鹽脅迫下六妹羊肚菌菌絲體的理化性狀

楊彤，孫靜，郝宸，王建瑞，劉宇

(魯東大學 農學院，山東 煙臺，264000)

六妹羊肚菌(Morchellasextelata)[1]是一類重要的藥食兩用真菌，因其獨特的外觀、鮮美的口感和較高的經濟價值引起了世界研究者的廣泛關注。TIETEL等[2]報道羊肚菌中含有豐富的氨基酸、蛋白質、礦質元素和維生素等物質。羊肚菌還具有各種藥用功效，如抗菌、抗氧化[3]、抗炎及提高免疫能力、抗過敏和降低血糖等。同時，研究者也一直對羊肚菌的人工栽培進行探索，目前羊肚菌的人工栽培技術已成功實現規模化生產。六妹羊肚菌是國內現主栽品種之一[4-5]，前期研究中，本實驗室發現六妹羊肚菌菌絲具有一定的耐鹽性，所以本文對鹽脅迫下羊肚菌菌絲體多糖及其抗氧化活性進行測定，探究多糖含量及體外抗氧化活性變化情況。

羊肚菌多糖是一類重要的真菌多糖，功效頗多，在抗腫瘤等方面具有天然的優勢[6]。段巍鶴等[7]對小鼠進行實驗，驗證了菌絲胞內外多糖應急攝入后具有明顯的抗疲勞的作用。姜浩等[8]總結了食用真菌多糖的研究進展。目前多糖的主要提取方法有酸堿提取法[9]、酶提法[10]、水提醇沉法[11]和超聲波輔助提取法[12]，每種方法各有優缺點。羊肚菌多糖又是一類天然抗氧化劑，有關其抗氧化活性測定的報道較多，主要包括羥自由基清除能力[13]，DPPH自由基清除能力[14]以及還原力[15]等方面。但是很少有關于鹽脅迫下羊肚菌理化性質的報道，鹽脅迫下，羊肚菌體內的多糖結構及物質活性可能會發生變化，XIONG等[16]就利用γ射線輻照六妹羊肚菌子實體，研究了輻射后羊肚菌子實體多糖的結構和抗氧化活性，發現多糖表面出現斷裂和孔隙，且輻射后抗氧化活性增加。因此本文對鹽脅迫下六妹羊肚菌多糖及抗氧化活性的研究具有十分重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

六妹羊肚菌菌種為云南、四川等地主栽品種組織分離擴繁后所得，編號M3。

1.2 主要試劑

固體PDA培養基(g/L)：土豆200、葡萄糖20、瓊脂16。

液體發酵培養基(g/L)：土豆200、葡萄糖20。

無水葡萄糖、氯化鈉、95%乙醇、無水乙醇、氫氧化鉀、苯酚、濃硫酸、硫酸鐵、水楊酸、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵，國藥集團化學試劑有限公司；維生素C，上海愛純生物科技有限公司；香柏油，中國上海懿洋儀器有限公司；DPPH，上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 儀器與設備

SQP型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；OLYMPUS-BX61顯微鏡，日本奧林巴斯公司；KQ-500DE型超聲提取儀，昆山市超聲儀器有限公司；T6新悅可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Neo15R高速冷凍離心機，上海力申科學儀器有限公司；HHS-21-6型恒溫水浴鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DGX-9243 B-1高溫鼓風干燥箱，上海福瑪實驗設備有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 鹽濃度的確定

將羊肚菌接種到添加NaCl的PDA培養基中，設定鹽濃度為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mol/L，共9個梯度。每隔12 h測量1次菌落直徑，72 h后停止并拍照保存，選擇合適的濃度。

1.4.2 菌種的培養與顯微觀察

將羊肚菌M3號接種到含玻璃紙的普通固體PDA培養基上，培養48 h后將玻璃紙轉移到鹽濃度0.3 mol/L的培養基脅迫處理，脅迫時間分別為0、3、6、12、24、48 h。培養完成后每個梯度挑取4～5處菌絲尖端，在顯微鏡下觀察，每組梯度測量100根以上菌絲直徑，觀察直徑變化。羊肚菌液體菌種設置對照組和實驗組，在正常液體培養基中先培養72 h，然后對照組繼續培養，實驗組加鹽進行鹽脅迫處理，處理梯度為0、3、6、12、24、48 h。培養完成后發酵液4 ℃保存待測，菌絲球過濾并用蒸餾水沖洗2～3遍，烘箱50～60 ℃干燥，稱量菌絲體干重后粉碎成粉末，密封備用。

1.4.3 羊肚菌多糖的提取與測定

提取對照組和實驗組各時間梯度胞內外多糖。胞外多糖的提取采用水提醇沉法，5 mL發酵液與20 mL 95%乙醇混合后，4 ℃醇沉24 h，醇沉后4 000 r/min離心20 min，去上清液留沉淀，沉淀中加入30 mL蒸餾水后100 ℃溶解30 min，冷卻后2 000 r/min離心20 min，上清液即為胞外多糖。胞內多糖參考黃玲玲[17]的提取方法，料水比為1∶40(g∶mL)，超聲波功率400 W，溫度60 ℃浸提40 min，然后60 ℃熱水浸提5 h，得到浸提液。浸提液按胞外多糖提取方法處理，最后得到胞內粗多糖溶液。取胞內外多糖溶液2 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻冷卻后在490 nm下測定吸光值，以蒸餾水作為對照，按標準曲線計算多糖含量，如公式(1)、公式(2)所示：

參考楊懷雷等[18]的方法繪制葡萄糖標準曲線，回歸方程為y=11.218x-0.017 7，R2=0.999 3。

(1)

(2)

式中：c為多糖的質量濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；n為稀釋倍數；m為樣品干重，g。

1.4.4 抗氧化性的測定

多糖溶液以1.4.3中3、6、12、24、48 h對照組和實驗組中胞內外多糖提取液進行抗氧化實驗。

DPPH自由基清除能力以維生素C為陽性對照，測定方法參照LEE等[19]的方法稍作調整。在試管中加入2 mL樣品液和2 mL DPPH溶液，以無水乙醇為本底將體系補至6 mL，混勻后迅速遮光反應30 min，然后在517 nm下測定吸光值，以蒸餾水做對照溶液。

羥自由基清除能力測定方法參考LI等[20]的方法。在試管中加入1 mL FeSO4溶液，1 mL水楊酸-乙醇溶液和2 mL樣品液，最后加入1 mL H2O2溶液，迅速混勻后靜置30 min，然后在510 nm下測定吸光度值。本底為蒸餾水，以蒸餾水做對照溶液，維生素C為陽性對照,清除率計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0為空白對照液的吸光值，Aa為樣品液的吸光值，Ab為樣品本底吸光值。

1.4.5 還原力的測定

采用鐵氰化鉀還原的方法[21]并簡化。在試管中依次加入1 mL樣品液，2 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液和2 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后50 ℃水浴30 min，冷卻后加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液。有沉淀產生需5 000 r/min離心10 min，取上清液，無沉淀則直接吸取2 mL反應液到試管中，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻后遮光反應30 min，在700 nm下測定吸光值。吸光值越高，證明還原能力越強。以維生素C為陽性對照。

1.4.6 數據統計與分析

所有數據均以平均數±標準差(x±s)表示，重復3次，用WPS 2019軟件統計分析，數據統計處理采用SPSS 19.0軟件，利用字母標記法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同鹽濃度菌絲生長情況

從不同鹽濃度梯度下羊肚菌菌絲生長狀況看，隨著鹽濃度的增加，羊肚菌菌絲的生長速度被抑制，鹽濃度越大菌絲生長越緩慢(圖1，圖2)。0.05 mol/L菌絲長速和長勢與正常培養菌絲相比無明顯變化，菌絲潔白濃密且粗壯。0.1～0.3 mol/L 5組濃度菌絲長勢較強，但生長速度與濃度呈反比。0.35、0.4 mol/L濃度下菌絲稀疏，長勢較弱。根據72 h時菌落直徑繪制表1，據表1中差異顯著性來看，除0.25 mol/L和0.3 mol/L兩組梯度之間無顯著差異，其他每組鹽濃度梯度之間都呈極顯著差異(P<0.01)，且這兩組鹽濃度菌落直徑約為正常生長的1/2。綜合考慮，最終選擇0.3 mol/L作為接下來的實驗鹽濃度。

圖1 不同鹽濃度下的菌絲生長勢

圖2 不同鹽濃度菌絲生長速度

表1 第72 h菌落直徑差異顯著性

2.2 不同培養時間菌絲顯微形態

由圖3可知，羊肚菌菌絲隨鹽脅迫時間的增加，菌絲形態無明顯變化，排列疏松無規律，未產生菌絲扭結等現象，直徑變化十分細微。根據菌絲直徑數據可得出隨著脅迫時間的增加，菌絲直徑慢慢減小(圖4)，0 h和3 h菌絲變化無顯著差異，到48 h菌絲直徑與其他組別相比則呈顯著差異性(P<0.05)。顯然脅迫時間長短對菌絲直徑具有一定影響，可能是菌絲外部為高滲環境，菌絲細胞失水縮小，所以脅迫時間越長，菌絲直徑越小。

圖3 0.3 mol/L鹽濃度脅迫不同時間菌絲形態圖(×1 000)

圖4 0.3 mol/L鹽濃度脅迫不同時間后放大1 000倍菌絲直徑圖

2.3 胞內外多糖含量測定及菌絲體干重對比

由圖5可知，鹽脅迫后胞內多糖含量普遍低于正常環境中胞內多糖含量。對照組胞內多糖含量變化顯著，可能是由于羊肚菌液體菌種生長周期為7 d左右，生長3 d后開始產生色素，對多糖的形成產生影響。到培養中后期培養基的營養成分減少，但菌絲質量一直增加，所以使菌絲胞內多糖減少。在3 h時，實驗組胞內多糖含量高于對照組，為12.74 mg/g。由于羊肚菌菌絲剛處于逆境環境下，菌絲釋放多糖等營養物質來抵御逆境，含量增加，隨后一部分作為有機滲透調節物質降低滲透勢而緩解鹽脅迫，另一部分作為生長所需營養物質，所以多糖含量顯著下降。對照組和實驗組胞外多糖先增加后減少，12 h時含量最高，分別為0.29 mg/mL和0.14 mg/mL，實驗組多糖總體含量遠低于對照組多糖含量(圖6)。

圖5 胞內多糖含量

圖6 胞外多糖含量

由圖7可知，隨脅迫時間的增加，對照組和實驗組菌絲干重都呈上升趨勢。但在脅迫3 h和6 h時，羊肚菌菌絲剛受到脅迫，菌絲干重增加，略高于對照組菌絲干重，多糖含量增加可能也與此有關。12 h之后，對照組菌絲干重的增長趨勢則高于實驗組干重增長趨勢，鹽脅迫對菌絲開始出現抑制作用。

圖7 菌絲干重

2.4 抗氧化活性的研究

所有結果中維生素C質量濃度均為0.3 mg/mL，維生素C對照組和實驗組為兩次重復試驗，主要作為對照進行參考。

2.4.1 胞內外多糖對DPPH自由基的清除率

由圖8可知，維生素C具有很高的DPPH自由基清除效率，與之相比羊肚菌胞內多糖清除效率較低，但也具有一定的清除能力。隨著培養時間的增加，對照組和實驗組清除率變化趨勢明顯，對照組清除率分別為10.3%、15.6%、12%、11.5%和17.1%，實驗組清除率分別為35.8%、34.3%、33.6%、31.2%和34.3%。圖9為羊肚菌胞外多糖對DPPH自由基的清除率對比圖，對照組清除率分別為5.8%、3.6%、7.1%、4.2%和9.2%，實驗組為24.9%、24.2%、23.6%、23.5%和24.8%。結果顯示，實驗組胞內外多糖對DPPH自由基的清除率明顯高于對照組，胞內多糖清除能力最高提升了3.47倍，胞外多糖清除能力最高提升了6.72倍。由此，可知鹽脅迫增加了多糖對DPPH自由基的清除能力。而據2.3中胞內外多糖含量變化來看，多糖對于清除率總體趨勢無明顯影響。

圖8 胞內多糖的DPPH自由基清除率

圖9 胞外多糖的DPPH自由基清除率

2.4.2 胞內外多糖對羥自由基的清除率

由圖10可知，胞內多糖對羥自由基的清除率分別為，對照組3.6%、1.9%、3.1%、1%和0.4%，實驗組16.9%、15.1%、27.5%、11.9%和11.1%。圖11為胞外多糖羥自由基清除率對比圖，對照組清除率分別為2.2%、2.8%、4.6%、3%和2.8%，實驗組清除率分別為5.5%、7.7%、8.5%、7.9%和7.5%。結果顯示，實驗組胞內多糖清除羥自由基的能力遠高于對照組，在12 h時清除率最高，為27.5%。胞外多糖中實驗組清除羥自由基能力也高于對照組，清除率最高提升了2.75倍。說明鹽脅迫也促進了多糖對羥自由基的清除能力。由2.3中胞內外多糖含量變化來看，胞內外多糖的清除率大致也呈先上升后下降的趨勢，

圖10 胞內多糖的羥自由基清除率

圖11 胞外多糖的羥自由基清除率

2.5 還原力的測定

抗氧化劑能將鐵氰化鉀還原，利用亞鐵離子生成普魯士藍，普魯士藍在700 nm處有最大吸收峰，所以吸光值越高，說明還原能力越強。由圖12可知，鹽脅迫下，胞內多糖的還原力明顯降低。胞外多糖還原力先升后降再上升，6 h和48 h為上升時間點(圖13)。結果顯示，脅迫環境對羊肚菌胞內多糖還原能力的影響大于對胞外多糖還原能力的影響，而多糖含量的變化趨勢對還原能力則無明顯影響。

圖12 胞內多糖還原能力

圖13 胞外多糖還原能力

3 結論

鹽脅迫下羊肚菌菌絲生長速度減慢，菌絲直徑減小，胞內多糖和胞外多糖呈先升后降趨勢，總體含量低于正常含量，但多糖對DPPH自由基和羥自由基的清除能力上升。對DPPH自由基的清除能力，胞內多糖最高提升了3.47倍，胞外多糖最高提升了6.72倍；對羥自由基的清除能力，胞內多糖清除率最高提升到27.5%，胞外多糖最高提升2.75倍。與冮潔等[22]測定的羊肚菌多糖不同的是，本文鹽脅迫下羊肚菌菌絲體多糖含量下降，但抗氧化性增強，而富硒羊肚菌菌絲體多糖含量增加且抗氧化性增強。還原能力上，胞內多糖還原能力下降，胞外無明顯升高或降低，總體來說DPPH自由基清除能力>羥自由基清除能力>還原能力。本研究所提取的多糖為粗多糖，提取未純化，后期可以進一步對提取方案進行優化。

目前羊肚菌的栽培多在普通耕地上進行，鹽堿地中栽培還未有人報道，而對于其可行性已有學者進行研究。如2020年李樹文等[23]就對耐鹽堿羊肚菌菌株進行了篩選。鹽脅迫下羊肚菌生理活性和分子機制的研究還是一片空白，因此深度探究鹽脅迫對羊肚菌理化性質的影響，可以對羊肚菌抗鹽育種及栽培提供一定的前期基礎和理論依據。