miR-125a-3p 對動脈粥樣硬化斑塊及M1/M2巨噬細胞、MMP-9 和VEGF 的影響

劉演龍，光雪峰，尹小龍，戴海龍

（昆明醫科大學附屬延安醫院心內科/云南省心血管疾病重點實驗室/云南省心臟疾病臨床醫學中心，云南 昆明 650051）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥主導的疾病，其首要驅動因素是巨噬細胞表型失調[1]。激活的巨噬細胞主要被極化成兩種表型，經典激活的M1 和間接激活的M2 巨噬細胞，啟動并促進炎癥是M1 巨噬細胞的主要作用，而M2 巨噬細胞的主要作用為抑制炎癥[2]。在炎癥的早期啟動中，由于各種炎癥因子的誘導，M1 巨噬細胞被大量激活，能夠有效清除病原體；隨著炎癥進展，激活了大量的M2 巨噬細胞，炎癥反應被抑制[2-3]。Schmitz 等[4-5]發現，M2 巨噬細胞主要存在于穩定性動脈粥樣硬化斑塊中，而M1巨噬細胞主要存在于不穩定性動脈粥樣硬化斑塊中，提示斑塊的不穩定可能是由于M1 和M2 之間失衡。

MicroRNA 在單核細胞向巨噬細胞分化過程中起著重要的調控作用。最近研究顯示，隨著單核細胞分化為M1 巨噬細胞，miR-125a-3p 和miR-125a-5 在此過程中也表達升高。M1 巨噬細胞比例的升高，M1/M2 巨噬細胞的分化失衡，導致不穩定斑塊的形成[6-7]。研究發現MMP-9、VEGF 在不穩定斑塊中呈高表達[8-9]，并且MMP導致巨噬細胞積累，VEGF 將巨噬細胞誘導為M1巨噬細胞[10-11]，表明MMP-9、VEGF 在不穩定斑塊中起重要作用。筆者的研究[12]顯示miR-125a-3p 在動脈粥樣硬化斑塊的不穩定及破裂中也起著重要的作用。本研究擬進一步在動物體內實驗，觀察miR-125a-3p 抑制劑對動脈粥樣硬化斑塊形成、M1/M2 巨噬細胞以及斑塊組織中MMP-9 和VEGF 表達的影響，以探討其在動脈粥樣硬化斑塊的穩定性中的作用，為不穩定斑塊的防治提供新的藥物靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

15 只成年雄性健康日本大耳兔，體重2～2.5 kg，由昆明醫科大學實驗動物學部提供。本研究經醫院倫理委員會審批，實驗動物的處理符合實驗動物相關要求。

1.2 主要試劑和儀器

牛血清白蛋白（Solarbio）、0.5% 膽固醇，l0%蛋黃，5% 豬油、miR-125a-3p 干擾慢病毒載體（廣州復能基因有限公司）、生理鹽水、甲醛溶液、70%乙醇、4% 中性福爾馬林、油紅O 染液、0.01M 的PBST、2%BSA、CD11c抗體（Affinity）、CD206抗體（Affinity）、VEGF抗體（Santa Cruz Biotechmology）、MMP-9 抗體（Solarbio）。Axio Lab A1 顯微鏡（蔡司）、Axio Observer A1 熒光顯微鏡（蔡司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 兔動脈粥樣硬化模型的建立及miR-125a-3p 抑制劑干預15 只成年雄性健康日本大耳兔，給予普通飼料和水適應性喂養7 d，再將其隨機分為3組，對照組、動脈粥樣硬化模型組（AS 模型組）和miR-125a-3p 抑制劑干預組（miR-125a-3p抑制劑組）。對照組給以普通飼料喂養，動脈粥樣硬化模型組和miR-125a-3p 干預組一次性靜脈注射牛血清白蛋白（250 mg/kg），即日起給予（0.5% 膽固醇，l0% 蛋黃，5% 豬油）150 g/d 喂養2 周，給予動脈粥樣硬化模型組和miR-125a-3p干預組第2 次注射牛血清白蛋白（250 mg/kg），并繼續給予高膽固醇飼料喂養。期間，所有組提供充足干凈水，定期打掃和清洗兔籠。分別于動脈粥樣硬化建立4 周和8 周后，miR-125a-3p 干預組注射以miR-125a-3p 干擾慢病毒載體（5 mL/只），對照組和動脈粥樣硬化模型組注射以等量生理鹽水，12 周時耳緣靜脈注射空氣處死兔子，立即剖開胸、腹腔，游離主動脈全長，剝離外膜脂肪組織，縱行剖開，行以下述處理。

1.3.2 血管內膜油紅“O”染色血管粥樣斑塊大體標本染色步驟（1）從甲醛溶液中取出標本，用流水洗15 min，剝去外膜，再用蒸餾水浸洗；（2）取儲備液60 mL 加入蒸溜水至100 mL，混勻放置10 min 后染色，染色時間為2～4 min；（3）用70%乙醇浸泡標本至斑塊呈紅色，底色呈白色為止，最后用蒸餾水浸泡標本，浸入甲醛溶液中保存。油紅O 染液的配制：儲備液：油紅O 0.5 g，98%異丙醇 100 mL。臨用前取上液6 mL，加蒸餾水4 mL，靜置10 min，過濾即可。

1.3.3 免疫組織化學方法檢測斑塊組織中MMP-9、VEGF主動脈經4% 中性福爾馬林固定后，石蠟切片進行MMP-9、VEGF 表達測定（SP 法，陰性對照一抗用0.01 mol/L PBS 代替）。顯微鏡下拍照后用“Image Pro Plus 4.5”軟件進行圖像分析，測定陽性物質表達面積和積分光密度。

1.3.4 免疫熒光法檢測M1 標志物CD11c、M2標志物CD206 石蠟切片經脫蠟、酒精脫水后，進行抗原修復，用0.01 M 的PBST 漂洗5 min，重復3 次；以2% BSA 于37 ℃濕盒內封閉30 min；標本片上滴加適當稀釋的熒光標記抗體，放在濕盒中，37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS 漂洗5 min，重復3 次，不時震蕩。緩存甘油封片，鏡檢。

1.4 統計學處理

SPSS 11.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，多組間均數比較應用方差分析，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血管內膜油紅“O”染色結果

血管內膜油紅“O”染色顯示，動脈粥樣硬化病變處被染成紅色。血管內膜油紅“O”染色統計結果顯示動脈粥樣硬化組病變區域遠大于miR-125a-3p 抑制劑干預組，各組間的差異具有顯著性（P＜ 0.01）（圖1、圖2）。結果表明：miR-125a-3p 抑制劑能減少動脈粥樣硬化斑塊的形成。

圖1 血管內膜油紅“O”染色各組動脈粥樣硬化病變區域Fig.1 Vascular intima oil red "O" staining for atherosclerotic lesions in each group

圖2 血管內膜油紅“O”染色Fig.2 Vascular intima is stained with oil red "O" stain

2.2 免疫組織化學方法檢測斑塊組織中MMP9的結果

MMP-9 免疫組化染色結果顯示，與對照組比較，AS 模型組的MMP-9 水平顯著升高（P＜0.001），與AS 模型組比較，miR-125a-3p 抑制劑干預后MMP-9 水平顯著下降（P＜ 0.01）（圖3、圖4）。結果表明：miR-125a-3p 抑制劑干預后，降低了斑塊組織中MMP-9 的表達。

圖3 免疫組化檢測各組MMP-9 表達水平Fig.3 The expression level of MMP-9 was detected by immunohistochemistry

圖4 MMP-9 免疫組化染色（×200）Fig.4 MMP-9 immunohistochemical staining（×200）

2.3 免疫組織化學方法檢測斑塊組織中VEGF 的結果

VEGF 免疫組化染色結果顯示，與對照組對比，AS 模型組的VEGF 水平顯著提高（P＜ 0.01）；與AS 模型組對比，miR-125a-3p 抑制劑干預后VEGF 水平下降，（P＜ 0.01）（圖5、圖6）。結果表明：miR-125a-3p 抑制劑干預后，降低了斑塊組織中VEGF 的表達。

圖5 免疫組化檢測各組VEGF 表達水平Fig.5 Immunohistochemistry was used to detect VEGF expression levels in each group

圖6 VEGF 免疫組化染色（×200）Fig.6 VEGF immunohistochemical staining（×200）

2.4 免疫熒光染色檢測M1 標志物CD11c 的結果

免疫熒光檢測M1 標志物CD11c 染色結果顯示：與對照組比較，AS 模型組的CD11c 水平有明顯升高（P＜ 0.000 1）；與AS 模型組比較，miR-125a-3p 抑制劑干預后CD11c 水平顯著下降（P＜0.000 1）（圖7、圖8）。結果表明：miR-125a-3p抑制劑減少了斑塊組織中M1 巨噬細胞。

圖7 免疫熒光檢測各組M1 標志物CD11c 表達水平Fig.7 The expression level of M1 marker CD11c was detected by immunofluorescence

圖8 M1 標志物CD11c 免疫熒光染色（×200）Fig.8 M1 marker CD11c immunofluorescence staining（×200）

2.5 免疫熒光染色檢測M2 標志物CD206 的結果

免疫熒光檢測M2 標志物CD206 染色結果顯示，與對照組對比，AS 模型組的CD206 水平顯著下降（P＜ 0.000 1），miR-125a-3p 抑制劑干預后CD206 水平明顯升高（P＜ 0.000 1）（圖9、圖10）。結果表明：miR-125a-3p 抑制劑增加了斑塊組織中M2 巨噬細胞。

圖9 免疫熒光檢測各組M2 標志物CD206 表達水平Fig.9 The expression level of M2 marker CD206 was detected by immunofluorescence

圖10 M2 標志物CD206 免疫熒光染色（×200）Fig.10 M2 marker CD206 immunofluorescence staining（×200）

3 討論

AS 是一種慢性炎癥性疾病，嚴重威脅人體健康。研究表明，不穩定AS 斑塊容易導致不良心血管事件的發生[13-14]。巨噬細胞是AS 病變中主要的免疫細胞，在AS 整個病理生理過程中都發揮著重要作用[5]。在動脈粥樣硬化中，當循環中的單核細胞進入內膜后，單核細胞會分化為巨噬細胞[15]。巨噬細胞和單細胞暴露在炎癥細胞因子、氧化脂質、膽固醇晶體和其他因素中。所有這些刺激不僅誘導特定的轉錄反應，而且還廣泛相互作用，導致動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞的轉錄[7]。基于不同的激活方式，巨噬細胞主要分為兩種表型，即經典激活的M1 和替代激活的M2 巨噬細胞[2-3]。M1 巨噬細胞能夠開始并維持炎癥反應，分泌促炎細胞因子，激活內皮細胞，并誘導其他免疫細胞募集到發炎組織中;另一方面，M2巨噬細胞促進炎癥的消退，吞噬糖凋亡細胞，驅動膠原蛋白沉積，協調組織完整性，釋放抗炎介質，主要參與組織修復，具有吞噬、促血管生成和促纖維化能力。M1 巨噬細胞在促進斑塊不穩定方面發揮了重要作用，而M2 巨噬細胞則維持斑塊的穩定，提示斑塊的不穩定可能是M1 和M2亞型之間失衡的結果[6,16]。

miRNA 是一種小型、進化保守的非編碼RNA，長度為18～25 個核苷酸，在基因調控中具有重要作用，轉錄后調控基因表達[17-18]。miRNA 可以抑制數千個目標基因并協調正常過程，包括細胞增殖、分化和凋亡[19]。同時，miRNA 對巨噬細胞的激活起到重要調節作用[7]，例如Lin-Li Lv 等的研究表明[20]，外體miR-19b-3p 調節的TEC 和巨噬細胞之間的通路，導致M1 巨噬細胞激活。由于M1 巨噬細胞加劇斑塊的不穩定，因此，筆者可以推測miRNA 對不穩定斑塊的發生起到了一定的作用。筆者的研究[12]也提示miR-125a-3p 在動脈粥樣硬化斑塊的不穩定及破裂中起著重要的作用。

VEGF 是一種有效的內皮細胞生長因子和血管生成誘導因子，對血管的完整性和血管功能具有重要意義。研究發現，VEGF 在不穩定斑塊中發揮著重要作用，能在一定程度上加速動脈粥樣硬化斑塊的進展和不穩定性。其機制可能是VEGF 增加血管通透性，引起紅細胞外滲，進而導致斑塊內出血，加速動脈粥樣硬化[21]。基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）屬于MMP 家族，并已被廣泛研究。隨著MMP-9 活性的增加，MMP-9 可導致纖維帽變薄，從而導致斑塊的不穩定[22]。

本研究結果顯示，抑制miR-125a-3p 可使動脈粥樣硬化斑塊病變區域面積減少，斑塊組織中M1 巨噬細胞、MMP-9，VEGF 表達減少，M2 巨噬細胞增加。提示miR-125a-3p 抑制可以減輕動脈粥樣硬化斑塊形成，平衡M1/M2 巨噬細胞，減少MMP-9，VEGF 表達，促進斑塊穩定，miR-125a-3p 可能是治療不穩定動脈粥樣硬化斑塊的新靶點。