血清類風濕性關節炎相關瓜氨酸化蛋白檢測在類風濕關節炎診斷中的應用價值研究

趙宏帥，羅 清，付 鵬，高玉潔，葉玉濤，饒佳月，李俊明*

（1.南昌大學第一附屬醫院檢驗科；2.南昌大學公共衛生學院，江西 南昌 330006）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是以關節損傷為主要臨床表現的一種慢性自身免疫性疾病，其主要病理特點為滑膜組織的炎癥增生和骨侵蝕，RA 的發病機制與多種細胞、蛋白質有關[1]。RA 早期可致關節腫脹、疼痛，若未得到及時治療可進一步導致關節畸形和功能的喪失，最終導致患者殘疾、喪失勞動力，因此RA 的早期準確診斷對提高患者的生活質量和生存率非常重要[2]。

目前RA 的診斷主要依據臨床表現、影像學檢查和實驗室指標的檢測，RA 的臨床個體差異大、輕重程度不一，而在RA 早期影像學改變不明顯，所以實驗室指標對RA 的早期診斷尤為重要。根據2010 年美國風濕病學院（ACR）和歐洲風濕病聯盟（EULAR）合作修訂的RA 的分類標準[3]，RA 診斷的實驗室指標主要是類風濕因子（RF）和抗循環瓜氨酸化蛋白抗體（Anti-CCP）。然而，RF 診斷RA 的特異度并不是很理想，在其他的自身免疫性疾病和部分感染性疾病中也可能增高。Anti-CCP 是目前診斷RA特異度最好的實驗室指標，但敏感度并不理想。因此，尋找新的RA 診斷標志物對于進一步促進RA 的診斷具有重要價值。蛋白質的瓜氨酸化是蛋白質肽鏈中的精氨酸殘基轉化為瓜氨酸殘基進而導致蛋白質三維結構發生變化的過程。由于發生了肽鏈基團和蛋白質的結構改變，蛋白質的瓜氨酸化可導致免疫細胞對蛋白質免疫識別和應答的紊亂，進而導致疾病的發生。蛋白質的瓜氨酸化在介導RA 患者的免疫異常中發揮了重要作用，由此產生的瓜氨酸化蛋白也被發現是多種自身抗體，尤其是Anti-CCP 產生的重要靶抗原。RACP 是一類與RA 特異度相關的翻譯后修飾蛋白，較早前就有研究發現，瓜氨酸化蛋白在RA 患者疾病發生早期的血清中就會出現，但其在RA 臨床診斷中的研究卻鮮見報道。本研究采用商品化的試劑盒對RA 患者其他疾病患者和健康對照者外周血中類風濕性關節炎瓜氨酸化蛋白（RACP）的水平進行了檢測，并系統分析了其在RA 診斷中的應用價值[4]。

1 材料與方法

1.1 研究對象的選擇選取2020 年7 月至11 月在南昌大學第一附屬醫院風濕科就診的RA 患者作為RA組，其診斷符合2010 年ACR/EULAR 修訂的RA 分類標準[3]。選取同期在南昌大學第一附屬醫院就診的骨關節炎（osteoarthritis，OA）、未分化關節炎（undifferentiated arthritis，UA）和系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者作為疾病對照組。OA 的診斷符合《骨關節炎診斷及治療指南》中骨關節炎診斷標準[5]；SLE診斷符合2019 年EULAR/ACR SLE 分類標準[6]；UA 患者的納入標準：①至少有一個關節表現為紅腫癥狀，且不能用其他疾病解釋，②未出現骨侵襲表現[7]。健康對照組選自南昌大學第一附屬醫院體檢中心無疾病記錄的健康體檢者。

所有研究對象在納入時均排除妊娠或哺乳期婦女，腫瘤患者，有活動性感染或近期有感染的患者，患有嚴重心、肺、肝、腎、血液系統疾病的患者，以及同時伴有其他自身免疫性疾病的患者。本研究獲得南昌大學第一附屬醫院醫學研究倫理委員會批準，入組研究對象及其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 臨床資料收集及指標檢測

1.2.1 收集所有研究對象的臨床資料及相關實驗室檢查數據計算RA 患者28 關節疾病活動指數（disease activity score 28，DAS28）[8]。同時，采集研究對象的清晨空腹靜脈血5 mL，低速水平離心機（德國Eppendorf 公司）離心（3 500 r/min，5 min）分離血清后置于-80 ℃冰箱凍存備用。

1.2.2 RACP 的檢測RACP 的檢測采用酶聯免疫吸附法，試劑盒由廣州市雷德生物科技有限公司提供，嚴格依據說明書進行檢測。結果判斷：以血清樣品檢測結果的OD 值與臨界對照品OD 值比值（S/CO）作為RACP 的半定量水平，以S/CO=1 作為RACP 定性判斷的臨界值，S/CO ≥1 判斷為陽性。

1.3 統計學方法用SPSS 25.0 統計軟件進行數據處理分析，首先進行正態分布分析，正態分布定量資料以(±s)表示，非正態分布資料用M（P25～P75）表示，符合正態分布者采用t檢驗或單因素方差分析，否則采用非參數檢驗；定性資料以例數或百分率表示采用χ2檢驗。采用Spearman 相關分析研究各指標之間的相關性。用Medcale軟件繪制受試者操作特征（ROC）曲線評價各檢測指標對RA 的診斷價值，應用Z 檢驗比較各指標間ROC 曲線下的AUC 值，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的一般情況及臨床資料本研究共納入RA 患者133 例，包括初診患者62 例、經治病例71 例，其中女性108 例（81.2%），年齡15～81 歲[ 平均年齡（51.81±12.88）歲]。疾病對照組共納入非RA 患者151例，包括OA95 例，SLE40 例，UA16 例，其中女性128 例（84.7%），年齡14～86 歲[平均年齡（50.32±15.59）歲]。健康對照組共納入40 例健康體檢者，其中女32 例（80.0%），年齡29～71 歲[平均年齡（48.28±10.74）歲]，年齡、性別與RA 組相匹配。研究對象的一般情況及臨床資料見表1。

表1 研究對象的一般情況及臨床資料

2.2 RACP 的陽性率分析各組研究對象的RA 相關血清學標志物的陽性率見表2。RACP 在RA 患者中的陽性率88.0%高于非RA 的疾病對照組（19.9%）和健康對照組（12.5%）。在RA 患者中，初診和經治患者RACP 的陽性率分別為87.1%和88.7%。

表2 各組別研究對象血清RACP、Anti-CCP和RF 的陽性率[ 例(%)]

與經典的RA 血清學標志物比較：RACP 在RA 患者中的陽性率與RF 比較差異無統計學意義（88.0% vs 85.7%，χ2=0.06，P＞0.05），但高于Anti-CCP（88.0% vs 76.7%，χ2=7.04，P＜0.05）。在疾病對照組中，RACP 的陽性率高于Anti-CCP（19.9% vs 4.0%，χ2=18.17，P＜0.05），與RF 比較差異無統計學意義（19.9% vs 21.2%，χ2=0.08，P＞0.05）。在健康對照組中，RACP 的陽性率高于Anti-CCP（12.5%vs 0.0%，χ2=3.20，P＞0.05），與RF 一致。

在Anti-CCP 陽性和RF 陽性的RA 患者中，RACP 的檢出率分別為96.1%和94.7%。在Anti-CCP 陰性和RF 陰性的RA 患者中，RACP 的檢出率分別為61.3%和47.4%。

在病程＜2 年的RA 患者中，RACP 陽性率為84.5%；在病程2～5 年RA 患者中，RACP 陽性率為84.8%；在病程≥5 年的RA 患者中，RACP 陽性率為95.2%高于前兩組，差異無統計學意義（χ2=3.07，P＞0.05）。

2.3 RACP 水平與RA 經典的血清學標志物及RA 疾病活動度的相關性分析RA 組血清RACP 的水平高于疾病對照組和健康對照組（圖1A）。疾病對照組血清RACP的水平也高于健康對照組，其中UA 組RACP 水平高于OA 組（圖1B）。

圖1 各組研究對象的血清RACP 水平

RACP 水平與RA 其他血清學標志物的相關性分析：Spearman 相關性分析結果顯示，RA 患者血清RACP 的水平與患者的年齡和性別無相關，與血清RF 水平也無相關（結果未顯示），Anti-CCP 陽性患者RACP 水平與Anti-CCP 水平正相關（r=0.367，P＜0.05）。

RACP 與RA 疾病進程和活動性的相關性分析：血清RACP 的水平在初診和經治RA 患者中差異無統計學意義（圖2A），不同病程的RA 患者間差異無統計學意義（圖2B）。Spearman 相關性分析結果顯示，RA 患者血清RACP的水平與DAS28CRP、DAS28ESR 均無相關性（結果未顯示）。但初診RA 患者血清RACP 水平與變形關節數呈正相關（r=0.65，P＜0.05）。

圖2 不同組別RA 患者血清RACP 的水平

2.4 ROC 分析以所有非RA 研究對象為對照組的ROC分析結果顯示（圖3），RACP 診斷RA 的最佳截斷值為S/CO=3.44，敏感度和特異度分別為79.0%和92.1%，其ROC 下面積（AUC）為0.90（95%CI：0.86～0.93），略高于RF 的0.89（95%CI：0.85～0.92），低于Anti-CCP的0.920（95%CI：0.89～0.95），但三者比較差異無統計學意義（P＞0.05）。RACP 分別與Anti-CCP，RF 聯合后AUC 分別為0.94（95%CI：0.91～0.96）和0.93（95%CI：0.89～0.95），與RACP、RF 單一指標比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。RACP、Anti-CCP 和RF 三者聯合后AUC可達0.95（95%CI：0.92～0.97），高于RACP 和RF 兩者聯合的效果（Z=3.28，P＜0.05）。

圖3 RACP、Anti-CCP 和RF 單獨或聯合診斷RA 的ROC 分析

2.5 RACP 在RA 診斷中的性能分析各RA 血清學標志物診斷RA 的性能參數見表3。RACP 診斷RA 的敏感度高于Anti-CCP（88.0% vs 76.6%，χ2=7.04，P＜0.05），但特異度低于Anti-CCP（81.7% vs 96.9%，χ2=21.19，P＜0.05）。RACP 的敏感度和特異度都略高于RF，但差異均沒有統計學意義。Anti-CCP 在RA 的診斷方面具有最好的特異度和陽性預測值，RACP 診斷RA 的敏感度和陰性預測值最佳。三個指標或兩個指標聯合后的結果表明，RACP 與Anti-CCP 聯合后比較合適，敏感度提高到91.0%，特異度為79.6%。

表3 Anti-CCP、RF 和RACP 水平單獨及聯合后診斷RA 敏感度、特異度和準確度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比

3 討論

RA是一種以關節滑膜炎為特征，并以多發性關節炎為主要臨床表現，進而導致關節畸形甚至致殘的自身免疫性疾病[9]。研究證明RA 患者對瓜氨酸化的蛋白質可產生較強的免疫應答，提示瓜氨酸化蛋白可能是RA 致病的重要自身反應性抗原[10]。RA 患者瓜氨酸代謝失調是驅動和維持抗瓜氨酸蛋白抗體的關鍵因素[11]。瓜氨酸化蛋白是類風濕性關節炎特異度自身抗體識別的重要抗原，產生的抗瓜氨酸化蛋白抗體能直接或間接介導軟骨侵蝕、骨質破壞，在RA 發病過程中發揮關鍵作用[10]。目前發現的結合瓜氨酸化蛋白的特異度抗體包括抗核周因子（antiperinuclear factor）、抗角蛋白抗體（antikeratin antibodies）、抗聚角蛋白微絲蛋白抗體（antifilaggrin antibodies）和抗環瓜氨酸抗體（Anti-CCP），且這幾種抗體的出現對診斷RA 具有高度的特異度，其中Anti-CCP 已成為診斷RA 的重要血清學標志物[12]。然而由于檢測技術的限制，目前對RA 患者RACP 應用價值的研究卻很少有報道。最近，有學者利用高效液相色譜質譜聯用技術建立了瓜氨酸化蛋白的鑒定方法，并發現在血清Anti-CCP 陰性的RA 患者滑膜組織同樣有瓜氨酸化蛋白的高表達[13]，提示瓜氨酸化蛋白在RA 患者中的檢出率可能高于Anti-CCP。本次研究選取了與早期RA 鑒別困難的關節炎患者作為對照組，更符合臨床要求，而且對一些RA 或者Anti-CCP 陰性的患者進行檢測，與傳統的實驗室檢測方法有很好的互補性。

研究發現，RA 患者血清RACP 的檢測陽性率高于Anti-CCP，該結果證實了管曉龍等[13]的推測。然而，研究顯示RACP 診斷RA 的特異度不如Anti-CCP，提示在其他疾病特別是未分化關節炎患者同樣存在一定水平的瓜氨酸化蛋白。本研究發現RA 新發病例組瓜氨酸化蛋白的陽性率與RA 復發疾病組比較差異無統計學意義，盡管隨著病程延長RACP 的陽性率有上升趨勢，提示RACP 可能主要在RA 的發生過程中發揮作用。進一步的研究也發現，RACP的水平與RA 患者的疾病活動性沒有相關性，但Anti-CCP陽性患者RACP 水平與Anti-CCP 水平正相關（r=0.367，P＜0.05），而且初診RA 患者血清RACP 水平與變形關節數呈正相關（r=0.65，P＜0.05）。

在RA 的診斷效能方面，ROC 分析結果顯示，RACP診斷RA 的AUC 達到0.90，提示RACP 可作為RA 的診斷標志物。進一步的研究顯示，在Anti-CCP 陽性的RA 患者中，RACP 的陽性率可達96.1%，在Anti-CCP 陰性的RA患者中RACP 的陽性率也能達到和61.3%，即有一半以上的Anti-CCP 陰性的RA 患者血清中可檢出RACP，提示在RA 診斷方面兩者具有較好的互補性，具有較好的聯合診斷價值。研究結果也顯示，RACP 與Anti-CCP 聯合應用于RA 的診斷時，雖然特異度有所降低，但是敏感度可顯著提高到91.0%。

本次研究RACP 特異度略低于應用相同試劑盒陳建蕓等[14]的研究，敏感度高于該研究，可能是因為本次實驗納入的樣本多半是有關節痛等相關癥狀的患者，導致對照組RACP 陽性率略高。在部分非RA 的疾病對照組患者和部分健康人血清中也檢出了較高比例的RACP，尤其是在未分化關節炎患者中的檢出率達到了31.2%，提示RACP 診斷RA 的特異度并不是很理想。然而，考慮到RACP 主要是作為啟動RA 自身免疫應答的靶抗原在RA 的發生過程中發揮作用，可能也存在部分已經發生較高水平的蛋白質瓜氨酸化，但尚未發生RA 或尚未滿足RA 診斷標準的個體。此前的文獻報道顯示，有約29.4%的UA 患者最終會發展為RA[15]，這也從一個側面為我們的推測提供了支撐。后期計劃對這部分RACP 陽性的非RA 組研究對象進行隨訪，了解這部分人群未來疾病的進展和發生RA 的可能，以評估RACP 在預測RA 發生中的可能作用。

綜上所述，RACP可作為RA診斷的新型血清學標志物，并與Anti-CCP 和RF 具有較好的互補性，尤其是RACP 與Anti-CCP 聯合應用可提高RA 診斷的敏感度，但其診斷RA的特異度和預測RA 發生的作用尚需進一步的深入研究。