PD-L1、BRAFV600E、CD68 蛋白表達及腫瘤浸潤淋巴細胞在惡性黑色素瘤診斷中的意義

吳希蘭 ，沈紅 ，石素勝 ，張智慧 ，郭蕾 ，王芳

（1）昆明醫科大學基礎醫學院病理學與病理生理學系，云南 昆明 650500;2）清華大學附屬垂楊柳醫院病理科，北京 100022;3）昭通市第一人民醫院病理科，云南 昭通 657000;4）北京協和醫學院中國醫學科學院腫瘤醫院病理科，北京 100021）

據Rebecca 等[1]報告惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）新發病率持續攀升，發病人數每年以3%～5%的速度增長。中國雖屬于惡黑低發地區，但發病率也在不斷上升，每年新發惡黑患者超過8 000，約百萬分之八，而在我國，惡黑患者的5 a 生存率僅為65%。

由于早期病變不明顯，造成多數患者就診時已錯失手術最佳時機，部分患者甚至已發生局部組織侵襲或轉移，晚期或手術無法切除的MM 患者生存率低。鑒于晚期MM 的5 a 生存率低，缺乏較為有效的治療方法，故分析MM 的發生發展機制、了解有效的早期診斷和預后評價指標，以幫助患者選擇有效的診斷和治療方法、延長MM患者生存時間，具有較重要的臨床意義。

本文在高通量組織芯片技術基礎上利用免疫組化方法觀察程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）、BRAFV600E、CD68 在MM組織中的表達情況，分析其與患者病理臨床特征及在預后評估中的價值，同時光鏡下觀察腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）百分比，分析其與臨床病理各參數的關系，希望從中篩選出影響預后的因素，為臨床醫生正確估計患者的預后以及延長患者生存時間提供一定的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 樣本來源收集中國醫學科學院腫瘤醫院病理科2007 年1 月至2011 年12 月期間進行手術切除的60例原發性MM組織樣本（18例有淋巴結轉移，42例無淋巴結轉移，術前均未進行放化療）。所有病例的病理切片均由兩位病理學專家復閱，按照第七版AJCC 惡性黑色素瘤組織學標準[2]進行分期，診斷意見統一。

所有患者以臨床病例查詢、電話及回院復查的方式進行隨訪，隨訪日期自病理報告確診日期算起，至2022 年7 月，并嚴格記錄隨訪情況。共隨訪到35例惡性黑色素瘤患者，失訪25例；隨訪結局定義為死亡。

1.1.2 主要試劑鼠抗人單克隆抗體PD-L1 購自美國R&D，鼠抗人單克隆抗體BRAFV600E（VE1）和通用型二抗-HRP 購自美國羅氏公司，抗體稀釋液、過氧化物酶封閉液和Tris-EDTA 緩沖液購自美國Dako 公司，鼠抗人單克隆抗體濃縮型CD68和DAB 顯色液購自福州邁新生物技術開發有限公司，0.01M 磷酸鹽緩沖液、0.01M 檸檬酸鹽緩沖液等購自中杉金橋。

1.2 研究方法

1.2.1 組織芯片構建光鏡下選擇切片上無退變、壞死以及不同分化程度的腫瘤區域進行打孔靶位的定位標記，每個病例在受體蠟塊上設計2 個靶位，60例樣本設計成4 塊受體蠟塊。

1.2.2 免疫組化染色免疫組化染色步驟按試劑盒說明進行。PD-L1 蛋白的陽性著色定位于胞膜/胞質，BRAFV600E陽性著色主要定位于胞質，呈淡黃色～棕黃色的細/粗顆粒。采用半定量評價標準[3]：以棕黃色顆粒清晰著色于胞膜/胞質為陽性，根據陽性細胞數百分比計分：陽性細胞≤5%為0 分，6%～25% 為1 分，26%～50% 為2 分，51%～75%為3 分，＞ 75%為4 分；根據細胞染色強度計分：無著色為0 分，淡黃色為1 分，黃色為2 分，棕黃色為3 分。將兩項積分相乘形成最終的評級標準：0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為陽性（++），9～12 分為強陽性（+++）。

CD68 蛋白表達定位于胞質。在高倍視野下選擇染色均勻的區域，計數5 個視野，計算陽性細胞占細胞總數的百分比[4]：未著色為0 分，≤25%為1 分，26%～50%為2 分，＞ 50%為3 分。著色強度判定：無著色為0 分，淺棕色為1 分，棕色為2 分，深棕色為3 分。上述2 項相加為最終判定標準，陰性：＜ 2 分；陽性：≥2 分。

1.2.3 TIL 百分比統計高倍鏡下TIL≥50 個淋巴細胞/100 腫瘤細胞，為大量淋巴細胞浸潤；TIL ＜ 50 個淋巴細胞/100 腫瘤細胞，為小量淋巴細胞浸潤。

1.3 統計學處理

所得數據應用SPSS21.0 統計軟件包，各蛋白表達和TIL 與臨床分期、淋巴結轉移和潰瘍形成的關系采用等級相關分析，各蛋白表達和TIL與腫瘤大小和腫瘤浸潤深度的關系采用秩和檢驗中的Mann-Whitney 檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜ 0.05 為差異有統計學意義；生存分析使用Cox 回歸模型。

2 結果

2.1 病例資料

60例原發性惡性黑色素瘤患者男31例，女29例；年齡19歲～80歲，中位年齡56歲，發病高峰年齡50～65歲，≤50歲19例，＞ 50 歲41例。18例伴淋巴結轉移，轉移的淋巴結數目不等；就診時病變部位出現潰瘍/和壞死者26例；皮膚的惡性黑色素瘤以肢端型黑色素瘤最多見（22/32例），軀干7例，其它部位3例；黏膜的惡性黑色素瘤共28例（消化道10例，頭頸部10例，其它部位8例）；腫瘤浸潤深度≤2 惡性黑色素瘤者12例，＞ 2 并≤4 惡性黑色素瘤者8例，浸潤深度＞ 4 惡性黑色素瘤者40例；T分期T1 期30例，T2 期6例，T3 期4例，T4 期20例；Clark’s 分期Ⅰ期24例，Ⅱ期19例，Ⅲ期16例，Ⅳ期1例。

2.2 PD-L1、BRAFV600E、CD68 蛋白和TIL 在惡性黑色素瘤中的表達

PD-L1、BRAFV600E和CD68 免疫組化結果如圖1～3。TIL 情況如圖4～5。

圖1 惡性黑色素瘤PD-L1 蛋白強陽性表達（SP × 200）Fig.1 The strong positive expression of PD-L1 protein in malignant melanoma（SP × 200）

PD-L1、BRAFV600E和CD68 蛋白在原發性惡性黑色素瘤中陽性表達率分別為43.33%（26/60）、60%（36/60）和6.7%（16/60）。

2.3 生存分析

圖2 惡性黑色素瘤BRAFV600E 蛋白陽性表達（SP × 200）Fig.2 The positive expression of BRAFV600E protein in malignant melanoma（SP × 200）

圖3 惡性黑色素瘤細胞CD68 蛋白陽性表達（SP × 200）Fig.3 The strong positive expression of CD68 protein in malignant melanoma（SP × 200）

圖4 惡性黑色素瘤組織中少量淋巴細胞浸潤（HE × 200）Fig.4 A few lymphocytes infiltrated in the malignant melanoma（HE × 200）

納入生存分析的病例數共35例，生存6例，死亡29例。Cox 回歸分析中可用案例29（占比82.9%），刪失案例6（占比17.1%）；刪除案例中，帶有缺失值的案例、帶有負時間的案例、層中最早事件之前刪失的案例均為0例。

將患者生存時間的影響因素采用Cox 回歸分析，協變量為患者性別、年齡、臨床分期、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、轉移與否、潰瘍形成與否、PD-L1、BRAF、CD68 表達和TIL 多少，采用向前法進行變量篩選，結果顯示轉移是影響惡性黑色素瘤患者預后的因素。出現轉移，則患者死亡風險增大，見表1、圖6。

圖5 惡性黑色素瘤組織中大量淋巴細胞浸潤（HE×200）Fig.5 With extensive lymphocytes infiltrated in the malignant melanoma（HE × 200）

表1 多因素 COX 比例風險回歸模型Tab.1 Multivariate COX proportional hazards regression model

圖6 各協變量的均值水平的生存曲線Fig.6 Survival curves for the mean level of each covariate

3 討論

3.1 PD-L1 蛋白與腫瘤

免疫反應中一個極其重要的協同刺激分子是B7 家族[5]，而PD-L1（或稱B7-H1）又是B7 家族中的一個重要成員，也是腫瘤微環境中的重要成員之一，為PD-1 的相應的配體[6]，其表達于T、B 淋巴細胞、樹突狀細胞（DC）、內皮細胞、胎盤、心臟、肝臟等。PD-1/PD-L1 對T 細胞、DC、NK 細胞及TIL 均具有不同的調控作用[7]。PD-L1蛋白在肺癌、MM 等中均有表達，且通過高表達的PD-L1 與PD-1 結合從而達到抑制機體抗腫瘤免疫反應的目的[8-10]。有文獻認為PD-L1 是黑色素瘤患者總生存期和無進展生存期的獨立預后因素[11]，有的卻認為與總生存期無關[12]。這表明PD-L1 蛋白表達與總生存期、無進展疾病期的關系還需更進一步的實驗證實。

PD-L1/PD-1 通路在誘導效應T 細胞凋亡、抑制T 細胞活化、抑制機體抗腫瘤免疫反應和腫瘤免疫逃逸過程中發揮重要作用[13]，PD-L1 也表達于部分TIL 表面，通過結合其他TIL 表面的PD-1 發揮作用[14]。因此，PD-L1/PD-1 通路成為引起研究者研發新一代藥物的靶點。除MM 外，結直腸癌等都有報道PD-L1 蛋白表達與臨床病理各參數的相關性[15]，Cathy A Pinto 等[16]的研究認為晚期黑色素瘤患者的抗PD-1 治療進展不理想，這突出了進一步研究開發新藥物和優化治療策略的必要性。筆者的研究顯示PD-L1 高表達的患者見于較晚的T 分期，這也許是因為PD-L1/PD-1通路激活抑制了免疫反應所引起。因此，PDL1/PD-1 信號通路激活的被抑制，可能是腫瘤免疫治療的有效方法，有望成為惡性黑色素瘤免疫治療的新手段，但PD-L1 是否可以成為預后指標還有待更進一步的研究。

3.2 BRAFV600E 蛋白與腫瘤

BRAF 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，RAF 激酶家族的3 個主要成員之一，該蛋白由3 個保守結構域組成，可激活MAPK 信號通路。BRAF 的突變類型有V600E、V600K、V600R、V600D 等，但MM 常見的突變是BRAFV600E，即BRAF 蛋白第600 位的纈氨酸被谷氨酸取代，導致BRAF 激酶活性顯著提高，從而激活MAPK 信號通路，使黑素細胞轉化成黑素瘤細胞[17]。非小細胞肺癌BRAF 突變率約占3%，突變類型中V600E 型占一半左右，這和MM 不同[18]。Feller 等[19]研究發現免疫組化是檢測BRAFV600E突變的一種可靠、高度特異性的方法，能作為臨床實踐中篩選BRAFV600E突變的工具。本實驗中肢端型MM 突變率約68.2%，故對于皮膚部位的MM 筆者建議行BRAFV600E突變檢測。

3.3 淋巴細胞浸潤與腫瘤

TIL 是一種異質性的淋巴細胞群體，以T 細胞為主，存在于腫瘤間質內，是機體對腫瘤的抵抗現象[20]。TIL 中T 細胞以CD4+、CD8+為主。在光鏡下觀察到，部分腫瘤組織內可見到大量淋巴細胞浸潤，且和腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移等有關。

隨著腫瘤免疫治療的研究，最近幾年，Rosenberg 等[21]通過回輸前臨床干預使TIL 回輸治療MM 的有效率高達70%。

本研究發現大多數病例的病理切片中只能見到少量或缺乏TIL，筆者認為大多數惡性黑色素瘤患者對腫瘤缺乏免疫反應。

3.4 CD68 與腫瘤

腫瘤微環境包括了巨噬細胞，有研究發現實體瘤中有大量的腫瘤相關巨噬細胞（TAM）浸潤，與腫瘤的發生、發展關系密切[22]。根據巨噬細胞不同的功能特性，通常分2 型：（1）經典激活的巨噬細胞（M1 型），主要能分泌促炎因子、趨化因子等參與炎癥反應、清除病原體，參與Th1 型免疫應答發揮抑制腫瘤的作用；（2）替代活化的巨噬細胞（M2 型），有較弱的抗原提呈能力，從而抑制了T 細胞的增殖，促進腫瘤的發生、發展及轉移。相關研究資料顯示，腫瘤組織周圍若有明顯的巨噬細胞浸潤，發生腫瘤擴散轉移的幾率低，預后也較好；反之亦然[23]。腫瘤間質中CD68 陽性巨噬細胞是降低乳腺癌風險的獨立預后因素，而CD68 蛋白在MM 的表達研究很少，且結果不盡相同。

CD68 是巨噬細胞最可靠的標志物。本實驗結果顯示在惡性黑色素瘤中CD68 蛋白陽性表達與腫瘤T 分期間存在差異，提示巨噬細胞在腫瘤的發生、發展中起著一定的潛在作用。由于CD68蛋白既標記M1 型也標記M2 型，故CD68 蛋白在判定腫瘤浸潤巨噬細胞作用方面還存在一定的局限性。