內毒素的量效和時效對人臍帶間充質干細胞增殖的影響

袁 偉 ，孟明耀 ，李欣欣 ，熊晶晶 ，李 檬 ，曹 佳 ，劉 梅 ，侯宗柳 ，黃永坤

（1）昆明醫科大學第一附屬醫院兒科，云南 昆明 650032;2）云南省腫瘤免疫防治研究重點實驗室，云南 昆明 650051;3）昆明醫科大學附屬延安醫院，云南 昆明 650051;4）云南省檢驗醫學重點實驗室，云南 昆明 650032）

干細胞移植是將干細胞處理后重新輸入體內，以達到治療疾病的一種新型生物療法，在當前的再生醫學時代，表現出廣闊的前景。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因具有天然的免疫抑制功能、強大的旁分泌功能及可向損傷組織遷移等特性[1]，被視為一種較好的組織工程細胞和基因載體細胞。與其他來源的MSCs 不同，hUC-MSCs 來源于產婦分娩時的臍帶，來源途徑十分廣泛，且排斥性低、獲取手段簡便，具有增殖率和克隆率高、體外細胞培養容易開展等生物學特性[2]，可作為干細胞移植理想的種子細胞。隨著hUC-MSCs 在臨床治療中的廣泛應用，人們發現其增殖是影響臨床療效的重要生理因素，目前國內外學界對MSCs 的研究熱點集中在激素[3]、離子[4]、年齡[5]等對其增殖的影響，然而干細胞移植部位周圍的特殊炎性微環境才是影響其增殖的關鍵因素。

研究表明：LPS 會參與肝衰竭及各種并發癥發生和發展的整個過程[6]；在炎癥性腸病患者的腸上皮病變部位，LPS 濃度升高[7]；感染性骨不連骨折或骨缺損，其骨斷端周圍組織可檢測出一定量的LPS[8]，所以，利用hUC-MSCs 治療疾病，過程中都將不可避免使hUC-MSCs 處于LPS 炎性微環境當中，與其發生接觸，并影響其增殖。本研究通過探究最佳量效和時效的LPS 對hUCMSCs 增殖的影響，提供實驗有效性依據，為進一步臨床應用提供干細胞研究基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料試劑與儀器

α-MEM 干細胞培養液（由昆明醫科大學附屬延安醫院中心實驗室提供），胰酶、胎牛血清FBS、磷酸鹽緩沖液PBS（BI 公司），LPS（中國食品藥品檢定研究院中檢所），96 孔板（無錫耐思生物科技有限公司），CCK-8 試劑盒（日本同仁，批號：2H779），細胞周期檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；CO2培養箱（Thermo 公司），倒置顯微鏡（奧特光學，BDS200 ），離心機（Eppendorf公司），酶標儀（Thermo 公司），流式細胞儀（貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2 主要方法

1.2.1 hUC-MSCs 的體外培養及傳代本實驗使用的hUC-MSCs 提取自昆明醫科大學附屬延安醫院中心實驗室干細胞庫。在T75 的培養瓶中以1×106個/mL 的密度接種含10%FBS 的α-MEM干細胞，并放入37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中進行培養。當細胞融合度達到80%左右時，棄上清，洗滌，胰酶消化，當細胞由長梭形轉變為圓形時，棄胰酶，重懸后用臺盼藍稀釋計數并繼續在T75 的培養瓶中以上述密度及條件培養。用倒置顯微鏡觀察到細胞24 h 內貼壁生長，呈長梭形，形態均一，當細胞融合程度達到約80%，排列成漩渦狀、放射狀、網格狀時，培養成功。

1.2.2 LPS 的量效和時效對hUC-MSCs 增殖的影響選擇第四代對數生長期細胞，常規洗滌消化后調整細胞密度為1.5×104個/mL，后接種于96 孔板，1 500 個/孔。在接種24h后更換為含LPS 終濃度為0.098、0.195、0.390、0.780、1.560、3.12、6.250、12.500、25.000 和50.000 EU/mL 的培養液。設不含LPS 的完全培養基為對照組，不含細胞及LPS 的完全培養基為空白組。分別于LPS 作用24h、48h、72 h 后更換培養液，加入每孔培養基總體積10% 的CCK-8 溶液，在37 ℃、5% CO2的培養箱中避光孵育1.5 h，用自動酶標檢測儀在450 nm 的波長處測定吸光度（A 值）。

1.2.3 LPS 對hUC-MSCs 細胞周期的影響根據細胞增殖實驗結果，選擇促進hUC-MSCs 增殖的低濃度（0.098 EU/mL，實驗組1）、中濃度（1.56 EU/mL，實驗組2）和高濃度（25 EU/mL，實驗組3）LPS、作用時間72 h 進行實驗。取第四代對數生長期細胞，以0.5×106個/mL 密度接種于10 cm培養皿，細胞接種24 h 后分別更換為含LPS 濃度0.098 EU/mL、1.56 EU/mL、25 EU/mL 的條件培養基，以不含LPS 的完全培養基作為對照組。作用72 h 進行細胞周期檢測：常規洗滌、消化后調整細胞密度為1×106個/mL，加入1 mL 細胞懸液至離心管內離心，棄上清；用70% 乙醇4 ℃進行細胞固定20 h，離心，棄上清后轉移至流式管再次離心棄上清；在待檢測樣品中加入0.5 mL配置好的碘化丙啶染色液，37 ℃避光溫浴30 min；用流式細胞儀在激光波長488 nm 波長處檢測紅色熒光，采用Modfit 軟件進行細胞DNA 含量分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS22.0 軟件和GraphPadPrism5.0 軟件進行統計學分析。正態分布的連續變量以均值±標準差（）表示，2組之間的比較采用方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 LPS 的量效和時效對hUC-MSCs 增殖的影響

LPS 對hUC-MSCs 增殖的影響與LPS 的濃度及其作用時間均有關系，見表1 和圖1A；不同條件下細胞增殖率見表2。在LPS 作用24 h 時（圖1B），主要表現為抑制hUC-MSCs 的增殖，在濃度為0.78 EU/mL 時抑制作用最明顯，隨LPS 濃度降低或增高，其抑制作用均有減弱的趨勢。作用48 h 時（圖1C），抑制作用普遍減弱，高濃度組顯示對細胞增殖無影響。作用72 h 時（圖1D），LPS 表現出促進細胞增殖的趨勢，且低濃度區域促進作用最顯著，濃度增加其促增殖作用相對減弱。最高濃度組（50 EU/mL）在3 個時間點對細胞增殖均無顯著影響。

表2 LPS 不同濃度及不同作用時間hUC-MSCs 增殖率（%）Tab.2 Proliferation rates of hUC-MSCs at different dose-response and time-dependent of LPS（%）

圖1 不同濃度及不同作用時間的內毒素對hUC-MSCs 增殖的影響Fig.1 Effects of endotoxin with different concentrations and different time on the proliferation of hUC-MSCs

表1 LPS 不同濃度及不同作用時間hUC-MSCs 吸光度（A）值（）Tab.1 Absorbance（A）of hUC-MSCs at different dose-response and time-dependent of LPS（）

表1 LPS 不同濃度及不同作用時間hUC-MSCs 吸光度（A）值（）Tab.1 Absorbance（A）of hUC-MSCs at different dose-response and time-dependent of LPS（）

注：實驗組1至10LPS終濃度依次為：0.098、0.195、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50 EU/mL，表示分別在24 h、48 h、72 h時，與對照組相比，*P ＜ 0.05。

2.2 LPS 對hUC-MSCs 細胞周期的影響

與對照組相比，當作用時間為72 h 時，實驗組1 G0/G1 期的占比降低，S 期占比增高，G2/M期占比增高，實驗組2 和實驗組3 G0/G1 期的占比降低，S 期占比增高，G2/M 期占比與對照組比較，差異無統計學意義（表3、圖2、圖3）。

圖2 LPS 刺激后流式細胞技術檢測hUC-MSCs 細胞周期代表圖例Fig.2 Cell cycle of hUC-MSCs tested by flow cytometry after LPS stimulation

圖3 不同濃度LPS 作用72 h 時hUC-MSCs 細胞周期比例Fig.3 Proportion of hUC-MSCs cell cycle after 72 h of LPS with different concentrations

表3 LPS 對hUC-MSCs 細胞周期的影響（%）Tab.3 Effect of LPS on huc-Mscs cell cycle（%）

3 討論

LPS 是革蘭氏陰性菌細胞壁中的一種成分，在菌體裂解后得以釋放，是菌體中存在的毒性物質的總稱。LPS 與許多慢性疾病的病理生理學有關，是其發病的重要原因，包括胃腸道疾病如腸易激綜合征[9]，心血管疾病如冠心病[10]，中樞神經系統退行性疾病如帕金森病[11]等。在利用hUCMSCs 進行干細胞移植治療疾病時，過程中都將不可避免接觸LPS，并影響其增殖。

hUC-MSCs 的增殖是影響干細胞移植臨床療效的重要生理因素，對于LPS 對hUC-MSCs 增殖的影響，本研究通過CCK-8 增殖實驗和流式細胞術進行探討。首先CCK-8 檢測結果提示，LPS 的量效和時效對hUC-MSCs 的增殖表現出不同的效應，僅當作用時間為72 h，才表現出增殖效應，且低濃度區域促進作用更顯著，濃度增加其促增殖作用相對減弱，當作用時間為24、48 h，表現為抑制hUC-MSCs 增殖。為了進一步驗證該結果，采用流式細胞術檢測細胞周期。細胞周期包括G0 期（休眠期），G1 期（DNA 合成前期），S 期（DNA 合成期）以及G2 期（DNA 合成后期），分裂期又稱為M 期。根據流式細胞術結果，低濃度LPS 處理72 h 后細胞周期的G0/G1 期占比降低，S 期占比增高，G2/M 期占比增高，提示促進hUCMSCs 增殖。

以上兩項實驗結果均提示低濃度LPS 且作用時間長時可促進hUC-MSCs 增殖，這可用預處理對細胞的保護作用解釋，對此，侯玉森等[12]得到了相同的結論，低濃度LPS 預處理可促進hUCMSCs 增殖，提高細胞LPS 耐受性。目前已有大量不同學科及領域的研究證實預處理可減輕臟器損傷、減少細胞凋亡，起到良好的保護作用[13-16]。LPS 預處理對心[17]、肝[18]、腦[19]缺血再灌注損傷具有保護作用，而缺氧[20]、炎癥因子[21]、紅細胞生成素[22]、川芎嗪[23]預處理可促進MSCs 增殖。

綜上所述，hUC-MSCs 的增殖與LPS 的量效和時效均有關系，根據實驗結果，利用hUCMSCs 進行干細胞移植治療疾病時，可根據這一特性提前用低濃度LPS 預處理hUC-MSCs，這樣可增加細胞增殖率，減少凋亡，為干細胞移植應用于臨床提供新思路。