三種甘草種子蛋白的提取方法、結構及抗氧化活性比較研究

則拉萊·司瑪依，帕爾哈提·柔孜，吾哈麗妮薩·麥麥提托合提，古麗米熱·阿巴拜克日，鄧杰，楊曉君

(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)

甘草(Glycyrrhiza)屬豆科，多年生草本植物，是一種傳統的補益中草藥，應用較廣泛，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛及調和諸藥等多種功效[1]。烏拉爾甘草、脹果甘草和光果甘草作為藥用甘草植物收載于《中國藥典》。現代醫學研究表明甘草提取物的抗菌、抗病毒及免疫調節等藥理活性對傳染病防治方面具有較好的效果[2]。

2019年12月以來，開始滋蔓各地的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)因其導致的嚴重疾病和死亡引起了全人類的恐慌。通過我國研究發現中藥中針對治療COVID-19的9種中藥組方中均含有甘草成分[3]。研究表明，甘草所含的甘草酸二胺能夠較好地抑制機體的炎性反應，提高免疫功能，對輕度患者具有顯著療效，安全性高，并且能對抗抗病毒西藥導致的肝損傷的不良反應[4]。甘草對艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)和重癥急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)等傳染性重大疾病也有較好的治療效果[5-6]；通過大量的臨床試驗對防治艾滋病的27種單味中藥進行研究，結果顯示，甘草是使用頻率最高的抗病毒中藥制劑，并且具有很強的抑制HIV活性的作用[5]。蒲潔瑩等[6]報道甘草酸能防止SARS冠狀病毒的繁殖，也能阻止其對細胞的侵入。綜上所述，甘草具有多種藥效，并且不斷在被挖掘，因此，以研究尚未深入的甘草種子為對象，展開一系列探究可為明確其功能成分活性并開發相關抗氧化功能性食品提供參考。

甘草的前期研究大多以根及根莖部位中的甘草酸、黃酮及多糖等成分及其生物活性為主[7]，但有關甘草種子化學成分的研究尚未深入開展，這不僅導致了甘草資源的浪費，而且使有關甘草不同部位活性成分的研究未能更全面。甘草種子含有蛋白、多糖、油脂及其他重要的化學成分，蛋白作為種子類植物富含的成分之一，具有較高的研究價值。目前關于種子蛋白類化合物的提取方法包含了水、乙醇、緩沖液、堿、鹽、酸、酶法提取和堿溶酸沉及超聲波輔助提取等方法[8]，由于不同的提取方法對于不同的樣品發揮的作用并不一致，而選擇最佳提取方法對實驗結果至關重要，因此，需要進行對比篩選。呂凱波等[9]通過超聲波輔助堿溶酸沉法得到的紅花籽粕蛋白提取率和含量最高，分別為26.53% 和51.49 mg/mL，蛋白質中多肽含量也最高，達到6.56 mg/mL，而堿法中得到的游離氨基酸含量較多，為2.14 mg/mL；說明不同的提取方法不僅會影響蛋白提取率及含量，還可能會對蛋白質分子內在結構、分子片段大小及組成造成一定影響。因此，篩選甘草種子蛋白的最佳提取方法，對其擁有更高的開發價值和應用前景有著十分重要的意義。

植物蛋白是一種天然的抗氧化物質，具有抗氧化，抗過敏、抗糖尿病、抗癌癥等多種生理功能[10]。目前，有關甘草種子蛋白的研究鮮有報道。從甘草種子中提取蛋白，不僅能提高甘草的附加值，而且可以解決甘草資源浪費的問題，對甘草種子的開發和利用意義重大。本文以3種藥用甘草種子為原料，通過研究水、乙醇、醋酸提取法和堿溶酸沉法及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)提取法等5種方法，以甘草種子蛋白提取率與含量為指標選出最佳提取方法，通過傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)和掃描電鏡圖像(scanning electron microscopy, SEM)分析甘草種子蛋白的結構特征，并通過研究對不同自由基的清除率測定其抗氧化活性，以期望能夠為甘草種子蛋白的深入研究和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用的3種甘草種子均購于新疆庫爾勒。石油醚、醋酸、氫氧化鈉、鐵氰化鉀，天津市鑫鉑特化工有限公司；無水乙醇、濃硫酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，天津市致遠化學制劑有限公司；考馬斯亮藍G-250，上海藍季生物有限公司；磷酸、三氯乙酸、硫酸亞鐵，天津永晟精細化工有限公司；97%牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)，北京索萊寶科技有限公司；DPPH試劑，上海麥克林生物公司；三氯化鐵，天津市盛奧化學試劑有限公司；水楊酸，天津市北聯精細化學品開發有限公司；過氧化氫，成都市科隆化學品有限公司；溴化鉀，北京化工廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA2004 N電子天平，上海箐海儀器有限公司；FW-135高速萬能粉碎機，北京市永光明醫療儀器有限公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器，上海興創科學儀器設備有限公司；SF-TDL-40D離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；LGJ-12真空冷凍干燥機，上海騰方儀器設備有限公司；T6紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 甘草種子蛋白的提取

分別稱取適量3種甘草種子，進行粉碎。將甘草種子粉末與石油醚按1∶10(g∶mL)的比例置搖床中振搖3 h后，重復3次、進行抽濾；將脫脂后的粉末置于通風處室溫下干燥12 h后，再次過篩，隨后置于4 ℃保存備用。具體見圖1。

圖1 甘草種子水提蛋白

1.3.1.1 水提法

分別稱取3種脫脂粉末各5 g，放入圓底燒瓶內，加入蒸餾水100 mL[料液比為1∶20 (g∶mL)]，40 ℃下磁力攪拌提取2 h、過濾、離心，旋蒸濃縮、凍干，得到甘草種子蛋白。

1.3.1.2 乙醇提取法

分別稱取3種脫脂粉末各3 g，放入圓底燒瓶內，加入95%(體積分數)乙醇60 mL[料液比為1∶20(g∶mL)]，40 ℃下磁力攪拌提取2 h、過濾、離心，旋蒸濃縮、凍干，得到甘草種子蛋白。

1.3.1.3 醋酸提取法

分別稱取3種脫脂粉末各3 g，置圓底燒瓶中，加入20%(體積分數)醋酸60 mL(1∶20，g∶mL)，40 ℃下磁力攪拌提取2 h、過濾、離心，旋蒸濃縮、凍干，得到甘草種子蛋白。

1.3.1.4 堿溶酸沉法

分別稱取3種脫脂粉末各2 g，放入錐形瓶內，加入40 mL氫氧化鈉溶液(pH 10)，室溫靜置2 h、濃縮，將濃縮液置于錐形瓶中加入40 mL硫酸溶液(pH 4)室溫靜置1 h、離心、旋蒸、凍干，得到甘草種子蛋白。

1.3.1.5 磷酸鹽緩沖液

分別稱取3種脫脂粉末各2 g，置錐形瓶中，加入40 mL PBS溶液(0.2 mol/L，pH 8)，室溫靜置2 h、離心、濃縮、凍干，得到甘草種子蛋白。

采用上述的不同方法提取3種甘草種子蛋白，并按照公式(1)計算蛋白提取率:

(1)

1.3.2 甘草種子蛋白含量的測定

1.3.2.1 標準蛋白溶液配制

稱取10 mg BSA標準品，定容至10 mL，配制1.0 mg/mL標準蛋白溶液，置4 ℃冰箱存放。

1.3.2.2 考馬斯亮藍的配制

精確稱取100 mg考馬斯亮藍，加入50 mL 95%(體積分數)的乙醇進行溶解，再倒入100 mL 85%(體積分數)的磷酸，并加入蒸餾水至1 000 mL定容，備用。

1.3.2.3 繪制標準曲線

將配制好的標準蛋白溶液稀釋成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mg/mL等不同質量濃度，每管加1 mL蛋白溶液和3.0 mL考馬斯亮藍溶液后立即搖勻，避光放置5 min后在595 nm處測定其吸光值。以質量濃度作為橫坐標，以質量吸光值作為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3 樣品中蛋白含量的測定

取10 mg甘草種子蛋白，加10 mL蒸餾水溶解，配制質量濃度為1 mg/mL的母液，離心、上清液加蒸餾水稀釋成不同倍數的待測液、按照上述的方法分別測定其吸光值。

1.3.4 傅里葉紅外光譜掃描

將水提法所得蛋白樣品采用溴化鉀壓片法制樣，用紅外光譜儀檢測其在4 000～400 cm-1的紅外吸收光譜。

1.3.5 掃描電鏡分析

取適量3種甘草種子蛋白粉末于樣品臺上，使用離子濺射儀在其表面鍍一層導電膜，在5.0 kV電壓下分別放大500和1 000倍觀察其表面形態，利用X-射線能譜儀測定蛋白樣品表面元素含量。

1.3.6 抗氧化活性測定[11]

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力

分別準確取2 mL質量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液，再加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液于試管中，室溫避光反應30 min，在517 nm處測吸光值，平行測定3次。清除率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A0、A1、A2分別代表空白組、樣品組、對照組的吸光度。

1.3.6.2 羥自由基清除能力

分別準確取1.0 mL質量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液，依次均加入1.0 mL 6 mmol/L 的硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇溶液和雙氧水。在37 ℃條件下反應30 min后，510 nm處測吸光值，平行測定3次。清除率計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0、A1、A2分別代表空白組、樣品組、對照組的吸光度。

1.3.6.3 總還原能力的測定

分別準確取0.8 mL質量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液，再加入0.4 mL PBS 和10 g/L的鐵氰化鉀水溶液，于50 ℃條件下放置20 min，降至室溫，再加入0.4 mL 10 g/L的三氯乙酸水溶液、1.6 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1 g/L的三氯化鐵水溶液，室溫靜止10 min后在700 nm處測吸光值。

1.4 統計學研究

通過Origin 2019和SPSS 26對數據進行繪圖和處理。每次試驗設置3個平行實驗，數據以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 甘草種子蛋白提取率

由表1可知，提取方法對蛋白提取率及含量影響較大，且不同提取方法得到的3種甘草種子蛋白提取率均存在顯著差異，水提法所得的3種蛋白的提取率顯著高于其他方法(P<0.01)，分別為19.14%、23.93%、22.60%，說明水溶液可充分溶出樣品中的蛋白成分；醋酸和PBS提取的蛋白提取率次之，為10.65%～9.62%，對蛋白質的溶解度也較高；而剩余兩種方法的提取率較低，為8.61%～4.04%，其中乙醇溶液的提取效果最不理想，可能是因為本實驗使用了95%乙醇，高濃度有機溶劑使蛋白失活，導致此次實驗結果并不理想。

表1 甘草種子蛋白提取率

2.2 甘草種子蛋白含量

由表2可知，5種提取方法提取的3種甘草種子蛋白含量也存在一定的差異，其中水提取的各樣品蛋白含量均為最高，分別為36.54、30.80、30.12 mg/mL，顯著高于其他方法所得蛋白(P<0.01)；乙醇和PBS提取的蛋白含量次之，為30.04～25.57 mg/mL；而堿溶酸沉和醋酸溶液提取的蛋白含量相對較低，為25.90～20.01 mg/mL。

表2 甘草種子蛋白含量

通過比較不同提取方法可知，就蛋白提取率和含量而言，水提法提取率及含量均較高，說明水溶液能夠使甘草種子蛋白充分溶出。因此，最終選擇水提法作為甘草種子蛋白提取工藝，并后期將對它進行進一步優化。

2.3 紅外光譜分析

GUSP-烏拉爾甘草種子蛋白；GISP-脹果甘草種子蛋白；GGSP-光果甘草種子蛋白

表3 甘草種子蛋白紅外光譜峰位及解析

3.4 掃描電鏡圖像分析

可通過SEM對蛋白樣品進行清晰地定位分析，從而可觀察其微觀形貌結構特征，蛋白質的微觀結構反映了其分子的聚集情況，能夠影響甚至決定蛋白質的功能性質。由圖3-A可知，烏拉爾甘草種子蛋白主要呈現出不規則的片狀和纖維狀聚集碎裂和疏松的結構狀態，說明蛋白質原有的纖維結構基本沒有遭到損壞。圖3-B顯示脹果甘草種子蛋白呈現出表面光滑的片狀和棒狀結構狀態，且其厚薄較均勻，明顯保持了較完整的結構。如圖3-C所示，光果甘草種子蛋白呈現出不規則的棒狀和片狀及球狀結構狀態，且存在少量大小不一的微孔，說明蛋白質結構有部分被改變，但蛋白質整體結構仍較為完整。綜上所述，水提法提取的甘草種子蛋白保留了較完整的結構，擁有較廣泛的應用領域。

A-烏拉爾甘草種子蛋白；B-脹果甘草種子蛋白；C-光果甘草種子蛋白

表面元素組成的結果如表4所示，3種甘草種子蛋白均含有一定含量的氮和磷元素，此外，脹果甘草種子蛋白還含有少量硅元素；其中，磷是參與骨代謝和組成骨骼中無機鹽成分的主要元素，能夠維持骨骼和牙齒的健康[14]。

表4 甘草種子蛋白元素分析表

2.5 甘草種子抗氧化活性

2.6.1 DPPH自由基清除能力

DPPH是一種具有很強穩定性的自由基，其存在孤對電子，一旦遇到抗氧化劑，因孤對電子與抗氧化劑進行配對，會使其顏色變淺，光譜吸收減少，因此，根據DPPH自由基的含量變化可以判斷物質的抗氧化能力。

由圖4可知，3種甘草種子蛋白質量濃度與其清除率呈明顯的正相關關系。其中，烏拉爾甘草種子蛋白的清除作用稍強于其余2個品種(P<0.01)，在質量濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率可達到92.37%；脹果甘草次之，而光果甘草為最低，在相同質量濃度下，兩者對DPPH自由基的清除率分別為82.78%和72.91%。通過計算得出3種樣品的IC50分別為0.37、0.47、0.61 mg/mL，這說明3種樣品均有較強的清除DPPH自由基能力。

圖4 DPPH自由基清除率

2.6.2 羥自由基清除能力

羥自由基清除能力，是指具有提供氫質子能力的抗氧化劑能夠還原高度氧化的羥自由基，從而阻止自由基的連鎖反應的能力。由圖5可知，3種甘草種子蛋白對羥自由基的清除能力隨著樣品質量濃度的增加而顯著提高(P<0.01)。在質量濃度為1.0 mg/mL時，3種樣品對羥自由基的清除率從高到低的排序為：烏拉爾甘草種子、脹果甘草種子、光果甘草種子；其清除率分別為77.30%、70.01%、65.81%。通過計算得出3種樣品的IC50依次為0.51、0.92、0.77 mg/mL，由此推測，3種甘草種子蛋白均具有較強的供氫能力。

圖5 羥自由基清除率

2.6.3 總還原能力

3種甘草種子蛋白均有一定的還原能力(圖6)。其中，當樣品質量濃度達到1.0 mg/mL時，烏拉爾甘草種子蛋白的還原能力稍強于其余2個品種，可達到2.344，而脹果甘草和光果甘草間差異并不顯著，在相同質量濃度下兩者總還原能力分別為2.012和1.998。說明3種甘草種子都擁有良好的還原能力。通過抗氧化測定結果得知，3種甘草種子蛋白均具備了較好的清除自由基的能力和總還原能力，是一種潛在的抗氧化劑，可在醫藥、食品和化妝品等領域中發揮作用。

圖6 總還原能力

3 討論與結論

3.1 討論

3.1.1 提取率及含量

豆科植物作為一種理想的優質植物蛋白質來源，已普遍被大眾食用，其中被譽為“黃金豆”的鷹嘴豆更是具有低過敏性、高生物效價等優點，并且其蛋白質提取率高達82.33%[15]。陳曉萌等[16]對2種紅蕓豆的蛋白含量進行了測定，發現其可溶性蛋白提取率與含量均為最高，分別為57.65%、66.81%和74.08%、66.50%。而蕓豆籽的蛋白含量為20%～30%[17]，較接近于甘草種子蛋白。以往的研究表明，甘草的根、莖和葉子部位均含有豐富的蛋白質。丁原全等[18]測得甘草根莖中氨基酸種類多達18種，其中人體必需氨基酸含量達到62.87 mg/mL，證明甘草是一種優質蛋白資源。本實驗通過水提法提取的3種甘草種子蛋白提取率最高可達19.14%、23.93%、22.60%，相對應的蛋白含量為36.54、30.80、30.12 mg/mL，雖然其蛋白提取率與含量均沒有大部分豆科植物高，但其營養價值絕對不容小覷。由此推斷，甘草種子有望作為一種優質蛋白質來源，代替甘草根入藥，來實現充分利用甘草各個部位，節省甘草資源，進而實現變廢為寶。

3.1.2 結構

蛋白質是由氨基酸經肽鍵連接而成的生物大分子，其結構能夠反映其分子的聚集情況，能夠影響甚至決定蛋白質的功能性質。黑蕓豆蛋白在紅外光譜掃描下表現出幾個特征峰，包括3 278.63 cm-1處的酰胺 A 帶、1 634.31 cm-1處的酰胺Ⅰ帶和1 519.76 cm-1處的酰胺 Ⅱ 帶[19]。李婷等[20]通過掃描電鏡觀察花生粕4種蛋白發現，在2 000 倍下4種蛋白結構具有顯著差異；清蛋白表面存在棱狀突起和孔隙；球蛋白表面不平整，無多孔結構；醇溶蛋白表面高度不均勻，呈球狀，連接緊密。本實驗根據分析3種甘草種子蛋白的紅外光譜掃描圖得知，3種樣品均在1 640～1 660 cm-1處有吸收峰，其中烏拉爾甘草種子蛋白的吸收峰在1 637 cm-1處，歸屬于β-折疊，而脹果甘草和光果甘草種子蛋白的吸收峰分別在1 654 和1 664 cm-1處，說明均具有α-螺旋結構。通過觀察3種甘草種子蛋白在500和1 000倍放大的掃描電鏡圖得知，烏拉爾甘草種子蛋白主要呈現出不規則的片狀和纖維狀聚集碎裂和疏松的結構狀態；脹果甘草種子蛋白呈現出表面光滑的片狀和棒狀結構狀態，且其厚薄較均勻；光果甘草種子蛋白呈現出不規則的棒狀和片狀及球狀結構狀態，且存在少量大小不一的微孔。綜上所述，水提法提取的甘草種子蛋白與一些豆科植物有著相似的結構，因此也可能擁有一致的生物活性。

3.1.3 抗氧化

豆類因含有豐富的蛋白質成分被認為是天然抗氧化劑的來源，豆類蛋白質構成了世界上大多數地區人們飲食中不可或缺的部分，為促進機體健康付出的貢獻不容忽視。曲柳青等[21]對英國紅蕓豆蛋白進行水解，得到的抗氧化肽對DPPH自由基和羥自由基均有較高的抑制效果，分別為215.31和181.59 U/mg。以往的研究結果證明，甘草多糖也擁有較高的抗氧化能力。柴美靈等[22]通過利用超聲輔助水提法從烏拉爾甘草根中提取多糖，發現其對DPPH自由基有一定的清除作用，其IC50為2.80 mg/mL。MUTAILLIFU等[23]以光果甘草根為研究對象，發現其多糖對DPPH自由基有較強的清除效果，樣品質量濃度為1.0 mg/mL時，其清除活性為約83%，并且在多糖質量濃度為2 mg/mL時，對羥自由基的清除率為24.1%。此外，最新研究發現3種甘草籽多糖的體外抗氧化活性均高于其根部多糖，并且與蛋白質結合的多糖可以增強分子的負電荷，能夠更好地穩定自由基，抑制氧化反應[24]。本實驗研究的甘草種子蛋白體外抗氧化活性結果顯示，3種蛋白樣品均有較好的自由基清除能力與還原能力，當樣品質量濃度為1.0 mg/mL時，烏拉爾甘草種子蛋白對DPPH自由基、羥自由基的清除能力與總還原能力均為最高，分別為92.37%、77.30%和2.344；IC50分別為0.37和0.51 mg/mL。根據上述數據推斷，甘草種子蛋白對自由基可能有更強的清除效果，對此還需進行更深入的研究比較來驗證。此外，紫花蕓豆蛋白的羥自由基清除率和總還原能力分別為23.96%和0.280 5[25]。因此，可以判斷甘草種子具有較強的的體外抗氧化活性，并且甘草種子蛋白的體外抗氧化活性可能比部分豆科植物蛋白更高。

3.2 結論

本研究對3種甘草種子蛋白的最佳提取方法、結構和抗氧化能力進行了研究和比較。結果表明，水提法得到的蛋白提取率與含量均為最高，提取率分別為19.14%、23.93%、22.60%，含量分別為36.54、30.80、30.12 mg/mL；3種蛋白的紅外光譜都較為相似，均顯出了典型的蛋白吸收峰，其中烏拉爾甘草種子蛋白具有β-折疊結構，而脹果甘草和光果甘草種子蛋白具有α-螺旋結構。掃描電鏡圖像結果顯示，3種蛋白呈現出不同的結構狀態，但均保留了較完整的結構。此外，所有蛋白均對DPPH自由基和羥自由基有較強的清除能力以及總還原能力。由此可見，甘草種子蛋白具有較好的抗氧化能力，研究結果可為甘草種子蛋白的進一步探究和利用及甘草新型蛋白資源的開發提供參考依據。