基于酶的電化學生物傳感器在食品檢測中應用的研究進展

饒鈞玥，吳任之，曹蕓榕，楊茂杰，韓國全

(四川農業大學 食品學院,食品加工與安全研究所，四川 雅安，625014)

全球社會風險之一便是由糧食危機引起的大面積饑餓致死問題和營養不良現象，食品工業在提供食品和食物營養方面起著至關重要的作用[1]。因此，食品工業需要開發更高效、可持續的食品生產流程，減少對原料的浪費，同時還需要保證更高質量的食品質量。目前食品工業包括發酵、生物轉化和下游加工等多種加工技術[2-3]，這些過程通常自動化程度高，可通過實時監測生化反應產物來保證食品質量。通過氣相色譜法、液相色譜串聯質譜法及近紅外光譜分析技術等可對食品生產加工過程進行監測，但這些分析方法設備昂貴，檢測步驟繁瑣，操作要求較高，無法在工業中大規模使用。此外，復雜化合物質的檢測需要更具選擇性和特異性的分析方法[3]。在此基礎下，生物傳感器脫穎而出。生物傳感器具有器型小巧、靈敏高效、操作簡單以及特異性強等特點，是進行食品生產加工過程的監控和產品質量檢測以及成分鑒定的一種既高效又經濟實惠的方式。

此外，食品加工過程中不可避免的會伴有食品污染，根據食品中有害物質的特性進行檢測，是保證食品安全的有效方法。食品檢驗檢疫方法一般分為物理學檢測技術和生物學檢測技術，前者通常采用儀器進行檢驗，設備造價一般比較昂貴。生物傳感器雖然被分類為生物學檢測技術，但生物傳感器涉及生物工程和其他技術，其中電化學生物傳感器更是直接將物理技術與生物技術相結合，具有物理學的高靈敏性、高準確率和生物學的特異選擇性。鑒于電化學生物傳感器在食品生產過程中的實用性，本文討論基于酶的電化學生物傳感器的基本原理及其在食品行業中的應用，并介紹相關最新研究進展，為電化學生物傳感器在食品中的進一步應用提供參考。

1 電化學生物傳感器

根據國際理論與應用化學聯合會對生物傳感器的定義，即利用目標分析物質與酶、免疫制劑、組織、細胞器或全細胞等生物識別元件的特異性生化反應，借助傳感器將生化反應轉換為電、熱、光等各種信號對目標分析物質進行檢測的一類裝置[4]，是一種“自給自足”的集成設備，根據生物傳感器的作用機理，將其分為三類：生物催化基團(酶)、生物親和性基團(抗體、核酸)和微生物基團(微生物)。酶生物傳感器是基于酶的固定化技術發展而來，酶的固定方法主要包括物理吸附、共價結合、包埋和交聯。酶生物傳感器是間接性傳感器，由固定化酶和信號轉換器組成，通過測量在底物消耗或酶反應產物形成過程中發生的質子濃度(H+)、氣體(如CO2、NH3、O2等)的釋放或吸收、光吸收或反射、熱輻射等變化來檢測特定分析物的存在，然后傳感器將這些變化轉換成可測量的信號(電、光或熱信號)[5-6]，通過這些信號間接地測量待測分析物，其中葡萄糖傳感器就是典型的酶生物傳感器(圖1)[7]。

圖1 一種典型生物傳感器的示意圖[7]

電化學生物傳感器具有靈敏度高、結構簡單、易于操作和成本低廉等特點，即使是小型儀器也可以提供非常穩定的電壓/電流源和檢測信號[8]。在電化學生物傳感器中因分析物存在于電極表面、由分析物直接形成電活性物質以及通過將生物識別反應與氧化還原探針或介導酶電極耦合而間接產生的電流、電壓、電阻或表面電荷[5, 9]，都是電化學信號，最常見的傳感器類型有電流法、電導法、電位法和阻抗法。其中電化學阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)是一種在特定系統參數下檢測電極表面分析物相互作用的方法[10]，基于EIS生物傳感器的研究集中在設計適體傳感器和免疫傳感器中[11]，因此在此文中不做討論。通過酶催化底物發生氧化還原反應產生的電子傳遞可以增強電化學信號，并顯著提高電化學生物傳感器的靈敏度。

2 電流生物傳感器在食品檢測中的應用

在電流生物傳感器中，被測信號是由工作電極上的電活性物質(如金、碳、鉑等)通過氧化還原反應產生的電流信號[9]，工作電極表面產生的電流大小與待測分析物濃度呈正比，通過連續監測電流大小對待測物進行定量分析，電流生物傳感器多以酶為識別元件。通常，恒定電位下測量電流稱為安培法；電位在受控變化期間測量電流則稱為伏安法，安培法較伏安法靈敏度更高。根據用于測量生化反應的電子轉移方法，基于酶的電流生物傳感器現已開發三代[12-13]，如圖2所示[14]。第一代酶電極依賴于O2和H2O2的反應變化來轉移電子。第一代酶電極對O2呈現極高的依賴性，為消除這種對氧的依賴產生的消極影響，第二代酶電極將人造電子介體(小分子氧化還原活性分子)引入酶電極中作為酶的活性中心與電極表面間的橋梁。目前，二代酶生物傳感器研究發展較為成熟，是常采用的酶生物傳感器。第三代酶電極基于酶活性中心到電極的直接電子轉移，這種生物傳感器的穩定性和電子轉移速率顯著提高。

圖2 第一代、第二代和第三代電流型酶生物傳感器示意圖[14]

2.1 在葡萄糖檢測中的應用

2.2 在維生素檢測中的應用

維生素是人體維持正常生理功能所必需的微量元素，且只能從食物中獲取，因此維生素含量是某些食品的營養指標之一。目前，利用電流傳感器定量檢測維生素的方法有限，僅有以釀酒酵母為載體的全細胞生物傳感器、利用含硫化合物的電催化絲網印刷電流傳感器和以秋葵為原料質保的納米碳為識別元件的生物傳感器3種[19-21]，都為非酶電化學生物傳感器。KA?AR等[22]結合磁性納米材料和聚合物的優點，將抗壞血酸氧化酶(ascorbate oxidase，AOx)固定在聚L-天冬氨酸[poly-L-aspartic acid，P(L-Asp)]膜上，并用碳納米纖維(carbon nanofiber，CNF)和納米金剛石顆粒(nanodiamond，ND)修飾玻碳電極(glassy carbon electrode，GCE)，設計出電流型L-抗壞血酸生物傳感器，優化L-Asp在CNF-ND/GCE表面的電聚合步驟(圖3)，使該生物傳感器對L-抗壞血酸的定量測定更加準確可靠。在優化條件下，AOx/P(L-Asp)/ND-CNF/GCE生物傳感器對L-抗壞血酸的檢測線性范圍為2.0×10-7～1.8×10-3mol/L，檢測下限為1.0×10-7mol/L，靈敏度為105 μA mmol/(L·cm2)，該生物傳感器已應用于維生素C泡騰片和含抗壞血酸藥粉中L-抗壞血酸的測定，并獲得較好的檢測結果。

圖3 AOx/P(L-Asp)/Nd-CNF/GCE的制備工藝[22]

2.3 在酪胺檢測中的應用

研究表明適量的酪胺可促進新陳代謝，但過量的酪胺可引起心力衰竭、哮喘和蕁麻疹等健康問題，因此監控食品加工過程中酪胺的含量非常重要。采用酪氨酸酶(tyrosinase，Ty)電流型生物傳感器檢測乳制品和發酵飲料中的酪胺含量是一種高效、簡便的分析方法。研究人員以柑橘提取物為還原劑和穩定劑合成納米金顆粒(gold nanoparticles，AuNP)，以AuNP作為介體與聚8-苯胺基-1-萘磺酸一起修飾玻碳電極，將Ty固定在玻碳電極上[23]。在優化后的條件下，該生物傳感器在10～120 μmol/L與酪胺含量呈線性關系，檢測下限為0.71 μmol/L，具有良好的選擇性、長期穩定性和重現性，已成功應用于乳制品和發酵飲料中酪氨酸的測定。對于干酪樣品中酪胺含量的測定，SNCHEZ-PANIAGUA等[24]將Ty固定在磷酸鈣材料上，然后與戊二醛交聯，制備一種酪胺檢測的電化學生物傳感器，并檢測在整個貯藏期內干酪中酪胺含量的變化，其中高達干酪和布里干酪的平均分析回收率分別為(95.5±5.8)%和(96.9±7.5)%，響應時間為6 s。醬油發酵過程中也易產生酪胺，有研究闡述一種新型電流型酪胺生物傳感器用于醬油樣品中酪胺含量的檢測[25]。該生物傳感器將Ty固定在CNFs、殼聚糖(chitosan，CH)、離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate,IL)和AuNP復合膜修飾的玻碳電極上，由于CNFs、AuNP和離子液體的協同作用，Ty/AuNP/CNFS-IL-CH/GCE生物傳感器為酪胺檢測提供了一種準確、高靈敏度和選擇性的酪胺分析方法。該方法的線性工作范圍為2.0×10-7～4.8×10-5mol/L，靈敏度為176.6 μA mmol/L，檢出下限為9.3×10-8mol/L。

2.4 在雙酚A檢測中的應用

雙酚A(bisphenol A，BPA)是一種內分泌干擾物質，常被用作食品和飲料罐內側涂層，還具有致癌的危害。對BPA的快速檢測，WU等[26]將可聚合的丙烯酰化基團附著在Ty的表面(圖4,I)，而Ty分子通過原位聚合(即aTyr)生成聚合物外殼，首次成功制備了具有單一酶分子核和薄聚合物網殼的酪氨酸酶納米膠囊(即nTyr)，并用制備的nTyr代替傳統的天然酪氨酸酶為生物識別元件，構建一種新型電化學納米生物傳感器(圖4,Ⅲ)，該電化學生物傳感器可保持天然Ty原有活性，檢測下限為12 nmol/L，線性范圍為5×10-8～2×10-6mol/L。作用于酚類物質，漆酶的氧化還原酶結構較Ty更穩定，FERNANDES等[27]選擇將還原的石墨烯氧化物/氧化亞鐵納米顆粒(rGO-Fe3O4NPs)的雜化偶合物與CH和漆酶組裝成多層超結構制成電化學生物傳感器。其中CH良好的生物相容性有望提高漆酶的穩定性，而rGO-Fe3O4NPs的協同效應將改善漆酶的電子轉移過程，該生物傳感器在廣泛的BPA濃度范圍內(6×10-1～228×10-1mol/L)提供線性響應，具有高靈敏度[2 080 μA μmol/(L·cm2)]、高檢出限(18 nmol/L)，用于瓶裝水的實際樣品結果證明該法可行，回收率為107%～124%。

圖4 用于雙酚A檢測的nTyr和基于nTyr的生物傳感器的構造圖解[26]

2.5 在L-谷氨酸檢測中的應用

L-谷氨酸(L-glutamic acid，L-Glu)常作為風味增強劑用于食品中，但其安全性仍存在爭議，因此對L-Glu快速且準確的監測是一個重要問題。MENTANA等[28]在低成本的商用一次性絲網印刷鉑電極上研制一種高精度的第一代L-Glu生物傳感器，用于監測食品中L-Glu的含量，保證食品安全。他們通過牛血清白蛋白與戊二醛交聯，將谷氨酸氧化酶固定在絲網印刷的一次性鉑電極上，并用過氧化聚吡咯膜進行修飾，制備出谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase，GLOD)生物傳感器，通過測量O2消耗介導的GLOD催化反應生成H2O2檢測L-Glu的濃度。該生物傳感器的靈敏度為18.3 mA mmol/(L·cm2)，檢測線性范圍為0.005～1.8 mmol/L，檢測下限為5.4 mmol/L，能穩定維持使用50 h，50 h后的信號強度為初始強度的25%。

2.6 在真菌毒素檢測中的應用

食品從生產、運輸、貯藏到食用一系列過程中都要嚴格防止微生物的污染，因此對致病菌以及某些真菌毒素的檢測尤為重要。有研究提出了一種基于黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)抑制乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的生物傳感器檢測黃曲霉毒素的新方法，并以實收橄欖油樣品為例對該方法的適用性進行評價[29]。DAZ NIETO等[30]采用類似方法研發了一種用依靠酶修飾電極的第三代生物傳感器技術定量檢測雜色曲霉毒素(sterigmatocystin，STEH)，該傳感器在6.9×10-9～5.0×10-7mol/L內呈現良好線性關系，檢出限為2.3×10-9mol/L。該法利用具有寬pH范圍熱穩定性的大豆過氧化物酶(soybean peroxidase，SPE)和化學還原的氧化石墨烯的復合物修飾的玻碳電極。由于STEH是AFB1生物轉化的前體，與AFB1的產生有關，因此可以用該生物傳感器用于谷物及其衍生產品、花生、玉米等易受AFB1污染食品的檢測。對添加STEH的玉米樣品進行分析，平均回收率為96.5%，實驗表明使用該法測定的STEH濃度與HPLC法吻合。

3 電導生物傳感器在真菌毒素檢測中的應用

酶與底物反應時的離子濃度變化會改變電解質溶液的電導率，電導型生物傳感器通過在兩個平行電極之間施加電位差，測量溶液的電導率[31]。將膽堿酯酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等的抑制分析用于生物傳感器中檢測有毒物質是目前的常用方法。

3.1 在黃曲霉毒素檢測中的應用

在所有毒性真菌毒素中，黃曲霉毒素被認為是毒性最大且對農業造成經濟負擔最大的一種毒素。在飽和戊二醇(glutaraldehyde，GA)蒸汽中固定AChE的電導型生物傳感器，測試其對不同種類毒性物質的靈敏度，發現該生物傳感器可用于識別不同種類的毒素，最適合檢測黃曲AFB1(線性范圍為0.02～170 μmol/L，檢出限0.016 μmol/L)或待測樣品中的總毒性[32]。

3.2 在棒曲霉素檢測中的應用

棒曲霉毒素常存在于腐爛的蔬菜瓜果和谷物中，特別是蘋果及其加工制品，高濃度的棒曲霉素具有致突變、致癌和致畸性，因此需要嚴控食品中棒曲霉素含量。SOLDATKIN等[33]則利用脲酶，根據棒曲霉素可以使某些酶的巰基失活從而抑制酶活性的原理，設計了一種檢測棒曲霉素的脲酶電化學傳感器(圖5)。該電導傳感器在1～50 μmol/L線性范圍內獲得的剩余酶活性與樣品中棒曲霉素的濃度呈反比。

A-脲酶生物傳感器方案；B-導電裝置

3.3 在赭曲霉毒素A檢測中的應用

赭曲霉毒素A(ochratoxin，OTA)是一種神經毒素，防止OTA污染食品是非常必要的。目前，用于OTA檢測的酶電化學生物傳感器基本都以辣根過氧化物酶為催化劑的H2O2氧化真菌毒素[34-35]。DRIDI等[36]開發了一款直接檢測橄欖油中OTA的靈敏電導生物傳感器，該生物傳感器將嗜熱菌蛋白酶(thermolysin，TLN)包埋在含有金納米顆粒的聚乙烯醇/聚乙烯亞胺的基質中，并使用GA蒸氣進行交聯。傳感器在最佳條件下(交聯時間35 min、pH 7、25 ℃)對OTA的線性響應高達60 nmol/L，靈敏度為597 μS μmol/L，檢測下限為1 nmol/L,此法操作簡單，在分析前不需任何樣品前處理，可對橄欖油樣品進行快速檢測。

4 電位生物傳感器在食品檢測中的應用

酶與底物反應時基本都涉及H+的釋放或吸收，從而導致離子濃度變化，電位法便是測量平衡狀態(無電流或無顯著電流流動時)下工作電極和參比電極間的電位差，測量信號以對數方式反應目標分析物濃度(圖6)，該法可用于目標分析物的定量檢測[9, 31]。電位生物傳感器分為離子選擇電極(ion selective electrodes，ISE)、酶場效應晶體管(enzyme field-effect transistors，EnFET)和光尋址電位傳感器(light-addressable potentiometric sensors，LAPS)[5]。

圖6 電位測量的工作原理[37]

4.1 在葡萄糖檢測中的應用

許多參與酶反應的小分子都可利用酶電極進行電位傳感，因此開發各種固定化酶的基質和方案的研究在不斷發展。CHOU等[37]以ZnO和摻鋁氧化鋅(aluminum-doped zinc oxide，AZO)為敏感膜，采用絲網印刷技術和濺射系統制備了一種電位型陣列式新型葡萄糖生物傳感器。在此傳感器中酶反應可以導致ZnO納米結構周圍離子分布的變化，從而引起電極的電位響應。Nafion-GOx/GO/AZO/Ag傳感器的線性范圍為2～10 mmol/L，靈敏度為15.44 mV mmol/L，檢測下限為1.89 mmol/L，響應時間為26 s，與傳統葡萄糖生物傳感器相比，此傳感器不僅分析性能好，還具有良好的抗干擾能力和重復性。把經典金屬氧化物半導體場效應晶體管的金屬柵單獨分離出來，再將柵極重構為插入到水溶液中的參比電極，即為離子敏感場效應晶體管(ion-sensitive field-effect transistor，ISFET)，當ISFET與柵極表面的薄酶膜一起固定時，它們就組成了EnFET[5]。葡萄糖ENFET基于葡萄糖形成過程中生物膜局部pH的變化，LUO等[38]將GOx和納米MnO2固定在ISFET柵極上制備葡萄糖ENFET。該葡萄糖生物傳感器表明，敏感膜的局部pH隨著葡萄糖濃度增加而顯著升高。在最佳條件下，該器件在0.025～1.90 mmol/L與葡萄糖呈線性關系，擴展的動態上限為3.5 mmol/L，具有較好的重現性和穩定性。

4.2 在重金屬檢測中的應用

基于酶抑制原理，可以利用此類傳感器間接檢測重金屬離子[39]。工業中大量的磷酸鹽被用于洗滌劑和鍋爐水的處理，因此需對食品用水磷酸鹽含量進行測定。ISE通常由離子專用膜和單獨或集成的參比電極組成，在電位傳感器中使用ISE可將待測樣品中特定離子的活度轉化成可用pH/mV計測量的電位(電壓)[9, 31]。基于各種金屬和相關絡合物，ISE可以用于磷酸鹽的測定，有研究采用恒電流聚合法制備了嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase，PNP)和黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)固定于聚吡咯薄膜，比較兩種電化學(電位法和電流法)磷酸鹽生物傳感器的制備方法，發現尿酸和抗壞血酸的干擾不會影響兩種傳感器的性能[40]。電位型生物傳感器可以檢測到最小為20 mmol/L的磷酸鹽離子，線性范圍為20～200 μmol/L；電流型生物傳感器檢測下限為0.1 mmol/L，線性范圍為0.1～1 mmol/L。

5 三種電化學生物傳感器在食品檢測中的應用總結

應用于食品檢測中的電化學生物傳感器有快速靈敏、結果準確、抗干擾能力好、穩定性好及成本低等特點，以酶為識別元件更提高了傳感器的檢測特異性。3種電化學生物傳感器中電流型在食品中應用最廣泛、發展最成熟，用于定量監測食品加工過程中風味物質含量或有害物質產生，如葡萄糖、維生素或酪胺、雙酚A等，保證食品質量。也有研究以乙酰膽堿酶為識別元件設計出第三代酶電極電流傳感器檢測AFB1，結果與HPLC法吻合，為酶基電流傳感器在食品檢測中的應用提供新方向。電導型傳感器利用酶抑制原理，常應用于定量檢測樣品中的真菌毒素，但由于復雜溶液中電導率檢測難度大，該傳感器適用性不強。電位法相比于電流法，電位法在選擇性和穩定性方面更具優勢，它不需要額外的電位，因此更適合于長期監測。電位法發展潛力巨大，但目前實際應用較少，多數用于醫療護理領域(表1)。

表1 電化學生物傳感器類型比較及傳感器的分析特性

6 展望

基于酶的電化學生物傳感器已成熟地運用于食品加工過程監測和質量控制中對各種分析物進行定性或定量分析。與傳統方法相比，該類生物傳感器器型小巧、操作簡單、經濟實惠，還具有實時監測能力、高靈敏度和強特異性等優點。然而，基于酶的生物傳感器更多應用于食品物質分析，對食源致病菌的檢測常使用生物親和性基團(適配體、抗體)作為識別元件。但仍有研究利用酶電極檢測真菌毒素，為此類傳感器控制食品質量安全提供新思路。目前，將電流生物傳感器應用于食品行業的研究較為成熟，已經形成圍繞固定化酶的載體和固定方法進行改進的系統性體系；而電導生物傳感器的研究基本停留在5年前，究其原因可能是在高離子濃度介質中測量微小電導率變化難度大，限制電導測量設備用于生物傳感器的適用性；電位生物傳感器作為一種新興技術，目前研究大多在理論范圍內，實際應用常在醫療護理領域，對食品的應用還有待開發。雖然目前已經有大量的相關傳感器的設計研究，但要將這項技術引入工業水平，還需要更為全面的研究，食品加工業環境需要更好的重現性和穩定性，所以此類傳感器未來的發展需要對這些方向進行深入研究。