枸杞酒釀酒酵母的選育及其產香性能分析

趙苗苗，趙智慧，董建方，馬艷，陸健*，吳殿輝*

1(工業(yè)微生物技術教育部重點實驗室，生物工程學院(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學)，江蘇 無錫，214122)3(江蘇省生物活性制品加工工程技術研究中心(江南大學)，江蘇 無錫，214122)4(寧夏紅枸杞產業(yè)有限公司研發(fā)中心，寧夏 中衛(wèi)，755000)

果汁自然發(fā)酵成果酒的過程涉及多種微生物的參與，其中釀酒酵母起著核心作用[1]。使用釀酒酵母對果汁進行純種發(fā)酵，可以更好地控制發(fā)酵過程，避免感官偏差、產品質量不均等問題[2-3]。目前，市售枸杞酒以浸泡型枸杞酒為主，即以白酒或黃酒為酒基，通過對枸杞等中藥材浸泡、勾兌等調配而成。但此法得到的枸杞酒口感較差、品質不穩(wěn)定、易沉淀，且枸杞中的生物活性成分提取不完全，保存率低[4]。發(fā)酵型枸杞酒相較于浸泡型枸杞酒能保留枸杞中原有的活性物質，且酒精度低，適應人群廣。目前發(fā)酵枸杞酒所用釀酒酵母為葡萄酒、果酒通用酵母，因缺少專用的釀酒酵母導致發(fā)酵枸杞酒酒體單薄、風味不足、缺乏典型性等問題。因此，選育適合特定水果發(fā)酵的釀酒酵母是釀酒行業(yè)持續(xù)關注并亟需解決的問題[5]。

現代生物育種方法主要有誘變、基因工程及原生質體融合技術等[6]。張惠玲[7]通過原生質體融合方法打破分類界定，實現種間或更遠緣的基因交流，篩選出適合枸杞酒釀造的新菌株，該菌株使枸杞酒中酯含量提高5%，酒精度提高2%vol～3%vol，發(fā)酵物質增加了5%～7%，但風味物質增加不明顯，需要進一步改善酒體典型風味不突出的問題。田甜甜[6]通過常壓室溫等離子體誘變(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)、高通量篩選(high-throughput screening，HTS)以及適應性實驗室進化定向選育了1株耐酸性強、產香性能良好、用于青梅酒發(fā)酵的釀酒酵母ET008-c54。與其他育種方法相比，ARTP誘變技術進行微生物育種具有突變頻率高、操作簡單、成本低、安全、無污染等特點[8]。因此針對枸杞酒香氣不足且典型性不突出等問題，選育適用于枸杞果汁發(fā)酵的釀酒酵母，是提高枸杞酒香氣質量的根本所在。

本文從枸杞汁自然發(fā)酵液中分離篩選可以提高酒體醇厚性和風味物質含量的釀酒酵母。利用ARTP誘變和HTS方法進一步選育產香性能較好的突變株，并通過自釀枸杞酒與2種市售發(fā)酵枸杞酒的理化指標及風味物質的定量分析，解析了選育菌株在釀造枸杞酒產香方面的優(yōu)勢，并通過氣味活性值(odor activity value，OAV)分析確定了影響枸杞酒風味的主要化合物，為枸杞酒工業(yè)化應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和原料

果酒活性干酵母RW、SY和RV171，安琪酵母股份有限公司；活性干酵母DV10，法國萊蒙特葡萄酒酵母公司。

枸杞干果(寧杞5號)、市售發(fā)酵枸杞酒健康快車(酒精度約12%vol，糖度約30 g/L，配料表：枸杞、二氧化硫)和金色傳杞(酒精度約12%vol，糖度約10 g/L，配料表：枸杞、二氧化硫)，寧夏紅枸杞產業(yè)集團。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

1.2.1 試劑

酵母提取物、胰蛋白胨、葡萄糖和氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)，中國國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、濃鹽酸、甲醇、無水乙醇等常規(guī)化學試劑均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司；果膠酶，白銀賽諾生物科技有限公司；乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、β-紫羅蘭酮等標準品，阿拉丁(上海)生物科技有限公司。

1.2.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉1，葡萄糖2，胰蛋白胨2，115 ℃滅菌20 min；配制固體培養(yǎng)基時加入瓊脂粉1.5～2.0。

TTC下層培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸膏10，瓊脂粉20。

TTC上層培養(yǎng)基(g/L)：TTC 0.05，葡萄糖0.5，瓊脂粉20。

1.3 儀器與設備

ARTP-3常壓室溫等離子體誘變儀，思清源生物科技有限公司；GC-MS，賽默飛世爾科技有限公司；LS-B50L自動高壓蒸汽滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；SHP-2500低溫培養(yǎng)箱，上海精密實驗設備有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 枸杞酒釀酒酵母的初步篩選

1.4.1.1 釀酒酵母的分離

取5 g寧杞5號枸杞干果于30 mL無菌水中，室溫下靜置培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)液搖勻后進行梯度稀釋，并涂布于YPD固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h，待菌落長出后，挑取單菌落劃線于YPD培養(yǎng)基平板中進行純化，并保藏于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.2 釀酒酵母的一級篩選

挑取YPD培養(yǎng)基上的單菌落于TTC下層培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，倒入15 mL TTC上層培養(yǎng)基，并于30 ℃避光培養(yǎng)24 h。TTC顯色原理是：活菌中所含脫氫酶可將TTC還原成紅色，使平板上的菌落顏色呈現肉眼可見的紅色菌落，且呈色的深淺可判斷酵母產酒精能力的高低，產酒精能力強的酵母會顯示深紅色，次之顯粉紅色、微紅色或不顯色[9]。因此TTC可作為釀酒酵母利用葡萄糖產乙醇能力的顯色劑。

1.4.1.3 釀酒酵母的二級篩選

取30 ℃，220 r/min培養(yǎng)48 h后的菌液50 μL接種于含有杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，靜置培養(yǎng)，每2 h觀察1次杜氏小管中氣泡體積。杜氏管中產生氣泡的時間和氣泡的體積可直接反映菌株發(fā)酵的起酵速度和發(fā)酵能力。通過杜氏小管篩選試驗，篩選出起酵速度快且發(fā)酵能力強的菌株。

1.4.1.4 釀酒酵母的三級篩選

不同的釀酒酵母分別進行枸杞酒發(fā)酵實驗，發(fā)酵工藝如下：枸杞20 g，料液比為1∶10(質量比)，白砂糖調節(jié)糖度為200 g/L，酵母接種密度為1×107CFU/mL，添加偏重亞硫酸鉀至SO2含量為100 mg/L，果膠酶為30 U/g，發(fā)酵溫度20 ℃。每24 h測定重量損失以監(jiān)測發(fā)酵，發(fā)酵液24 h內失重<0.2 g視為發(fā)酵結束，發(fā)酵結束后過濾并對發(fā)酵液進行理化指標和GC-MS分析。設置3個生物學平行。

1.4.2 常溫室壓等離子體誘變

ARTP誘變條件參考田甜甜[6]離子體誘變方法。

1.4.3 高通量篩選

(1)初篩：利用自動挑菌儀挑取平板上長出的單菌落，接入裝有100 μL YPD培養(yǎng)基的96孔板中，220 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)2 d，用酶標儀測定OD600。將未接種的培養(yǎng)基用作對照，選取OD600較出發(fā)菌株明顯提高的正向突變株，甘油管保藏，并進行復篩。

(2)復篩：為了驗證突變菌株的發(fā)酵性能，將出發(fā)菌株和初篩的突變菌株進行發(fā)酵實驗。將上述菌株分別接入含糖量200 g/L的枸杞汁中，20 ℃條件下發(fā)酵。發(fā)酵結束后，使用GC-MS測定揮發(fā)性成分，篩選出具有良好風味的突變菌株。

1.4.4 發(fā)酵實驗

發(fā)酵條件同1.4.1.4。通過測定CO2失重來檢測發(fā)酵過程，并對獲得的枸杞酒進行理化指標測定和感官評價。

1.4.5 正向突變菌株遺傳穩(wěn)定性

將誘變后的菌株進行枸杞酒的發(fā)酵，發(fā)酵結束后，離心(10 000 r/min，3 min)收集釀酒酵母菌株于YPD中，220 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)2 d，進行下一次的枸杞酒發(fā)酵。連續(xù)傳代培養(yǎng)7次，發(fā)酵結束后通過測定枸杞酒的主要風味化合物的含量來確定菌株是否具有遺傳穩(wěn)定性。

1.4.6 枸杞酒理化指標分析

pH、總糖、總酸、酒精度根據GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中描述的方法確定。

1.4.7 風味物質的分析

通過固相微萃取-氣相色譜-質譜法(solid phase microextraction-GC-MS，SPME-GC-MS)測定枸杞酒中揮發(fā)性化合物，GC-MS條件參照李凱等[10]的方法。未知化合物的定性通過與NIST 05質譜庫中標準譜圖比對確定，化合物的定量通過在體積分數10%的乙醇溶液中配制待測化合物標準溶液并繪制標準曲線，依據標準曲線確定果酒中揮發(fā)性化合物的濃度[3]。OAV計算為在果酒中測得的某種物質濃度與其在葡萄酒中氣味閾值之間的比率[11-12]。

1.4.8 感官評價

由10名經過專業(yè)培訓的小組成員組成感官品評小組，對枸杞酒的色澤、香氣、口感和狀態(tài)4個方面進行打分，品評細則參考劇檸等[13]。

1.4.9 數據分析

每個獨立實驗重復3次，結果以平行實驗后含量的均值±標準偏差表示。使用Origin 2020b和IBM SPSS Statistics 25.0軟件進行繪圖和顯著性分析軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 枸杞酒釀酒酵母的初步篩選

2.1.1 釀酒酵母的分離及鑒定

從寧杞5號自然發(fā)酵液中分離出201株菌株，經過18S rDNA鑒定，其中釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)115株。115株釀酒酵母編號為M-1～M-115，并進行下一步的篩選。

2.1.2 釀酒酵母的一級篩選

TTC顯色劑能夠被活細胞中的脫氫酶還原，形成從無色到紅色的呈色反應，肉眼能直觀地觀察到細胞的呈色狀態(tài)[14]。釀酒酵母發(fā)酵過程是將葡萄糖經過糖醇解途徑生成丙酮酸，再經過丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶的作用生成乙醇。因此可利用TTC顯色原理對酵母菌株的產酒精能力進行篩選[9]。菌落顏色越深，表明菌株產酒精能力越強；呈淺紅色或無色，表明產酒精能力較弱或不產酒精[15]。其中20株顏色呈深紅色，8株呈粉紅色，對此28株菌株進行下一步的篩選。

2.1.3 釀酒酵母的二級篩選

酵母發(fā)酵過程中產生CO2氣體，杜氏管中產生氣泡的體積和時間可直接反映菌株發(fā)酵的起發(fā)酵能力和起酵速度。二級篩選結果顯示：在12 h內氣體充滿杜氏小管的菌株有11株，在24 h內氣體充滿杜氏小管的菌株有7株，在36 h內氣體充滿杜氏小管的菌株有5株，在48 h內氣體充滿杜氏小管的菌株有3株，48 h后氣體仍未充滿杜氏小管的菌株視為無發(fā)酵能力。選擇12 h內氣體充滿杜氏小管的11株菌株進行下一步的篩選實驗。

2.1.4 釀酒酵母的三級篩選

將篩選的11株釀酒酵母和4株商業(yè)釀酒酵母分別進行枸杞酒發(fā)酵實驗，根據理化指標及感官評價進行初步篩選，結果如表1所示。結果表明，15株釀酒酵母產酒精能力基本相同，但是對枸杞酒的品質影響顯著，其中M-23發(fā)酵的枸杞酒酒體醇厚，酯香明顯，酒體協調，且感官評價有最高得分。相較于其他14株菌株，M-23較適宜作為枸杞酒的釀造菌株，但菌株M-23發(fā)酵的枸杞酒香氣物質提高較少，因此本文以該菌株作為出發(fā)菌株，對其進行進一步選育。

表1 不同菌株發(fā)酵枸杞酒的理化指標及感官評價

2.2 ARTP篩選具有良好產香性能的菌株

誘變時間是ARTP誘變的重要參數，對獲得最佳突變菌株具有重要意義[16]?，F代育種理論表明，誘變致死率≥95%時，正向突變率最高，可獲得最佳突變體[17]。圖1為不同誘變時間處理下釀酒酵母M-23的致死率，表明在誘變時間為35 s時，M-23的致死率達到99.02%；當誘變時間延長至40 s時，致死率幾乎達到100%，因此確定35、40、45和50 s為ARTP誘變的最佳處理時間。然而，在誘變過程中，進行1次誘變處理獲得的非致死突變菌株中所需表型的菌株的比例很小，所以需進行重復誘變直至獲得目的菌株[6]。

圖1 不同處理時間下M-23致死率

將35、40、45、50 s處理時間下獲得的852個菌株接入裝有200 μL YPD液體培養(yǎng)基的96孔板中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)48 h后測定其OD600，M-23作為對照。挑選OD600明顯高于M-23的菌株進行枸杞酒釀造，測定其發(fā)酵特性和風味物質的含量，篩選出與對照組在的風味物質含量上具有顯著差異的菌株，并重復驗證，部分結果如表2和表3所示。4株菌株發(fā)酵枸杞酒的理化指標無明顯差異。在主要風味物質方面M-23-7-14的風味物質總含量明顯高于其他菌株。例如，M-23-7-14枸杞酒中β-紫羅蘭酮、苯乙醇、乙酸苯乙酯、辛酸和正己酸的含量分別是M-23的1.5、1.8、1.8、2.5和2.5倍。乙酸苯乙酯、苯乙醇和β-紫羅蘭酮具有典型的花香味，辛酸和正己酸具有奶酪味，分別對枸杞的香氣具有一定的貢獻?？傊cM-23相比，誘變菌株M-23-7-14菌株釀造的枸杞酒中風味物質的含量提高了37.0%。因此，菌株M-23-7-14作為后續(xù)實驗的目的菌株。

表2 ARTP誘變后枸杞酒的理化指標

表3 ARTP誘變后枸杞酒主要風味物質的相對含量 單位：μg/L

2.3 釀酒酵母 M-23-7-14的遺傳穩(wěn)定性分析

由于酵母存在自我修復機制，只有具有穩(wěn)定遺傳特性的菌株才能用于工業(yè)生產[18]，因此需要對菌株M-23-7-14進行遺傳穩(wěn)定性分析。對M-23-7-14進行傳代培養(yǎng)，并對發(fā)酵枸杞酒的主要風味化合物進行測定，結果如圖2所示。在7代傳代培養(yǎng)中，菌株M-23-7-14發(fā)酵的枸杞酒的風味物質含量均保持相對穩(wěn)定水平，說明菌株M-23-7-14具有較好的遺傳穩(wěn)定性，可用于枸杞酒的釀造。

圖2 M-23-7-14遺傳穩(wěn)定性的驗證

2.4 枸杞酒揮發(fā)性化合物含量分析

2.4.1 揮發(fā)性化合物半定量分析

風味作為果酒的一個產品屬性，是評價其品質的重要指標，而風味物質的種類、含量、感官閾值及其相互作用，是構成果酒香氣的重要因素，決定了果酒的風味特征和典型特征[6]。目前，最普遍的分析方法是GC-MS和感官評價法[19]。主要的揮發(fā)性化合物對枸杞酒的品質發(fā)揮著重要作用，利用GC-MS對枸杞酒中的揮發(fā)性化合物進行檢測(數據未顯示)。在2種市售枸杞酒(健康快車、金色傳杞)和2種自釀枸杞酒中共檢測出84種揮發(fā)性化合物，其中醇類物質13種，酯類化合物38種，酸類化合物7種，醛/酮類化合物15種，芳香烴類化合物2種，其他類化合物6種。不同枸杞酒中揮發(fā)性化合物種類存在一定的差異，市售健康快車枸杞酒中檢測出的揮發(fā)性化合物種類最少，有37種，M-23-7-14菌株發(fā)酵枸杞酒中檢測出的化合物種類最多有53種，M-23菌株發(fā)酵枸杞酒和市售金色傳杞枸杞酒分別檢測出49和39種揮發(fā)性化合物。相較于菌株M-23，菌株M-23-7-14釀造的枸杞酒中癸酸和辛酸分別是M-23釀造枸杞酒的16.4和11.6倍，癸酸和辛酸具有黃油奶酪味，對枸杞酒的香氣具有積極作用[20]。值得一提的是，β-紫羅蘭酮是枸杞酒具有代表性的水果香氣物質，該物質閾值極低，對果酒的香氣品質影響極為明顯[21]。在2種市售的枸杞酒中未檢測到β-紫羅蘭酮的存在，且菌株M-23-7-14釀造枸杞酒中該物質的含量是M-23的2倍。為了進一步探究枸杞酒中風味物質對枸杞酒香氣的影響，選取4種枸杞酒中相對濃度較高及閾值較低的物質進行定量分析。

2.4.2 枸杞酒揮發(fā)性化合物的OAV分析

揮發(fā)性化合物的半定量分析可以測定枸杞酒中揮發(fā)性化合物的種類以及說明不同枸杞酒中揮發(fā)性化合物含量上的差異，但揮發(fā)性化合物在果酒中的實際含量和閾值對果酒的影響較大[3]。因此在揮發(fā)性化合物半定量的基礎上進行定量分析，可以更好地反應枸杞中揮發(fā)性化合物的含量。選取半定量分析中相對濃度較高及閾值較低的21種揮發(fā)性化合物進行了定量測定，并對其進行OAV分析。結果如表4所示。

揮發(fā)性化合物對枸杞酒香氣的貢獻主要取決于該化合物在介質中的閾值，OAV>1的化合物說明其含量高于閾值，其于樣品整體香氣的呈現具有貢獻作用，并且OAV值越大作用越顯著[22]。由表4所示，在2種市售枸杞酒(健康快車和金色傳杞)中OAV>1的特征香氣成分均為7種，與2種市售枸杞酒相比，自釀枸杞酒增加了2種OAV>1的物質(肉桂酸乙酯和β-紫羅蘭酮)，對增加枸杞酒的花香具有一定的貢獻。自釀枸杞酒中OAV最大的是乙酸異戊酯(10.5)，其次是異戊醇(8.3)、丙醇(6.6)、β-紫羅蘭酮(4.7)和肉桂酸乙酯(3.7)，對枸杞酒的果香、花香及紫羅蘭等香氣輪廓的形成起決定性作用。健康快車枸杞酒中OAV最大的是丙醇(5.8)，其次是乙酸乙酯(5.6)、乙酸異戊酯(4.4)、異戊醇(4.0)和丁酸乙酯(2.9)。對健康快車枸杞酒中清新口味、果香、花香以及威士忌等香氣輪廓的形成起決定性作用。金色傳杞枸杞酒中，OAV最大的是異戊醇(5.5)和丙醇(5.5)，其次是己酸乙酯(4.8)、丁酸乙酯(3.6)和乙酸異戊酯(3.4)，對金色傳杞的清新醇味、威士忌香以及水果香輪廓的形成起著決定性作用。整體來說，自釀枸杞酒中主要風味化合物的種類和含量均高于2種市售枸杞酒。

表4 枸杞酒香氣成分的OAV分析

3 結論

本研究基于菌種發(fā)酵性能實驗及感官品評分析，初步獲得1株生長及發(fā)酵性能良好的菌株M-23，菌株M-23發(fā)酵的枸杞酒，酒體醇厚、酯香明顯、酒體協調。以菌株M-23為出發(fā)菌株，通過ARTP和HTS進一步對枸杞酒優(yōu)良釀酒酵母進行選育，得到1株優(yōu)良菌株M-23-7-14。對不同菌株發(fā)酵的枸杞酒進行定性分析，結果表明M-23-7-14發(fā)酵枸杞酒的風味化合物的含量較出發(fā)菌株M-23提高了37.0%。本文首次對發(fā)酵枸杞酒中的風味物質進行定量研究，并結合OAV分析，明確了影響枸杞酒風味的9種揮發(fā)性化合物，分別是乙酸異戊酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、肉桂酸乙酯、丙醇、異戊醇、苯乙醇、β-紫羅蘭酮。本研究提供了一種系統(tǒng)選育枸杞酒釀酒酵母的方法，基于該方法篩選得到的M-23-7-14菌株釀造的枸杞酒風味物質的種類和含量均高于2種市售枸杞酒，且較出發(fā)菌株M-23風味物質含量提高了37.0%，對提高枸杞酒的香氣具有重要的參考價值。