花生致敏蛋白及其檢測方法研究進展

王成賓，胡驍飛，孫亞寧，邢云瑞，龐杏豪，王琳，吳佳蓓，王耀

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南省食品綠色加工與質量安全控制國際聯合實驗室，河南 洛陽，471023)2(河南省農業科學院, 動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州，450002)

花生是重要的經濟作物，約含有50%的脂肪，25%～30%的蛋白質，10%～13%的碳水化合物，以及微量的維生素B1、維生素B6等天然營養物質，被認為是煙酸、維生素E的良好來源，有著“長生果”的美譽。研究表明，攝入這些營養物質對健康有廣泛的益處，如降低患癌癥的風險、促進心臟健康、保持認知和思維能力等[1-2]。對于大多數人來說，花生攝入量的增加可以被認為是一種營養優勢。然而，對于花生過敏患者來說，食用含有未標識花生成分的食品會造成嚴重的過敏反應。根據聯合國糧農組織(Food and Agriculture Organization, FAO)的最新統計，花生被認定為最嚴重的食物致敏物之一[3]，其引起的過敏占食品過敏總量的7%～20%[4]。與其他食物過敏對比，花生導致的過敏癥狀極其嚴重，極低的攝入量就能引發過敏反應，可導致消化系統、呼吸系統、皮膚等損傷，甚至引起過敏性休克危及生命[5]。而且花生過敏人群大多數是終身的，只有10%的過敏人群可能會隨年齡的增長產生耐受，花生過敏不僅造成過敏患者健康損害，還嚴重影響個人及其家庭的生活質量。

目前，針對花生過敏尚缺乏準確的治療方案[6]，對致敏成分進行準確標識、避免食用致敏食品仍是保障過敏患者食品安全的主要途徑。美國、歐盟發達國家和地區制定了相關法律法規，嚴格規定預包裝食品和配料標簽必須標示致敏成分。2018年我國對《食品安全國家標準預包裝食品標簽通則》(GB 7718)修訂草案進行征求意見，該草案中將致敏物質標示由推薦性條款變為強制性條款。因此，為更好地保障廣大消費者的身體健康，減少花生過敏可能造成的危害,本文分別從蛋白質和DNA水平對花生致敏蛋白檢測方法進行歸納分析，對深入研究花生致敏蛋白的檢測方法和預防花生過敏具有重要參考價值。

1 花生致敏蛋白

根據國際免疫學聯合會過敏原命名委員會(International Union of Immunological Societies, IUIS)公布的最新數據，共有18種花生致敏蛋白(Ara h l～Ara h 18)已被認可[7]。其中大多是種子貯藏蛋白，糖基化程度非常高，分子質量為0.7～100 kDa(表1)[8]。Ara h l是分子質量為64 kDa的糖蛋白，占花生總蛋白量的12%～16%，通過分析發現此類蛋白為花生中含量最高的致敏蛋白，且多數過敏患者的血清能成功識別[9]。相關學者通過實驗表明，在天然狀態下Ara h l主要以水溶性蛋白的形式存在，具有高度穩定的三聚體結構(圖1)[10]。Ara h 2占花生總蛋白量的5.9%～9.3%，含有8個半胱氨酸殘基，可以形成較多的二硫鍵，使其在100 ℃的高溫下仍能保持結構穩定且抗酶解[11]。通過與大豆進行高度對比發現，Ara h 3的序列與大豆球蛋白具有一定的相似性，分子結構都具有較強的的穩定性[12]。90%以上過敏患者的血清能識別Ara h l和Ara h 2，而Ara h 3在亞洲、歐洲及美洲只有50%過敏患者的血清能準確識別。此外，只有極少數過敏患者的血清能識別Ara h 4～Ara h 17致敏蛋白，由于目前與之相關的研究相對較少，因此并沒有對其做進一步的了解。需要強調的是，Ara h 4的特殊性已經不像過去那么凸顯，其實質上為Ara h 3.02[13]。Ara h 5蛋白廣泛存在于各類真核細胞內，但研究表明這種蛋白在花生中的含量極低，難以大量獲得其純品[14]；Ara h 6和Ara h 7在花生中含量都相對較低，其中Ara h 6約占花生總蛋白的4.5%；分別將Ara h 6、Ara h 7與Ara h 2的氨基酸序列進行分析，發現二者序列的同源性高達59%和35%，還具備較強的熱穩定性[15-16]；Ara h 8在烘烤和胃消化等條件下很不穩定，由此分析可知其熱穩定性較差[17]；Ara h 9是一類具有較強熱穩定性的非特異性脂轉運蛋白[18]；Ara h 10、Ara h 11主要存在于花生的油脂中，因此被稱為油脂蛋白。Ara h 12的分子質量有8、12、5.184 kDa 3種，同樣Ara h 13的分子質量也有8、11、5.472 kDa 3種，均屬于防御素[19]。

圖1 花生主要致敏蛋白的空間結構[20-22]

表1 花生致敏蛋白

2 致敏機制

食物過敏是特殊人群對某些食物或成分產生的不良免疫反應，包括免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介導、非IgE介導或兩者的結合。然而花生過敏本身是IgE介導產生的超敏反應，主要是I型超敏反應機制。對于過敏個體而言，致敏原通過樹突狀細胞呈現給T細胞，異常激活Th2型效應T細胞進行轉化產生IgE，與組織中的肥大細胞和嗜堿性粒細胞膜表面上的FcεRI受體結合[23-24]。當再次接觸這種致敏原時發生脫顆粒反應，激活肥大細胞和嗜堿粒細胞并釋放組織胺、白三烯、血小板活化因子等生物活性介質，對效應組織和器官造成影響，引起各種臨床過敏的癥狀，如節律紊亂，急性蕁麻疹，過敏性休克、死亡等[25-26]，IgE介異的過敏機制如圖2所示[27]。

圖2 IgE介導的過敏機制[27]

3 致敏蛋白的檢測方法

目前，主要從兩個層面進行檢測：一是基于蛋白質水平的檢測方法，如放射性免疫分析法(radio immuno assay，RIA)、免疫印跡(immunoblotting，IB)[28]、酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[29]、高效液相色譜分析法(HPLC)[30]以及質譜分析法(MS)[31]。RIA和IB只能得到定性或半定量結果，而ELISA是定量方法，雖然ELISA精密度高、操作簡單，但目前僅用于常規食品分析。二是基于DNA水平的檢測方法，其中聚合酶鏈式反應(PCR)[32]可用于特定DNA片段的擴增，實時熒光定量(real-time polymerase chain reaction，RT PCR)[33]對待測樣品的特定DNA序列進行分析即可獲得準確的定量結果，環介導等溫擴增反應(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[34]即可通過肉眼觀察白色沉淀或綠色熒光就能判斷結果，不需要繁瑣的電泳和紫外鑒定。

由于食品中花生致敏蛋白種類及含量較多，復雜的加工過程可能會不同程度地影響DNA和蛋白質[35]。因此，在實際應用中，方法的選擇主要取決于所涉及的食品(特定抗體、DNA引物的可用性和可達到的檢測限)以及加工歷史。

3.1 基于蛋白質水平的檢測方法

3.1.1 RIA

RIA用放射性同位素標記花生致敏蛋白，同時與未標記的花生致敏蛋白競爭結合一定量的特異性抗體，通過測量放射性同位素的含量間接計算花生致敏蛋白的量[36]。

DAVOUDZADEH等[37]通過Turbo-MPTM類型的免疫分析設備對包含花生致敏蛋白的十三類食源性致敏蛋白IgE進行定量檢測，證明了Turbo-MPTM類型的免疫分析設備進行定量檢測的可重復性，所產生的數據可通過Pharmacia Uni CAP系統進行讀取，克服了傳統放射性免疫分析設備數據交互性能低的缺點。盡管放射性免疫分析法具備靈敏度高和特異性強等優點，但也存在放射性污染的可能。因此在具體應用中必須具有官方允許以及有效預防措施，以確保實驗的安全性和準確性。

3.1.2 IB

IB是一種常用的蛋白質免疫分析方法，先根據分子質量分離相關蛋白質，通過具體方式把分離的蛋白質固定到相關的固相載體上，隨后將抗體當作“探針”對相關蛋白質進行檢測，最終用標記的二抗進行“顯色”處理。

YAPO-CREZOIT等[38]采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質印跡法，分析兩份花生種子的蛋白質圖譜。在花生種子的浸提物中，檢測出致敏蛋白Ara h 1(63.5 kDa)、Ara h 2(17、20 kDa)和Ara h 3(25、36、40、44 kDa)的可見指紋，以及約36 kDa的Ara h 3致敏帶，有效證明花生致敏蛋白的存在。詹少德[39]以分離得到的高純度Ara h 2和溴化氫活化的Sepharose-4B柱材作為親和介質材料，制備了從兔抗Ara h 2血清中分離純化抗Ara h 2多克隆抗體的親和層析柱，并采用免疫印跡技術進行鑒定。結果顯示，純化后得到的天然Ara h 2純度高達90%，其多克隆抗體效價高，特異性強。雖然免疫印跡法具備分辨率高、特異性強、靈敏度高等特點，但在實驗中易出現雜帶或凝膠染色不勻的現象，影響實驗精準度。因此，免疫印跡手段被廣泛運用于相關致敏蛋白的定性分析。

3.1.3 ELISA

ELISA將酶促反應的敏感性和抗原-抗體反應的高特異性進行結合，是一種常見的定量免疫學檢測手段[40]，可以分為夾心法、間接法和競爭法，常采用雙抗夾心法和競爭法對花生致敏蛋白進行檢測。

PENG等[41]采用單抗為捕獲抗體和檢測抗體，并對檢測抗體進行HRP標記，建立了Ara h 2夾心ELISA檢測方法，測得檢測限為0.02 ng/mL。MONTSERRAT等[42]創建了不同的ELISA方法對花生致敏蛋白展開檢測，實驗表明競爭ELISA敏感性優于夾心ELISA。JANSSENDUIJGHUIJSEN等[43]采用雙單抗夾心ELISA法研究食用花生對受試者血清致敏蛋白的影響，在受試者的血清和體外檢測均檢測到Ara h 6，這為雙單抗夾心ELISA法檢測食品中的花生致敏蛋白提供了一定的參考方向。陳獻雄等[44]利用雙單克隆夾心法對Ara h l進行檢測，測得檢測限為5 ng/mL，線性范圍為5～80 ng/mL，并同時能對10種含有花生成分的食品進行檢測，得出的結果與其包裝上標注的基本一致，因此可用于定性檢測食品中花生致敏蛋白。從免疫學檢測的方面來看，ELISA是一項最為重要且應用廣泛的技術。由于利用較高活性的酶反應以及抗原-抗體的結構互補，在某種程度上來說能夠使反應結果更為清晰，從而有效優化靈敏度和針對性。然而，ELISA方法的不足在于其特異性取決于抗原的制備，這限制了其應用范圍，有待改進。

3.1.4 LC-MS/MS

LC-MS/MS將定性和分離兩類功能進行了實際結合，能良好地進行定量及定性分析；同時對樣品前處理進行了具體簡化，能對相關樣品進行迅速檢測且實際操作也比較簡易，在蛋白質鑒定方面有著寬泛的使用前景。

PILOLLI等[45]開發了一種基于超聲波輔助溶劑萃取的尺寸排阻色譜柱的樣品處理程序，整合多維色譜分析系統，建立了一種簡單有效的分析方法，最后通過選擇反應檢測掃描分析法從復雜底物中識別出花生致敏蛋白。此外，在線固相萃取的使用可以在傳統的反相分離之前，對部分目標肽段進行富集與純化，這為最終的選擇反應檢測建立了一定的優勢，在獲得較高靈敏度的同時仍能保持合理的運行時間。DALY等[46]采用質譜法對花生和杏仁ELISA試劑盒的檢測結果進行驗證，發現交叉反應是杏仁ELISA檢測結果呈現陽性的主要原因。此方法成功彌補ELISA假陽性問題且更為可靠，具有實際應用價值。洪宇偉等[47]采用LC-MS/MS對花生蛋白中的Ara h 2類致敏蛋白進行檢測，測得檢測限為6.23 μg/g，回收率數值處于1.07～1.132。然而該方法對樣品、實際操作要求較高且儀器較為昂貴，所以在實際運用一般都會受到限制。

3.2 基于DNA水平的檢測方法

3.2.1 PCR

PCR是DNA檢測中最常用的技術，其原理是在引物和TaqDNA聚合酶的作用下延伸DNA子鏈，使DNA模板實現指數級擴增，再通過瓊脂凝膠電泳和熒光檢測技術對擴增目標片段進行分析。

JAMES等[48]針對花生葉綠體tRNA基因中tml區域，通過PCR技術完成引物的設計，獲得642 bp的片段，由此將原料所含的花生致敏成分準確檢出，并進一步探究多重PCR對谷物致敏蛋白進行檢測的應用前景。HOUHOULA等[49]利用PCR技術檢測152份食品樣品，共檢出125份陽性花生樣品，占樣品總數的83%。雖然PCR也是對花生致敏蛋白進行定量分析的檢測技術，能夠在食品致敏蛋白的相關檢驗中得到廣泛應用，但是引物設計所受干擾因素較多，例如引物長度不夠會產生假陽性結果；而一旦DNA出現降解，檢測環節會存在較高的污染風險，出現假陰性的現象。因此，PCR在花生致敏蛋白的檢測與應用中存在一定的局限性。

3.2.2 RT-PCR

RT-PCR是在定性PCR技術的基礎上發展起來的DNA定量技術，將具有相應熒光作用的基團添加到PCR反應體系中，利用熒光信號的累積實時監測整個PCR過程，最后通過標準曲線對檢測物質進行定量分析。常用的熒光標記法主要有SYBR Green I類熒光染料以及TaqMan類探針。

陳家杰等[50]針對花生致敏蛋白Ara h 1基因的DNA序列，分別設計兩對特異性引物，建立SYBR Green I熒光實時定量PCR方法，對8種食品樣品進行檢測，檢測結果均與標注的食物致敏蛋白內容一致。蘭海鷗[51]建立了花生致敏蛋白基因(Ara h 1)的TaqMan探針快速檢測方法，主要針對特異性片段(Ara h 1自身DNA序列)進行引物的實際設計，八類花生產品實際檢測結論和包裝標注的實際成分完全一樣，表明其可以運用到花生產品致敏蛋白Ara h 1的實際檢測環節。近年來，實時熒光聚合酶鏈反應的特異、快速、高效等優點被科研工作者所熟知。但花生產品的部分致敏蛋白在加工環節有效去除后，基因檢測結果依舊呈現陽性，如何避免檢測結果的假陽性將成為該方法進一步研究的方向[52]。

3.2.3 LAMP

PCR需要熱循環過程，通常整個擴增過程需要1～2 h。近年來，為克服PCR方法在檢測時間上的局限性，人們開發了幾種等溫擴增方法，其中LAMP最為常見。為實現高特異性，該法采用識別保守序列DNA的6個特異性片段的4條引物和1種鏈置換DNA聚合酶，在65 ℃左右使鏈置換DNA的合成不停地自我循環[53]。

SHEU等[54]利用兩組特異性LAMP引物分別針對花生核糖體DNA序列區的Ara h 1基因序列和內部轉錄序列1(ITS1)，60～65 ℃條件下進行60 min的擴增反應，用于檢測加工食品或膳食中的花生成分。結果表明，LAMP對花生的檢測靈敏度高于傳統PCR，靶向ITS1的敏感性優于靶向Ara h 1基因。YUAN等[55]將LAMP與微流控芯片集成，利用NeuRed染料建立了一種檢測花生致敏蛋白基因的比色方法。在LAMP反應過程中，產生大量的氫離子，溶液逐漸變酸，使得顏色發生變化，反之則保持原來的顏色。但由于反應體系中含有緩沖液，pH的變化不夠明顯。這也許可以解釋為什么建立的LAMP體系的靈敏度沒有PCR體系高。盡管如此，這種方法還是很方便的，可以用肉眼來區分結果。

4 總結與展望

由于食物過敏反應在人群中的發生率呈現出逐年上升的態勢，食物過敏已成為全球頗受關注的食品安全問題。目前，預防食物過敏最有效的應對方法是避免食用含致敏蛋白的食物，然而花生已經被廣泛應用到各類食品當中，而我國強制要求食物標簽標注致敏成分的制度還不完善，因此這種方式難以實現。針對這種情況，加強對食物中致敏蛋白的檢測，對減少食物過敏事件的發生顯得至關重要。本文分別從蛋白質和DNA水平對花生致敏蛋白的多種檢測方法進行了綜述，并分析比較這些方法在花生致敏蛋白檢測中的優缺點(圖3)。

圖3 花生致敏蛋白檢測技術基本原理及優缺點

近年來，基于蛋白質的檢測方法在花生致敏蛋白檢測中發揮了特別重要的作用，并展現出較高的靈敏度和較強的特異性。隨著科學技術的進步，新材料、新技術的不斷涌現，食品致敏蛋白檢測方法越來越豐富。從傳統經驗判斷到儀器檢測，從生化分析到分子鑒定，方法的準確性、靈敏度和穩定性也越來越高，蛋白質組、代謝組、基因組等基于組學的檢測方法將成為檢測致敏蛋白的新一代技術手段。針對標簽符合真偽鑒定、摻兌物檢測等核心問題，應構建從定性判別到精準定量分析、從單物種單目標識別到多物種多目標多元高通量識別、從多組分到全組分分析的致敏蛋白檢測體系，深入對致敏蛋白檢測方法的研究。