昆明地區1 452例低病毒載量慢乙肝患者耐藥突變相關位點的分析

余婷婷，王紅英，張潤武，白經，普冬，李冬玲

（昆明市第三人民醫院/云南省傳染性疾病臨床醫學中心，云南 昆明 650041）

2016 年世界衛生組織提出“2030 年消除病毒性肝炎作為重大公共衛生威脅”的目標。云南病毒性肝炎發病率跟全國的總體情況差不多，截至2022 年2 月，云南省共報告法定傳染病15 912例，其中共報告16 種乙類傳染病，病毒性肝炎的報告發病數居第2 位，而乙肝在病毒性肝炎里占比最高，乙肝的診療水平也亟待提高。臨床上低病毒載量乙肝患者分布比例高，即便乙肝病毒在低水平復制狀態下病毒仍有對人體肝臟造成損傷的能力，長期以往亦會影響患者的預后，甚至導致其死亡[1]。

《慢性乙型肝炎防治指南》（2019 年版）[2]放寬了抗病毒治療的適應證，過去對于乙肝患者要求轉氨酶超過2 倍上限，E 抗原陽性的，HBV DNA ＞ 104IU/mL，E 抗原陰性的，HBV DNA ＞103IU/mL，才開始抗病毒治療，現在不再對HBV載量提出要求，只要檢測結果為陽性，ALT 升高（排除其他原因），就推薦開始抗病毒治療，HBV DNA《103IU/mL 的低病毒載量乙肝患者也納入抗病毒治療人群。不同基因型和抗病毒治療方案對乙肝患者病情發展以及預后有重要影響，本研究通過對昆明地區低病毒載量乙肝患者進行基因分型及耐藥性研究，為臨床抗病毒治療難易程度的判定及抗病毒精準醫療個體化方案的制定提供依據，致力于2030 年全球消除病毒性肝炎目標的推進。

1 資料與方法

1.1 入選標準

選取2020 年1 月至2021 年12 月昆明市第三人民醫院門診及住院的1 452例低病毒載量（HBV DNA《2.0×103IU/mL）慢性乙型肝炎患者，診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2019 年版）[2]。

1.2 標本采集

慢性乙型肝炎患者空腹采集不抗凝靜脈血5 mL，3 000 r/min 轉速離心 10 min，分離血清置于 1.5 mL 離心管中，于-20 ℃儲存，備用。

1.3 標本檢測

乙肝病毒載量檢測：按照羅氏COBAS TaqMan的試劑盒操作說明進行檢測。

乙肝病毒分型和耐藥基因位點檢測：血清標本中提取HBV DNA，PCR 擴增 HBVP 區 RT 段序列，擴增產物純化后，在ABI 3500DX 測序儀上進行雙脫氧末端終止法Sanger 測序。操作按說明書嚴格進行。

1.4 序列分析

通過序列比對，分析乙肝病毒基因型以及HBV P 區核苷類藥物拉米夫定LAM、阿德福韋酯ADV、恩替卡韋ETV、替比夫定LDT、替諾福韋酯TDF、恩曲他濱FTC 等相關耐藥位點基因的突變情況。參照《2017 年歐洲肝病年會乙型肝炎病毒感染臨床實踐指南要點》[3]判讀耐藥敏感性。

1.5 統計學處理

采用SPSS15.0 對檢測數據進行統計分析，計數資料用n（%）表示。

2 結果

2.1 昆明地區乙肝低載量人群分布特征

昆明地區乙肝低載量人群中HBeAg 陰性者占比較高（59.5%），男性患者占比（70.6%）高于女性，年齡分布以30～60 歲為主，占比72.7%，C 基因型患者占比最高（61.8%），檢出D 基因型患者2例，見表1。

表1 昆明地區乙肝低載量人群分布特征Tab.1 Population distribution characteristics of the chronic hepatitis B patients withlowviral.l.oadin Kunming

2.2 昆明地區低載量乙肝患者耐藥分布情況

1 452例昆明地區低載量乙肝患者中共有37例患者檢出耐藥突變位點，拉米夫定與恩曲他濱耐藥率一致（1.6%），替比夫定耐藥率為1.2%，阿德福韋耐藥率0.9%，恩替卡韋耐藥率0.2%，替諾福韋未檢出耐藥突變位點，見表2。

表2 昆明地區低載量乙肝患者耐藥分布情況Tab.2 Drug resistance distribution of the chronic hepatitis B patients withlowviral.l.oadin Kunming

2.3 昆明地區低載量人群耐藥位點檢出情況

37例檢出耐藥突變位點的低載量乙肝患者中，檢出阿德福韋耐藥相關主要位點A181T/V、N236T、M204V/I；替比夫定耐藥相關主要位點M204V/I、A181T/V，補償位點L180M；恩替卡韋耐藥相關主要位點M204V，補償位點L180M、V173L，其他位點S202G；拉米夫定耐藥相關主要位點M204V/I、A181T/V，補償位點L180M、V173L；恩曲他濱耐藥位點與拉米夫定一致。各藥物的耐藥位點模式，見表3。

表3 昆明地區低載量人群耐藥位點分布情況Tab.3 Drug resistance sitesdistribution of the chronic hepatitis B patients withlowviral.l.oadin Kunming

2.4 其他突變位點檢出情況

除耐藥突變位點外，1 452例昆明地區低載量乙肝患者中還檢出其他突變位點112例，其中S256G、S213T、N/H238T/D、Q215H 檢出率最高，檢出率最低的突變位點為A194T，共檢出2例，見表4。

表4 其他突變位點檢出情況Tab.4 Detection of other mutation sites

3 討論

本研究中，昆明地區低病毒載量乙肝患者多為男性，與本研究團隊前期對昆明地區2 707例慢性乙肝患者的研究結果相一致[4]，這可能與男性社交范圍較女性更廣，感染HBV 的機會更大。低病毒載量乙肝患者年齡段多集中在30～60 歲，占比72.7%，可能與此年齡段人群社會活動程度相對較高、經濟能力相對較強有關，他們獲取健康普及知識的渠道更為廣泛，因此就診率相應增高[5]。我國HBV 基因型分布存在南方以 B 型為主，北方以 C 型為主的地域性差異。而對于昆明地區低病毒載量乙肝患者的研究發現，C 基因型患者占比61.8%，B 型占比38.1%，D 基因型患者2例，占比0.1%，說明本地區低病毒載量乙肝患者基因型以C 型為主，這與張悅等[6]的研究結果相一致，提示本地區的 HBV 基因型分布狀況有獨立特征。這可能與昆明為云南省會城市，人口流動性大，HBV 的傳播途徑及感染人群等都在發生變化，造成基因型分布出現多樣化的趨勢。

《慢性乙型肝炎防治指南》（2019 年版）[2]不再對HBV 載量提出要求，只要檢測結果為陽性，ALT 升高（排除其他原因），就推薦開始抗病毒治療，治療藥物首選強效低耐藥的核苷類藥物 NAs，HBV DNA《103IU/mL 的低病毒載量乙肝患者也納入抗病毒治療人群。本研究中，1 452例低病毒載量乙肝患者中HBeAg 陰性人數占比較高（59.5%），臨床實踐中，部分低載量乙肝患者HBeAg 陰性，病毒復制處于靜止狀態，但HBeAg 轉陰也可能是由HBV 的變異所引發，此時病毒更易對臨床抗病毒藥物耐藥[7]，提示臨床治療過程中更應對低載量乙肝患者耐藥情況予以關注。

本次1 452例昆明地區低載量乙肝患者中共有37例患者檢出耐藥突變位點。拉米夫定是第一代核苷類逆轉錄酶抑制劑，體內與體外研究表明拉米夫定與恩曲他濱耐藥位點一致，本研究中拉米夫定與恩曲他濱耐藥率一致，耐藥率為1.6%，耐藥相關主要位點M204V/I、A181T/V，補償位點L180M、V173L，這與許春、趙衛峰等[8-9]的研究結果相一致。本研究中，與拉米夫定相比，替比夫定的耐藥率略低，但替比夫定耐藥率高于阿德福韋、恩替卡韋，其中以恩替卡韋的耐藥率最低。恩替卡韋耐藥率低，具有較高的耐藥屏障，這可能與恩替卡韋的耐藥機制不同于其他NAs 藥物有關，需要在先出現M204V +L180M 兩個位點的耐藥突變后，再出現補償位點或其他位點的聯合變異，從而產生 ETV 耐藥。以往的臨床研究中[10-11]，尚未發現 TDF 耐藥產生，與本研究結果類似。但N236T、A194T 和A181T/V 位點突變會引起替諾福韋酯不敏感[12]，本研究中發現N236T位點變異2例，A194T 位點變異2例，A181T/V位點變異12例，提示昆明地區低載量乙肝患者可能存在替諾福韋酯藥物敏感性下降。此外，本研究中還發現2 種或2 種以上的核苷類藥物可能存在交叉耐藥位點，臨床應用有待進一步研究探討。

除耐藥突變位點外，1 452例昆明地區低載量乙肝患者中還檢出其他突變位點112例。其中，檢出N/H238T/D 位點18例（占比16.1%），Q215H位點16例（占比14.3%），I233V 位點8例（占比7.1%），還檢出V214A、V191I 各4例。與Ryu 等[13]的研究相似，他們的研究還發現這5 個位點的出現可能會導致阿德福韋耐藥敏感性下降。此外，本研究還發現V207M 位點10例（占比8.9%）、S213T 位點18例（占比16.1%），Jiang 等[14]對79例單用阿德福韋治療的阿德福韋耐藥者研究也發現了 V207 M、S213 T18例等位點的變異。L229V位點本研究中發現10例（占比8.9%），Han 等[15]對46例替比夫定變異患者進行基因測序發現34例患者也L229V 等變異位點。本研究中，除上述位點外，還發現V191I、A200V、S256G 突變位點的存在，而這些位點相關文獻報道極少。上述檢測出的所有突變位點是否與耐藥性相關，能否引起藥物敏感性降低，仍存在一定的爭議，但其檢出率存在一定的占比，也應引起重視，還需要更多學者持續深入的研究，提供一些客觀的數據支撐，從而能促使新的耐藥位點得到認定。

耐藥突變是阻礙慢性 HBV 感染治療的一項重大難題，需進一步深入研究昆明地區低病毒載量乙肝患者耐藥突變位點情況，結合肝纖維化程度、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平、乙肝病毒DNA 水平等多指標聯合檢測，為低載量慢乙肝患者的診斷和療效動態監測提供更準確的臨床依據，判定患者抗病毒治療難易程度，制定抗病毒精準醫療個體化方案，從而致力于推進2030 年全球消除病毒性肝炎目標的實現。