢測

測試方法參照文獻[15]進行。

1.3.5 核磁共振

測試方法參照文獻[15]進行。

1.3.6 紫外吸收性能測試

將純化后的CAX和SA-CAX-n配制成1 mg/mL的水溶液，在200～400 nm波長范圍內進行紫外掃描。

1.3.7 水溶液流變性能測定

將CAX和SA-CAX-n分別配制為20 mg/mL的溶液，然后在DHR-2型流變儀上測定其水溶液的流變性能。在25 ℃時，測定0～1 000 s-1的剪切速率范圍內的黏度；0.1～10 Hz頻率范圍內測定儲能模量(G′)和損失模量(G″)。

1.3.8 抗氧化能力指數(oxygen radical antioxidant capacity，ORAC)的測定

測試方法參考文獻[16]，配制75 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.2)，用緩沖溶液分別配制63 nmol/L的熒光素鈉鹽、20 μmol/L的trolox、153 mmol/L的AAPH溶液以及不同質量濃度的CAX和SA-CAX-n(0.25、0.5、1、2 mg/mL)。先向96微孔板中各加入25 μL不同質量濃度的待測液體CAX、SA-CAX-n和空白對照樣緩沖液、對照樣trolox，重復3次；再向各孔加入150 μL熒光素鈉溶液，中速振搖1 min，置于37 ℃孵育15 min；再同時向各孔中加入25 μL AAPH溶液啟動反應。將微孔板放入酶標儀中進行測試，測試條件為：激發波長485 nm，發射波長538 nm，每2 min測定1次各孔的熒光強度，熒光衰減呈基線后停止。

實驗中各孔不同時間點的絕對熒光強度數據與初始時間的熒光強度相比為相對熒光強度f，以相對熒光強度計算熒光衰退曲線下面積(area under curve，AUC)，AUC按公式(2)計算：

AUC=2×(f0+f1+f2+…+fn-1+fn)-f0-fn

(2)

式中：fn為第n個測試點的相對熒光強度。

測試結果用ORAC值表示，可根據公式(3)計算：

(3)

式中：Ctrolox是標準品trolox的濃度,μmol/L；C樣品是樣品的質量濃度，g/L。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 SA-CAX的制備及表征

本文通過對玉米麩質阿拉伯木聚糖進行改性得到SA-CAX，其合成路線如圖1所示。

圖1 SA-CAX的合成路線

多糖的取代度用n表示，不同取代度的SA-CAX可表示為SA-CAX-n。原料CAX中并不含有SA，僅含少量FA。SA用量與CAX的糖苷鍵的摩爾比以及SA-CAX-n的取代度與產率如表1所示。改性后多糖SA-CAX-n的取代度隨SA的用量的增多而增加，合成的產率較高，均在90%以上。多糖支鏈的分子質量、極性和分支程度對多糖的物理和化學性質影響較大，如黏度、水溶性等[1]，SA本身水溶性差，接枝到CAX使CAX的分支程度增大，會降低在水中的溶解度。因此，本文選SA-CAX-0.27、SA-CAX-0.31和SA-CAX-0.36這3個樣品進行性能研究。

表1 SA-CAX-n合成的產率和取代度

2.2 CAX與SA-CAX-n的分子質量分布

CAX的分子質量分布如文獻[17]，改性產物SA-CAX-n的分子質量的分布如圖2所示，CAX與SA-CAX-n的重均分子質量(Mw)、數均分子質量(Mn)如表2所示。顯示CAX與SA-CAX-n的分子質量都只有一個峰，表明改性前后的多糖的分子質量均一性較好。原料CAX分子質量為3.06×105g/mol，分散系數(Mw/Mn)為3.21；改性后SA-CAX-0.27、SA-CAX-0.31和SA-CAX-0.36的分子質量分別為3.37×105、3.59×105和3.85×105g/mol，與此同時分散系數分別為3.52、3.64和3.52。改性后多糖的取代度的增加，SA-CAX-n的分子質量和分散系數均隨之增大，表明改性后分子質量變大，分布也變寬。

圖2 SA-CAX-n的相對分子質量分布

表2 CAX和SA-CAX-n的分子質量分布

2.3 紅外光譜分析

改性產物SA-CAX-0.27、SA-CAX-0.31和SA-CAX-36的紅外圖譜如圖3所示。原料CAX的紅外如文獻[17]，CAX多糖的特征峰在897、1 191、1 045、1 415、1 634、2 854、3 413 cm-1，圖3中不同取代度的SA-CAX-n都保留CAX的特征峰，在1 760 cm-1處均出現1個新的吸收峰，代表SA苯環上的酯鍵上的羰基峰，證明SA和CAX以酯鍵形式連接，SA含量越多吸收峰越明顯。

圖3 SA-CAX-n的紅外圖譜

2.4 核磁譜圖分析

改性產物SA-CAX-0.27、SA-CAX-0.31和SA-CAX-36的核磁氫譜如圖4-A所示，核磁碳譜如圖4-B所示。

A-氫譜圖；B-碳譜圖

綜合分子質量分布、紅外、核磁氫譜和碳譜，證明芥子酸已成功連接到CAX上。

2.5 CAX和SA-CAX-n的紫外吸收

由CAX和SA-CAX-n的紫外吸收光譜(圖5)可知，CAX在紫外下無吸收峰，表明原料CAX純度較高，無核酸(260 nm)、多肽和蛋白質(280 nm)[18]。改性后SA-CAX-n在250～380 nm波段內具有吸收，并且在320 nm左右處紫外吸收最強，表明SA-CAX-n對UVB波段的紫外線有一定的屏蔽作用。SA含有肉桂酸基團，具有π-π*電子躍遷，對光具有反應活性，SA連接在CAX上也可以屏蔽紫外光[19-20]，而且同樣濃度下SA的取代度越高，其紫外吸收作用越強。

圖5 CAX和SA-CAX-n的紫外圖譜

2.6 流變性能

25 ℃時，剪切速率不同對SA-CAX-n和CAX水溶液黏度的影響如圖6所示。CAX是以線性結構的形式存在于水溶液中，CAX在水中旋轉，分子間彼此碰撞，產生摩擦，因此CAX的黏度較大[21]。由圖6可以看出，相同質量濃度(20 mg/mL)和剪切速率下，SA-CAX-n的黏度比CAX的黏度大得多，主鏈結構相同的情況下，支鏈程度越高，SA-CAX-n在水溶液中旋轉時所需要的空間更大，分子間碰撞的幾率更高，因此SA-CAX-n水溶液黏度增加，而且隨著取代度增加，SA-CAX-n的支鏈程度提高，因此其水溶液黏度也隨之增大。SA-CAX-0.36的黏度大幅度提高，甚至形成凝膠(圖7)，圖7是質量濃度為20 mg/mL的SA-CAX-n和CAX水溶液。

圖6 25 ℃時CAX和SA-CAX-n水溶液黏度隨剪切速率的變化

圖7 CAX 和 SA-CAX-n的水溶液照片

圖8是CAX和SA-CAX-n水溶液的儲能模量(G′)和耗能模量(G″)隨頻率的變化曲線，圖9是SA-CAX-0.36溶液在頻率為1 Hz時的G′和損耗角(tanδ=G′/G″)隨濃度的變化曲線。CAX和所有SA-CAX-0.36水溶液的G′和G″均隨頻率的增加而逐漸增加，在所有頻率范圍內，G′>G″，并且tanδ<1；SA-CAX-0.36溶液的G′在1 Hz時隨濃度的增加而增加，tanδ隨濃度的增加而降低，表明SA-CAX-n水溶液具有一定的弱凝膠性質；其凝膠性能隨著取代度的增加而增加，和圖7結果一致，并且SA-CAX-n的黏度和黏彈性結果相互吻合。

圖8 SA-CAX-0.36水溶液的G′和G″隨頻率的變化曲線

圖9 SA-CAX-0.36的儲能模量G′和損耗角tan δ在1 Hz時隨濃度的變化曲線

2.7 ORAC的測定

ORAC測定方法是AAPH產生過氧自由基，過氧自由基會使熒光素鈉的熒光特性消失，加入抗氧化劑，可以阻止或延緩熒光衰減，因此抗氧化性越強，熒光衰退越慢[22]。本實驗以無抗氧化劑存在時的自由基(Blank)作為對照(圖10-A)，14 min時熒光消退至基線，標準抗氧化物質(trolox)的熒光在38 min消失，原料CAX用量在0.25～2 mg/mL熒光在20～25 min消失。加入改性后的多糖SA-CAX-n熒光消失的時間逐漸延長(圖10-B～圖10-D)。相同質量濃度下，取代度增加熒光消退時間延長；取代度相同時，熒光消退時間隨質量濃度增加而延長。多糖的抗氧化性可以用抗氧化能力指數(ORAC值)表示[16]。

A-CAX和對照樣品的熒光衰減曲線；B-SA-CAX-0.27的熒光衰減曲線；C-SA-CAX-0.31的熒光衰減曲線；D-SA-CAX-0.36的熒光衰減曲線

由表3可以看出，SA-CAX-n的ORAC值隨質量濃度的增大和取代度的增大而增大，即抗氧化性增大。SA連接到CAX可以增強CAX的抗氧化能力，取代度越高抗氧化能力越強。SA屬于羥基肉桂酸，酚羥基是供氫體，與自由基結合，氧原子上不成對單電子與苯環上的π電子云作用發生共軛效應，使成電子部分分布到苯環上，自由基能力降低，因此自由基不再引發鏈式反應，因此改性后多糖的抗氧化性主要受SA含量的影響，SA含量越高，改性多糖的抗氧化性越強[23]。

表3 CAX和SA-CAX-n的相對ORAC值

3 結論

本文從玉米麩質中提取出CAX，并與SA進行酯化反應，得到SA-CAX-n，液相分析確定了取代度，綜合了紅外光譜、核磁氫譜和碳譜確定其結構，用高效液相分析確定了改性多糖的取代度，用凝膠滲透色譜測試不同取代度的多糖的分散性和分子質量分布。然后對不同取代度多糖(SA-CAX-0.27、SA-CAX-0.31、SA-CAX-0.36)的性能進行了研究，發現原料CAX無紫外吸收，改性后SA-CAX-n在UVB波段具有紫外吸收，紫外吸收隨著SA取代度的增加而增強；SA-CAX-n水溶液的黏度較CAX有明顯增大，且具有一定的黏彈性，隨取代度增加而增加；SA-CAX-n的抗氧化能力比原料CAX強，并且隨著取代度的增加和質量濃度的增加，其抗氧化力隨之增強。因此SA-CAX在化妝品、食品、保健品等領域具有廣闊的應用前景。