焦曲霉色素結構的鑒定及產色素條件的優化

周明輝，曾慧云，王夢倩，張雁，王占軍

(合肥師范學院 生命科學學院，安徽 合肥，230061)

色素在食品、日用化工、化妝品和醫藥工業得到廣泛的應用，而化學合成的色素具有一定的毒性、致癌、致畸性，因此以天然色素取代化學合成色素已成為食品工業的發展趨勢[1-2]。天然色素主要來自動植物、微生物的組織或代謝產物，大多無副作用，安全性高，很多天然色素具有預防治療疾病、抗菌消炎、抗腫瘤、抗氧化等功能，應用價值較高[3]。而微生物天然色素，具有來源廣、價格低廉，成本較低、受環境因素影響小等諸多優點，且能夠避免動植物天然色素的許多缺陷，具有較大的發展潛力[4]。大部分細菌、真菌、放線菌都能夠產生天然色素，但很多菌株色素產量低，有的菌株同時也產生毒素，純化色素比較困難，因此從環境中篩選出高效、安全的產色素菌株尤為重要[5]。研究發現，絲狀真菌菌源容易獲取，菌絲發達，繁殖迅速，在食品中應用較多，如紅曲霉產生的紅曲色素[6]、三孢布拉霉產生的番茄紅素和β-胡蘿卜素等[7]。絲狀真菌色素具有化學結構多樣、生物活性顯著、生產方便、消炎抑菌并往往兼有營養保健功能等優點，因此，絲狀真菌有望成為食品色素的可靠來源[8]。

本實驗室從環境中分離出1株焦曲霉，能產生豐富的棕紅色色素，目前對該色素的研究未見報道，因此，本課題對該色素的組成特性、化學結構以及產色素的條件進行深入研究，以期開發出一種新型的天然的可食用的微生物源色素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

焦曲霉：由合肥師范學院微生物實驗室分離純化鑒定，上海生工有限公司分子測序。

1.1.2 培養基

馬丁氏培養基(g/L)：葡萄糖 12.0，蛋白胨4.5，KH2PO41.2，MgSO4·7H2O 0.6，瓊脂18～25，pH自然，0.1 MPa，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑藥品

所用試劑藥品均為分析純，國藥集團化學試劑上海有限公司；應用于GC-MS的溶劑為色譜級甲醇，美國TEDIA公司；HPD600大孔樹脂、硅膠(200～300目)、中性氧化鋁(100～200目),青島海洋化工有限公司。

1.1.4 儀器與設備

BXM-50VE高壓蒸汽滅菌器、BSD-YX-2000立式搖床，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；Allegra 64r高速冷凍離心機，美國貝克曼儀器設備有限公司；LGj-10真空冷凍干燥機，北京松源華興科技有限公司；IKA RV10旋轉蒸發儀，德國艾卡儀器設備有限公司；UV-2100紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司；Nicolet 380紅外光譜儀，美國Themo Fisher科技有限公司；7890B-5977A GC-MS，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 焦曲霉色素粗提物的制備

無菌水沖洗焦曲霉保藏斜面，制成×106個/mL孢子懸液，吸取1 mL孢子懸液加入到150 mL馬丁氏培養基中，置28 ℃、150 r/min振蕩培養箱中振蕩培養96 h。對焦曲霉發酵液進行10 000 r/min離心10 min，提取色素上清液，置冷凍干燥機的金屬圓盤，并用扎孔的透明薄膜封口，置于-20 ℃預凍12 h，繼而在真空冷凍干燥機中干燥12 h，后加入體積分數60%乙醇浸泡24 h，10 000 r/min離心10 min，去除蛋白與多糖，60 ℃旋轉蒸發干燥與真空冷凍干燥，獲取色素的粗提物。

1.2.2 焦曲霉色素的分離純化

稱取0.1 g色素粗提物，溶解到10 mL蒸餾水中，作為色素點樣樣品。分別配制V(氯仿)∶V(甲醇)=50∶50、V(水)∶V(甲醇)∶V(乙醇)= 20∶30∶50、V(水)∶V(乙醇)=40∶60、V(石油醚)∶V(氯仿)=40∶60、V(水)∶V(醋酸)∶V(乙醇)=20∶30∶50作為展開劑系統，選取購置的硅膠板作為固相載體，進行薄層層析，對色素進行分離，判斷色素的組成特性。利用毛細管在距離硅膠板底部1 cm進行5次平行點樣，置于不同展開劑的層析缸中，展開劑不能沒過硅膠點樣線，當展開劑前沿移至距離薄層板上端處，停止展開，按照公式(1)計算比移系數(retardation factor，Rf)。根據薄層層析結果，選取合適的展開劑作為淋洗劑進行柱層析，色素水溶液為樣品，以大孔樹脂、中性氧化鋁、硅膠作為吸附材料進行柱層析純化色素，將分離純化較好的層析液進行干燥，獲取色素的精提物。稱取一定量的色素精提物粉末溶解在色譜級甲醇中，并高速離心，獲取色素濾液，進行后續實驗。

(1)

1.2.3 色素的紫外可見與紅外掃描

將色素濾液在200～800 nm進行紫外可見掃描，以甲醇作為空白對照，獲取該色素的最大吸收峰；稱取0.1 g色素精提物粉末，按質量比1∶100與KBr粉末混合均勻壓片，紅外光譜儀在400～4 000 cm-1范圍內進行掃描分析，獲取焦曲霉色素重要化學基團的信息。

1.2.4 色素GC-MS

將色素濾液，用于GC-MS分析。采用Trace GC Ultra和ISQ Ⅱ MS對色素進行分析，GC-MS柱為TG-35 ms 的石英毛細管柱，柱溫設定從50 ℃程序升溫至300 ℃(10 ℃/min)，載氣(氦氣)流速為1 mL/min；注射器和檢測器溫度為280 ℃，質譜分析在EI模式、70 eV 條件下進行滿掃。

1.2.5 碳氮源對焦曲霉色素產量的影響

以馬丁氏培養基為基礎，按表1選擇同量的不同種類的碳氮源進行單因素試驗，每種組合培養基均取150 mL，接種1 mL的×106個/mL濃度的焦曲霉孢子懸液，于28 ℃、150 r/min振蕩培養96 h，10 000 r/min 離心10 min，取上清液在色素最大吸收峰下檢測其OD值，以未接種的相應培養基作為對照，每種組合設置3個平行，以獲取最適碳氮源。

表1 碳氮源試驗

1.2.6 產色素條件的優化

結合1.2.5實驗結果，以馬丁氏培養基為基礎，采用均勻設計法對最適碳氮源、pH、溫度、搖床轉速、孢子懸液接種量、發酵時間7個因素進行優化實驗，以獲取最適產色素條件，提高色素產量，每批次試驗配制150 mL培養基，做3次平行實驗。

2 結果與分析

2.1 焦曲霉色素粗提物

焦曲霉經過96 h發酵培養，產生了豐富的棕紅色色素，色素經焦曲霉菌發酵產生并分泌到胞外，進入發酵液(圖1-a)，色素水溶性較高；發酵液經過離心，得到棕紅色上清液(圖1-b)，經真空冷凍干燥處理獲取了色素粗提粉末(圖1-c)，該色素粉末在空氣中吸濕性較強，易潮解。

a-色素發酵液；b-色素水溶液；c-色素粗提物

2.2 焦曲霉色素的薄層層析

在薄層層析實驗中，不同的展開劑對焦曲霉色素的分離情況不同。

氯仿∶甲醇分離系統：色素向上輕微移動，Rf= 0.14±0.025，難以分離，有拖尾現象，分離效果不佳(圖2-a)；甲醇∶乙醇分離系統：色素向上移動較快，分離較好，Rf= 0.7±0.008(圖2-b)；水∶乙醇分離系統：色素向上快速移動，分離較好，Rf= 0.72±0.008(圖2-c);石油醚∶氯仿分離系統：色素基本無移動，分離效果較差，Rf= 0(圖2-d)；水∶醋酸∶乙醇分離系統：色素向上快速移動，分離較好，Rf=0.71±0.004(圖2-e)。

圖2結果說明該色素在極性較強的展開劑中，移動速度較快，分離效果較好，能被甲醇、乙醇、醋酸、水等極性較強物質拖動，而極性較弱的如氯仿、石油醚不能將色素拖動，其中水∶乙醇分離系統對色素的分離效果最好，性價比較高，可選擇該展開系統作為后續的柱層析淋洗劑。不同的展開劑系統對色素進行分離，發現只有一種色素斑點，且顏色單一，推測焦曲霉色素是一種單一色素。

a-氯仿∶甲醇分離系統；b-水∶甲醇∶乙醇分離系統；c-水∶乙醇分離系統；d-石油醚∶氯仿分離系統；e-水∶醋酸∶乙醇分離系統

2.3 焦曲霉色素的柱層析

以色素粗提物的水溶液作為柱層析樣品，分別選取大孔樹脂、中性氧化鋁、硅膠作為吸附材料，以薄層層析性價比最高的60%(體積分數)乙醇展開劑作為淋洗劑，采用干法裝柱，進行柱層析，進一步對色素進行分離純化，并收集層析液。由于大孔樹脂的吸附力較強，和焦曲霉色素結合牢固，淋洗劑無法分離色素(圖3-a)；中性氧化鋁與該色素的結合力較弱，輕易被水乙醇系統淋洗下來，但該色素整體溶解在淋洗系統中，達不到分離純化的目的(圖3-b)；而該色素在硅膠結合適中，淋洗劑洗脫效果較好，能形成唯一單一的色素環，說明該色素為單色素，與色素薄層層析結果一致(圖3-c)。收集硅膠柱層析的色素環流出液，對其進行旋轉蒸發與真空冷凍干燥，并溶解于色譜級甲醇中，高速離心超濾獲取色素濾液(圖3-d)，由于色素在甲醇中的溶解度較低，相比色素水溶液，色澤明顯下降。

a-大孔樹脂柱層析；b-硅膠柱層析；c-氧化鋁柱層析；d-色素濾液

2.4 色素紫外可見掃描

a-焦曲霉色素紫外可見掃描；b-焦曲霉色素紅外掃描

2.5 焦曲霉色素的GC-MS檢測

對焦曲霉色素濾液進行GC-MS檢測，從50～300 ℃ 連續性升溫氣相檢測，重復3次樣品，主要出現了2個主要的峰型且峰型一致，峰型較好，說明檢測出2種主要物質，保留時間分別為18.549 min與21.565 min(圖5)。

圖5 焦曲霉色素氣相色譜

通過質譜檢測，保留時間18.549與21.565 min分子質量分別為154 Da與386 Da(圖6-a)，與NITS圖庫的比對，分子質量154 Da的化學結構推測為吡咯并[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮六氫匹配度為50.2%，分子質量為386 Da的化學結構為二蒽酮類，匹配度達到98%(圖6-b)，圖庫給出的結構與紅外檢測的結果一致。

a-色素質譜；b-質譜解析

2.6 不同碳氮源對焦曲霉產色素的影響

選擇不同的碳氮源作基礎培養基，培養96 h，在298 nm 處檢測OD值，以判斷色素合成的最適碳氮源。不同碳氮源對焦曲霉色素產量的影響差異較大，其中葡萄糖與蛋白胨的組合，色素產量最高(圖7)，因此選擇葡萄糖與蛋白胨為最適碳氮源作進一步優化試驗。

圖7 碳氮源試驗

2.7 產色素條件的優化

表2 均勻設計與響應因子

并對試驗結果的各個因素進行顯著性檢驗與回歸模型方差分析，7個因素中有pH、溫度、搖床轉速、孢子懸液接種量、發酵時間、葡萄糖6個因素顯著(P<0.05)(表3)，說明該6個因素對焦曲霉生產色素具有較大影響，而蛋白胨的量對色素的產生影響不顯著。R2為99.2%，說明99.2%試驗數據可以以此模型解釋，達到試驗要求，P值為0，該模型具有顯著意義(表4)。應用MatlabR2012b軟件解方程1獲得焦曲霉產色素最優條件為：pH 7.1、溫度 25.8 ℃、轉速221.8 r/min、脫色時間128.7 h、接種量2.8 mL/150mL、葡萄糖16 g/L、蛋白胨12 g/L，色素理論產量OD值2.62，在最優脫色條件下作驗證試驗，色素OD值達到2.48，與預測值相仿。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗

表4 回歸模型方差分析

3 討論

研究發現大多數微生物均能產生色素，且很多色素具有生物學活性，如抗菌、抗癌、抗輻射和抗氧化等，但實際應用較少，目前唯一能夠大規模實際應用的只有紅曲色素，主要是由于微生物色素的穩定性易受到外界物化因素的影響，優良產色素菌株的缺乏、色素往往伴隨著毒素的產生以及色素提純較難等，限制了微生物色素的實際應用[10]。本研究分離的1株焦曲霉，產生的色素豐富，色澤鮮艷，且是胞外水溶性的色素，易于提取，為實際應用提供一定的基礎。

色素的分離純化及結構鑒定，有利于研究紅色素的功能性及其穩定性，薄層層析法、柱層析法、HPLC、GC-MS等都是色素分離純化的主要方法[11-12]。硅膠薄層層析以及柱層析分離純化色素操作方便，分析速度快，分離效果好，不需要昂貴的儀器設備，只要通過使用不同的展開劑，就能夠得到所需要的色素條帶，并且結果直觀、分離能力較好[13]。本研究得到的焦曲霉色素，利用不同的展開劑在硅膠板上進行薄層層析，能得到單一斑點的色素，分離效果較好，并通過柱層析得到色素精提物濾液，以便進行化學結構的鑒定。GC-MS色譜圖顯示，檢測出色素主要有2種物質，氣化溫度分別在235 ℃與265 ℃左右，質譜檢測并與NIST圖庫比對，得到了2種物質的結構，分別為吡咯吡嗪二酮與二蒽酮類，顯示的結構與紅外檢測的基團吸收峰基本一致，吡咯吡嗪二酮類是一種擬肽化合物，具有保護神經、抗菌等多種生物活性[14]，而且吡咯吡嗪二酮作為發色體應用于染料工業中，該發色體，色澤明亮，多為橙黃色[15]；而作為母體結構的二蒽酮類是一般呈黃色，二蒽酮類衍生物主要存在豆科灌木植物狹葉或尖葉番茄中，是一種植物性聚酮類色素，具有瀉下、止血、抗菌抗病毒的功能[16-17]；蒽醌和萘醌等聚酮類化合物是真菌常見的色素類化合物，已發現了大約700種蒽醌類化合物，如常見且應用于食品工業的紅曲霉素就是由紅曲霉產生的聚酮類色素[18]，但具有二蒽酮結構的聚酮類色素產生還未見報道，因此，焦曲霉色素可能同時含有吡咯吡嗪二酮與二蒽酮類化學結構的一種復合色素，是一種全新的微生物源類色素，且該兩種物質結構具有較多的生物活性，后續需進一步對該色素的穩定性進行研究，包括高溫、光照、重金屬以及還原與氧化劑對色素穩定性的影響，為實際應用奠定基礎。均勻設計法常應用于因素水平較多的實驗設計，相比于正交設計、響應面設計，具有試驗次數少、布點更均勻、更高效等特點，能夠快速有效地實現條件優化[19-20]。