阿爾茨海默病患者血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1的表達變化及臨床意義*

王鋒存，趙秀麗，劉軍莉

（青海大學附屬醫院1.神經內科；2.老年病科，青海西寧 810001）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease, AD）是以進行性認知功能障礙和行為損害為主要特征的中樞神經系統變性疾病，起病隱匿，病程慢性遷延并進行性發展，嚴重影響患者生活質量[1]。目前尚未完全明確AD 發病機制，近年研究證實神經免疫炎癥反應在其中發揮重要作用，以小膠質細胞激活和炎癥細胞因子表達為主要特征[2-3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, LncRNA）是一類不編碼蛋白質的RNA，轉移相關的肺腺癌轉錄本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）和核旁斑組裝轉錄本1（nuclear paraspeckle assembly transcript 1, NEAT1）是近年來受到廣泛關注的LncRNA，研究指出LncRNA MALAT1 通過抑制核因子E2 相關因子2 表達，LncRNA NEAT1 通過激活Wnt/β-連環蛋白信號通路參與小膠質細胞激活和神經炎癥損傷[4-5]。目前關于LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 與AD 患者炎癥因子和認知功能的關系鮮有報道。本研究分析AD 患者血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 的表達變化，探討其是否參與AD 炎癥反應和認知功能損傷。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2021年1月青海大學附屬醫院收治的AD 患者93 例為AD 組。其中，男性51 例，女性42 例；年齡48～84 歲，平均（64.88±7.36）歲；體質量指數18～28 kg/m2，平均（23.47±2.20）kg/m2；病程1～11年，平均（5.24±1.18）年；文化程度：初中及以上65 例，小學28 例。納入標準：①符合《美國精神障礙診斷與統計手冊（第4 版）》[6]的AD 診斷標準；②MRI 或CT 腦改變或腦萎縮；③臨床資料完整；④患者監護人均知情研究。排除標準：①神經活性藥物濫用史；②腦血管疾病、顱腦外傷等導致的認知功能損害；③嚴重感染疾??；④合并自身免疫性疾病；⑤合并心、肝、腎等器質性病變；⑥其他精神疾??；⑦存在攻擊行為或自殺傾向。另選取同期本院54 例體檢健康者為對照組。其中男性34 例，女性20 例；年齡54～86 歲，平均（65.25±8.14）歲；體質量指數18～28 kg/m2，平均（23.54±2.17）kg/m2；文化程度：初中及以上38 例，小學16 例。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 血清指標檢測

采集受試者靜脈血，以3 000 r/min 離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液，置于-80℃冰箱冷凍保存待檢。取部分血清，采用TRIzol 試劑盒提取血清總RNA，TaKaRa 逆轉錄試劑盒轉錄合成cDNA，Narodrop 驗證cDNA 濃度及純度，使OD260/OD280 為1.8～2.0，進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）擴增。 LncRNA MALAT1 正向引物：5'-GCTCTAGACGCAGCCTCCAGCCCGAGACTTCT-3'，反向引物：5'-CGGGATCCGTAGGGCTTCTCAAAACACC AGCT-3'，長度均296 bp；LncRNA NEAT1 正向引物：5'-CTTCCTCCCTTTAACTTATCCATTCAC-3'，反向引物：5'-CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATAC-3'，長度均244 bp。反應條件：95℃預變性90 s、95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃拉伸15 s，共40 個循環。以GAPDH作為內參校正，正向引物：5'-TATGAT GATATCAAGAGGGTAGT-3'，反向引物：5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'，長度均22 bp。2-ΔΔCt法計算血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1相對表達量。剩余血清采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測超敏C 反應蛋白（high-sensitivity C-reactive protein, hs-CRP），白細胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）水平，試劑盒購自上海延慕實業有限公司，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 認知功能評估

采用簡易精神狀態量表（mini-mental state examination, MMSE）[7]評估受試者認知功能，包括6個維度共30 個條目，分值0～30 分，分值越高則認知功能越好，初中及以上受教育程度患者＜24 分、小學＜20 分、文盲＜17 分視為認知功能障礙。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 26.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）或中位數和四分位數間距M（P25，P75）表示，比較用t檢驗或秩和檢驗；相關性分析用Pearson 或Spearman 法；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清 LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1相對表達量和MMSE評分比較

兩組血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 相對表達量和MMSE 評分比較，差異有統計學意義（P＜0.05），AD 組血清LncRNA MALAT1 相對表達量和MMSE 評分低于對照組，LncRNA NEAT1 相對表達量高于對照組。見表1。

表1 兩組血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1相對表達量和MMSE評分比較

2.2 兩組血清炎癥因子水平比較

兩組hs-CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），AD 組高于對照組。見表2。

表2 兩組血清炎癥因子水平比較 （pg/mL，±s）

表2 兩組血清炎癥因子水平比較 （pg/mL，±s）

組別AD組對照組t 值P 值n 93 54 hs-CRP 3.10±0.60 1.87±0.42 14.575 0.000 IL-1β 38.03±8.04 27.41±5.79 8.503 0.000 IL-6 107.15±13.51 83.28±12.04 10.739 0.000 TNF-α 195.66±12.80 181.59±12.29 6.522 0.000

2.3 AD 患者血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 表達與病程、MMSE 評分和炎癥因子的相關性

Pearson 或Spearman 相關性分析顯示，AD 患者血清LncRNA MALAT1 表達與MMSE 評分呈正相關（rs=0.587，P=0.000），與hs-CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈負相關（rs=-0.522、-0.601、-0.574和-0.577，均P=0.000），LncRNA NEAT1 表達與MMSE 評分呈負相關（rs=-0.593，P=0.000），與hs-CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α 均呈正相關（r=0.487、0.588、0.611 和0.573，均P=0.000）。

2.4 血清炎癥指標和LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1表達對AD的診斷價值

ROC 曲線顯示，血清LncRNA MALAT1 診斷AD的AUC 為0.915（95% CI：0.858，0.955），最佳臨界值為0.98，其對應的敏感性為94.62%（95% CI：87.92，98.22），特異性為81.48%（95% CI：68.61，90.70）；血清LncRNA NEAT1 診斷AD 的AUC 為0.858（95% CI：0.791，0.910），最佳臨界值為2.37，其對應的敏感性為90.32%（95% CI：82.45，95.52），特異性為72.22%（95%CI：58.44，83.57）。見表3 和圖1。

表3 血清炎癥指標和LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1表達診斷AD的效能分析

圖1 血清炎癥指標和LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1表達診斷AD的ROC曲線

3 討論

AD 是導致老年人失能的重要原因，發病率逐年增高，2020年我國AD 患者約900 萬，到2050年預計將增加至2 100 萬[8]。早期識別AD 有助于改變腦結構、功能和行為水平的可塑性，延緩病情進展，減輕功能障礙，增強患者社會參與力，改善生活質量。目前尚未完全明確AD 發病機制，主流觀點認為錯誤折疊的β-淀粉樣蛋白（amyloid βprotein, Aβ）于大腦中沉積形成淀粉樣蛋白斑塊和Tau 蛋白過度磷酸化導致的神經纖維糾纏是AD 最主要的病理特征[9]。研究發現，Aβ 斑塊沉積周圍存在大量活化小膠質細胞，與Aβ 大量產生導致小膠質細胞過度激活有關，小膠質細胞過度激活介導的炎癥反應又能誘導Aβ 大量產生，形成惡性循環參與AD 進展[10]。近年實驗也表明，非甾體類抗炎藥能顯著改善Aβ 沉積和認知功能[11]。上述研究提示神經炎癥反應參與AD 病理、生理過程，研究其相關細胞因子對AD 早期診斷、治療具有重要意義。

LncRNA 是一類轉錄本＞200 個核苷酸的非編碼RNA，攜帶多種信息并具有重要調節功能，已被證實參與腦卒中、AD、帕金森等多種神經炎癥反應疾病過程[3]。LncRNA MALAT1 位于染色體11q13.1，首次由JI 等[12]在非小細胞肺癌中發現，并認為是非小細胞肺癌預后標志物。近年來大量研究證實LncRNA MALAT1 還參與其他惡性腫瘤進展，并參與其他非腫瘤疾病發生、發展過程。SHANG 等[13]研究顯示，腦缺血或再灌注損傷小鼠模型海馬中LncRNA MALAT1 表達下調，增加LncRNA MALAT1表達具有抑制神經元凋亡、縮小梗死體積、改善學習和記憶功能等作用。PATEL 等[14]研究顯示，創傷性腦損傷大鼠模型腦組織LncRNA MALAT1 表達下調，增加LncRNA MALAT1 表達能抑制腦組織中IL-1β、TNF-α 等炎癥細胞因子表達，抑制神經炎癥。上述研究提示LncRNA MALAT1 與神經炎癥反應和認知功能密切相關。本研究結果顯示，AD 組血清LncRNA MALAT1 表達低于對照組，提示LncRNA MALAT1 參與AD 發病過程。MMSE 為臨床AD 患者智力狀態和認知功能評估方式，hs-CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α 是AD 患者血清中常見異常炎癥細胞因子。本研究結果證實，LncRNA MALAT1低表達與AD 患者炎癥反應升高和認知功能降低密切相關，其機制可能與AD 患者腦組織炎癥反應引起LncRNA MALAT1 表達抑制，LncRNA MALAT1 低表達導致miR-125b 表達升高。miR-125b 作為AD 重要的生物標志物，在促進Aβ 大量分泌、抑制神經突生長、誘導神經元凋亡等方面發揮關鍵作用[15]。研究表明，LncRNA MALAT1 能靶向下調miR-125b表達，降低IL-6、TNF-α 表達，抑制AD 模型神經炎癥和凋亡，促進神經突生長[16]。

LncRNA NEAT1 也位于人染色體11q13.1，因該染色體是癌癥多發的基因位點，因此近年來大量研究報道了其在癌癥中的作用，如LncRNA NEAT1能通過海綿miR-486-5p 調節核受體4A1/Wnt/β-連環蛋白信號通路，促進結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲[17]。近年研究發現，LncRNA NEAT1 還參與中樞神經系統疾病，如KUKHARSKY 等[18]研究顯示，敲除小鼠LncRNA NEAT1 基因可損害小鼠社交能力，但對小鼠認知功能、運動功能無影響。NI等[19]研究顯示，敲低腦缺血或再灌注損傷小鼠LncRNA NEAT1 可抑制小膠質細胞向促炎M1 表型極化，抑制神經元凋亡。有研究顯示，LncRNA NEAT1 能靶向miR-107 加重Aβ 過度沉積誘導的神經元損傷[20]。本研究結果顯示，AD 組血清LncRNA NEAT1 表達高于對照組，提示LncRNA NEAT1 參與AD 發病過程。進一步分析證實，LncRNA NEAT1過表達與AD 患者炎癥反應和認知功能降低密切相關，其機制可能與LncRNA NEAT1 可促進小膠質細胞向促炎表型極化，釋放炎癥細胞因子，損害神經功能有關[18]。β 分泌酶1 是IL-6、TNF-α 等炎癥細胞因子誘發的AD 重要促進因子，能通過增加Aβ表達參與AD 發生、發展[21]。研究發現，LncRNA NEAT1 能通過海綿miR-124 上調β 分泌酶1 表達[22]。提示LncRNA NEAT1 高表達還可能通過增加Aβ 表達誘導小膠質細胞過度活化，釋放炎癥細胞因子，參與AD 發生、發展。筆者評估了血清炎癥指標和LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 表達對AD 的診斷價值，結果顯示LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 表達診斷AD 的AUC 分別為0.915 和0.858，顯著大于血清hs-CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，說明血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 表達對AD 具有良好的診斷價值。

綜上所述，AD 患者血清LncRNA MALAT1 低表達，LncRNA NEAT1 高表達，兩者可能參與AD 炎癥反應和認知功能損傷，可作為AD 診斷標志物。但本研究樣本量有限，且有關LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1 與AD 的作用機制尚未完全明確，還需進一步研究。