ε-聚賴氨酸復合保鮮劑對雞毛菜品質及微生物的影響

韓揚，朱成志，李沁雨，李立，馬新新，趙志軍，包怡紅*

1(東北林業大學 林學院，黑龍江 哈爾濱，150040)2(中國科學院上海高等研究院 綠色化學工程研究中心，上海，201210)3(上海科技大學 生命學院，上海，201210)4(上海清美綠色食品(集團)有限公司，上海，201399)

雞毛菜(BrassicarapaL.Chinensis Group.)屬十字花科蔬菜，又名青菜，是小白菜幼苗的俗稱[1]，因富含胡蘿卜素、抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)以及多種礦物質而深受市場歡迎[2]。然而雞毛菜作為鮮嫩葉類菜，采后極易受到微生物污染而發生腐敗，貯存期平均損耗率達30%以上[3]，造成嚴重的經濟損失。目前雞毛菜主要采用物理低溫的方式進行貯存保鮮[4]，最佳貯存時間為3～5 d，而市場上尚未見專用于雞毛菜的保鮮劑。目前常見的蔬菜保鮮劑多為化學保鮮劑[5-7]，隨著人們對食品安全要求的日益提高，研究和開發適用于雞毛菜等嫩葉類蔬菜保鮮的天然、綠色保鮮劑，對降低蔬菜損耗，促進產業綠色發展具有重要意義。

嫩葉類蔬菜水分含量高、營養豐富，使得采摘后蔬菜切口處污染的微生物得以快速繁殖，造成蔬菜品質大幅下降，因此，嫩葉類蔬菜的微生物控制成為其貯存保鮮的關鍵因素之一[8]。ε-聚賴氨酸(ε-polylysine，ε-PL)是一種由白色鏈霉菌發酵產生的新型天然抑菌物質，具有安全性高、抗菌譜廣、作用pH范圍寬、熱穩定性高等優點[9]。其在日本、美國等國家食品行業中獲得廣泛應用。2014年國家衛計委批準ε-聚賴氨酸鹽酸鹽在蔬菜保鮮中應用，目前國內仍以實驗研究階段為主[10-11]。FAN等[10]采用23 W/L超聲和0.4 g/L ε-PL復合處理鮮切萵苣，其微生物增長受到抑制，4 ℃貯藏12 d，AsA含量減少量降低了44.02%。李立[11]使用0.10 g/L的ε-PL和10 g/L的AsA溶液浸泡鮮切杭白菜，低溫貯藏7 d，質量損失率不超過4%，色澤等感官指標維護較好。

本文以嫩葉蔬菜雞毛菜為研究對象，考察ε-PL復合肉桂提取物(cinnamon extract,CE)對雞毛菜品質及微生物的影響，響應面優化ε-PL與肉桂提取物的復配比例，并最終通過高通量測序技術探討ε-PL復合肉桂提取物對雞毛菜菌群結構和多樣性的影響，解析復合保鮮劑的抑菌保鮮機制，為其在嫩葉類蔬菜保鮮中的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：雞毛菜品種為“華王”，購于上海市乾溪菜市場。

試劑：ε-PL，浙江新銀象生物工程有限公司；肉桂提取物，湖南先偉實業有限公司；抗壞血酸，鄭州偉豐生物科技有限公司；其他試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ME3002電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BCD-312 WDPV電冰箱，上海海爾集團公司；SW-CJ-2FD凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；ZXDP-A2160電熱恒溫培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；DK-8D電熱恒溫水槽，上海恒一科學儀器有限公司；SCIENTZ-11L無菌均質器，寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

將新鮮雞毛菜分成兩組，對照組(CK)和試驗組(T)，對照組用純凈水浸泡，試驗組用復合保鮮劑溶液浸泡后撈出，瀝干雞毛菜表面多余水分，裝入保鮮袋，4 ℃貯藏，每3 d(試驗當天為第1天)測定雞毛菜的菌落總數及AsA含量。

1.3.2 單因素試驗設計

單因素試驗中，研究ε-PL質量濃度對雞毛菜貯藏品質的影響時，作用時間為10 min，CE的質量濃度為0.40 g/L，ε-PL的質量濃度分別為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 g/L；研究CE質量濃度對雞毛菜貯藏品質的影響時，作用時間為10 min，ε-PL的質量濃度為0.40 g/L，CE的質量濃度分別為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 g/L；研究作用時間對雞毛菜貯藏品質的影響時，CE的質量濃度為0.40 g/L，ε-PL的質量濃度為0.40 g/L，作用時間分別為5、10、15、20、25 min。

1.3.3 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇ε-PL質量濃度、CE質量濃度以及作用時間作Box-Behnken試驗設計，以4 ℃貯藏13 d的雞毛菜的菌落總數(Y1)和AsA含量(Y2)為響應值，試驗因素和水平設計見表1。考察復合保鮮劑對雞毛菜貯藏品質的影響。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平

1.3.4 復合保鮮劑效果驗證

根據響應面試驗得到的最佳保鮮劑配方，測定雞毛菜的菌落總數和AsA含量，驗證復合保鮮劑對雞毛菜貯藏品質的影響，并測定雞毛菜的微生物多樣性，分析復合保鮮劑的作用機制。

1.3.5 指標測定

AsA含量測定：參照GB 5009.86—2016《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》，采用2,6-二氯靛酚滴定法。菌落總數測定：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。微生物多樣性測定：蔬菜樣品取0.5 g于超低溫冰箱保存，送往上海美吉生物醫藥科技有限公司，采用Illumina MiSeq測序技術進行樣品測定，并進行聚類和多樣性分析。感官評價參照表2。

表2 雞毛菜的感官評分

1.4 數據處理

所有試驗重復3次，取平均值。數據統計分析采用IBM SPSS Statistics 26.0，制圖軟件采用Origin 8.0，響應面試驗設計采用Design-expert 12.0。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗分析

2.1.1 ε-PL質量濃度對雞毛菜菌落總數和保鮮效果的影響

雞毛菜營養豐富，含水量高，容易滋生微生物發生腐敗變質[12]。由圖1-a可知，保鮮劑組在貯存期1～7 d，對雞毛菜微生物控制均顯著好于CK組(P<0.05)。CK組菌落總數從第1天的5.39 lgCFU/g增加至6.43 lgCFU/g，增長量為19.29%，已經腐敗變質；而僅添加0.20 g/L ε-PL+0.40 g/L CE的保鮮劑組菌落總數為5.86 lgCFU/g，增長量降低了8.73%，雞毛菜感官品質良好；在7～13 d，發現試驗中ε-PL和CE復合保鮮劑組的抑菌效果明顯優于CE單獨使用時的抑菌效果(P<0.05)，表明盡管CE同樣具有一定的抑菌作用，但ε-PL和CE復合保鮮劑表現出更佳的抑菌特性。同時發現在7～13 d，0.60～1.0 g/L ε-PL+0.40 g/L CE復合保鮮劑組的菌落總數接近，但明顯小于0.20～0.40 g/L ε-PL+0.40 g/L CE復合保鮮劑組的菌落總數(P<0.05)，說明現有體系中，0.60 g/L的ε-PL質量濃度已經達到較好抑菌效果。

AsA是重要的抗氧化物質，是蔬菜營養品質的重要理化指標。由圖1-c可知，雞毛菜貯藏過程中AsA含量呈下降趨勢。1～7 d，CK組雞毛菜的AsA含量下降了58.89%，感官評分為42.50分，雞毛菜發生腐爛，失去商業價值，而同時復合保鮮劑組的AsA含量僅下降了25.25%～33.16%，感官評分為72.90～87.00分，雞毛菜菜葉鮮綠、無褶皺，品質仍良好。第10天，單獨使用CE的保鮮劑組，AsA含量下降了61.52%，雞毛菜褶皺卷曲，出現異味，失去商業價值，但同時ε-PL和CE復合保鮮劑組的AsA下降量為29.82%～42.24%，僅出現少數綠葉邊緣卷曲，無異味，進一步說明ε-PL通過增強微生物控制，可以達到對雞毛菜的抗氧化性和感官品質的保護作用；第13天，復合保鮮劑組的AsA減少量達到40.00%以上，雞毛菜均出現褶皺，蔬菜開始出現異味，接近貯存極限；其中，0.60 g/L ε-PL+0.40 g/L CE保鮮劑組的感官評分較優于其他組(P<0.05)(圖1-b、圖1-c)。袁園等[13]利用等離子體活化水處理鮮切生菜，4 ℃貯藏4 d AsA損失量為29.30%，貯藏10 d菌落總數達到6.22 lgCFU/g，而本試驗0.60 g/L ε-PL+0.40 g/L CE復合保鮮劑組，雞毛菜4 ℃貯藏7 d AsA損失量為25.25%，貯藏10 d菌落總數達到5.80 lgCFU/g，說明保鮮效果較好。

a-ε-PL質量濃度對雞毛菜菌落總數的影響；b-ε-PL質量濃度對雞毛菜感官評分的影響；c-ε-PL質量濃度對雞毛菜抗壞血酸含量的影響

2.1.2 CE質量濃度對雞毛菜菌落總數和保鮮效果的影響

CE的主要成分是肉桂醛，具有強抗氧化性和較好的抑菌性[14]。由圖2-a可知，隨著CE質量濃度的增加，雞毛菜中的微生物菌落總數增長速率總體呈現減緩趨勢，其中，0.60～1.0 g/L CE+0.40 g/L ε-PL復合保鮮劑組的菌落總數差別小于4%(以0.60 g/L CE+0.40 g/L ε-PL的數據為參照點)，可見0.60 g/L CE已經達到抑菌平衡濃度。由圖2-b、圖2-c可知，CK組第7天感官評分46.40分，AsA含量下降67.32%，菜葉出現腐爛；單獨使用0.40 g/L ε-PL保鮮劑組在第10天感官評分降低至46.80分，AsA含量下降66.34%，失去商業價值。相比之下，不同質量濃度的CE的添加有效減緩了AsA的損失(P<0.05)，維護了雞毛菜的感官品質。此外，貯存期內，0.60 g/L CE+0.40 g/L ε-PL組的AsA減少量顯著低于其他組(P<0.05)，可見成分較為復雜的CE作用是綜合的，當質量濃度超過一定限度時，保鮮作用反而下降，因此將0.60 g/L CE作為Box-Behnken試驗設計的中心點。

a-CE質量濃度對雞毛菜菌落總數的影響；b-CE質量濃度對雞毛菜感官評分的影響；c-CE質量濃度對雞毛菜抗壞血酸含量的影響

2.1.3 作用時間對雞毛菜菌落總數和保鮮效果的影響

雞毛菜對復合保鮮劑吸收需要時間，如圖3-a～圖3-c所示，復合保鮮劑的作用作用時間越長，雞毛菜微生物菌落總數上升越慢，AsA損失率越低。然而當作用時間超過20 min時，復合保鮮劑組之間的菌落總數、AsA含量和感官評分無顯著差異(P>0.05)。例如：在第13天，作用時間20 min與25 min時菌落總數、AsA含量和感官評分差異僅分別為2.25%、1.75%和3.40分。因此選擇20 min作為Box-Behnken試驗設計的中心點。

a-作用時間對雞毛菜菌落總數的影響；b-作用時間對雞毛菜感官評分的影響；c-作用時間對雞毛菜抗壞血酸含量的影響

2.2 響應面試驗分析

2.2.1 響應面試驗設計方案及結果

根據單因素試驗結果，對CE質量濃度、ε-PL質量濃度以及保鮮劑作用時間進行Box-Behnken試驗，以4 ℃貯藏13 d的雞毛菜的菌落總數(Y1)和AsA含量(Y2)為響應值。Box-Behnken試驗及結果見表3。利用Design-expert 12.0軟件對表3的數據進行分析，得到菌落總數(Y1)的回歸模型為Y1=5.42-0.02A+0.04B+0.04C+0.06AB-0.05AC+0.01BC+0.07A2+0.17B2+0.10C2。AsA含量(Y2)的回歸模型為Y2=50.53+1.04A-1.72B-2.17C+3.85AB-0.71AC-0.20BC-11.48A2-4.99B2-6.26C2。由表4回歸模型的方差分析表明，該回歸模型能夠很好地擬合試驗結果，模型擬合程度良好，可用該模型回歸方程預測雞毛菜保鮮條件的優化。

表3 Box-Behnken試驗設計方案及結果

表4 回歸模型方差分析

2.2.2 響應面優化配方結果與試驗驗證

通過對響應面結果與回歸方程進行分析，菌落總數有最小值，AsA含量有最大值，預測得到雞毛菜最佳保鮮條件，在ε-PL質量濃度0.57 g/L，CE質量濃度0.62 g/L 和作用時間19.01 min條件下，雞毛菜貯藏4 ℃貯存13 d時的菌落總數為5.41 lgCFU/g，AsA含量為50.79 mg/100g。為考察結果的準確性進行驗證試驗，結合實際情況，將作用時間設置為19.00 min，結果顯示雞毛菜在4 ℃貯藏13 d時的菌落總數為5.42 lgCFU/g，AsA含量為50.40 mg/100g，基本符合預期值，即該模型與實際試驗擬合良好，表明響應曲面優化的條件具有較高的可靠性。

2.3 ε-PL復合CE對雞毛菜貯藏品質的影響

考察了ε-PL復合CE的最佳條件(ε-PL質量濃度0.57 g/L、CE質量濃度0.62 g/L和作用時間19.00 min)對雞毛菜品質的影響。由圖4所示，0.57 g/L ε-PL+0.62 g/L CE+19.00 min組保鮮條件下，雞毛菜貯藏13 d后，菌落總數顯著低于單因素時的菌落總數(P<0.05)；同時，雞毛菜的AsA含量僅損失17.00%，葉片鮮綠、基本無褶皺卷曲現象、葉梗硬挺度減少不明顯，感官分數達到83.50分，商業價值良好，突破了單因素貯藏13 d的貯藏極限。

圖4 復合保鮮劑的作用方式對雞毛菜菌落總數、感官評分、抗壞血酸含量的影響

2.4 復合保鮮劑對微生物多樣性的影響

2.4.1 Alpha多樣性分析

添加最優配方復合保鮮劑對雞毛菜貯藏過程中微生物的Alpha多樣性指數的影響見表5。經測定，各組雞毛菜樣品完整性參數覆蓋度均在99%以上，表明測序結果可有效地用于樣品微生物多樣性分析。表5中的Shannon指數和Simpson指數與物種多樣性有關；Shannon指數越大，Simpson指數越小，樣品中微生物多樣性越豐富。

由表5可知，T組第1天的Shannon指數僅為CK組75.77%，表明經過復合保鮮劑處理后，雞毛菜中的部分微生物生長受到抑制，微生物多樣性明顯降低。此外，在1～7 d，CK組和T組試驗的Shannon指數均呈下降趨勢，但CK組降低了36.52%，而T組僅降低了14.86%，表明保鮮劑處理后，并沒有完全抑制各類微生物的生長，但是有效延緩了微生物群落的結構變化。

表5 雞毛菜樣品Alpha多樣性指數

2.4.2 Beta多樣性分析

通過Beta多樣性可以分析不同蔬菜樣品中微生物群落組成的差異性見圖5。CK1與T1的距離遠，表明CK1的微生物群落組成與T1的微生物群落組成差異性強，說明復合保鮮劑的處理使得雞毛菜中微生物菌群結構發生了明顯的變化。CK7與T7，CK7與T13的距離有縮小的趨勢，說明當雞毛菜的品質逐漸下降時，微生物群落結構的差異性也在縮小。

圖5 雞毛菜樣品細菌菌群主成分分析

2.4.3 雞毛菜貯存過程細菌群落組成分析

蔬菜的腐敗與微生物的生長繁殖有重要關系，可通過雞毛菜貯藏期間細菌群落組成的變化探究復合保鮮劑對雞毛菜的作用機制。由圖6可知，CK1樣品中的優勢菌屬包括鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas, 37.06%)、甲基桿菌屬(Methylorubrum, 14.59%)、根瘤菌屬(Rhizobium, 11.52%)；而CK7樣品中的優勢菌屬包括甲基桿菌屬(60.19%)、鞘氨醇單胞菌屬(22.24%)和代爾夫特菌屬(Delftia, 10.57%)，其中甲基桿菌屬顯著上升(P<0.05)。這表明雞毛菜腐敗過程中，甲基桿菌屬的生長繁殖可能是原因之一。T組樣品中表現出同樣的趨勢，甲基桿菌屬占比由T1的21.64%增加至T13的74.48%，進一步闡釋甲基桿菌屬的生長可能與雞毛菜的品質下降相關。文獻報道，雞毛菜中的優勢菌屬均為果蔬常見菌屬[15-20]，其甲基桿菌屬普遍存在于植物葉表[11]，對農作物有重要的生長代謝促進作用[17]。因此ε-聚賴氨酸復合保鮮劑對甲基桿菌屬的生長抑制，有助于減緩其對雞毛菜生理代謝活動的促進作用，進而提升雞毛菜的保鮮效果。

圖6 復合保鮮劑對雞毛菜細菌群落豐度的影響

2.4.4 雞毛菜貯藏品質的相關性分析

雞毛菜貯藏品質的相關性分析見圖7，AsA含量與甲基桿菌屬、黃桿菌屬和泛菌屬呈顯著負相關(P<0.05)，與鞘氨醇單胞菌屬、根瘤菌屬呈顯著正相關(P<0.05)；而菌落總數與鞘氨醇單胞菌屬、根瘤菌屬呈顯著負相關(P<0.05)，與甲基桿菌屬、黃桿菌屬和泛菌屬呈顯著正相關(P<0.05)。相關性分析結果進一步闡釋，甲基桿菌屬的生長繁殖是雞毛菜菌落總數增加的主因，它同時促進了AsA含量的下降。

圖7 雞毛菜貯藏品質的相關性分析

3 結論

本文針對雞毛菜水分含量高、營養豐富，易滋生微生物發生腐敗變質的特征，探究ε-PL復合肉桂提取物對貯藏期雞毛菜品質及微生物的影響。得到結論如下：

(1) 單因素試驗中ε-PL復合肉桂提取物有效減緩了微生物的生長繁殖速度和雞毛菜AsA的損失率，使得對照組貯藏7 d腐敗變質的情況下，復合保鮮劑組仍能保持葉片鮮綠、基本無卷曲的良好感官品質；

(2) 經過響應面試驗配方優化，在復合保鮮劑最佳條件下，雞毛菜貯藏13 d，菌落總數和AsA含量理化指標均顯著優于單因素相應數值(P<0.05)，保障了雞毛菜商業價值，突破了單因素貯藏13 d的貯藏極限；

(3) 微生物多樣性的分析結果表明，ε-PL復合保鮮劑改變了雞毛菜的微生物菌群結構，降低了微生物的多樣性，尤其是降低了與AsA含量顯著負相關的甲基桿菌屬菌的生長繁殖速度，進而解析了復合保鮮劑抑菌保鮮的機制。