外泌體在骨關節(jié)炎發(fā)病及治療中的作用和機制研究*

王劉欣，王賀林，張勉

（1.空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院一大隊一隊，陜西西安 710032；2.空軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院醫(yī)療康復科，陜西西安 710032；3.空軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院口腔解剖生理學教研室，陜西西安 710032）

骨關節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）是一種常見的關節(jié)退行性疾病，在世界范圍內具有較高的發(fā)病率，會導致患者疼痛和殘疾[1]。OA 的主要特征為軟骨退化、軟骨下骨硬化、滑膜退化、韌帶鈣化和骨贅形成等。目前OA 的治療方式較為局限，早期可用鎮(zhèn)痛藥物治療，但晚期主要進行關節(jié)置換手術[2]。外泌體是直徑30～150 nm 的一種細胞外囊泡，其來源廣泛，在細胞間的交流中起到重要作用。隨著近年來外泌體研究的深入，越來越多的資料顯示外泌體與關節(jié)疾病的進展相關（包括OA、類風濕關節(jié)炎等）[3]，本文就外泌體在OA 中的作用進行綜述。

1 外泌體的來源及構成

外泌體是細胞間交流的關鍵介質之一，其參與正常的生理過程，并在疾病的發(fā)展、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

1.1 外泌體的來源

細胞外囊泡是細胞分泌到細胞外的脂質囊泡，基于不同的合成途徑、釋放通路、大小、內容物和功能，其可分為微囊泡、外泌體、凋亡小體和腫瘤小泡。其中外泌體起源于細胞膜的內吞作用，主要通過細胞內溶酶體微粒內陷，進而在生長因子的作用下形成攜帶有多種信息的多囊泡體，其外膜與細胞膜融合后，將外泌體釋放到胞外基質中[4-5]。外泌體來源多樣，不論是在正常生理狀態(tài)下還是病理狀態(tài)下，幾乎所有細胞都可以產(chǎn)生外泌體。其中具有免疫活性的外泌體大多來自樹突狀細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和各種腫瘤細胞，參與抗原提呈、免疫激活、免疫抑制和免疫監(jiān)視的過程；而另一種外泌體則來源于體內絕大部分類型的細胞（成纖維細胞、成骨細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、間充質干細胞等），主要介導細胞間的通信，調節(jié)自身細胞與組織或者鄰近組織器官的功能[6-7]。

外泌體目前常見的分離方式有：超速離心法、聚合物沉淀法、分子篩色譜層析法、密度梯度離心法、膜超濾法、免疫親和捕獲法等。根據(jù)其來源不同選擇不同的分離方法，單獨使用一種方式難以獲得高質量的外泌體，故通過多種方式結合以提高分離純度和獲取效率。隨著基于微流控分離技術的發(fā)展，也提高了外泌體分離純度與敏感性[8]。在分離出外泌體后，需要對其進行鑒定，主要包括物理及生物化學性質的鑒定。通過掃描電鏡觀察表面微觀結構，透射電鏡觀察外泌體內部結構及形態(tài)，動態(tài)光散射法和納米顆粒跟蹤分析儀分析外泌體的粒徑范圍與濃度，應用蛋白質印跡法結合流式細胞術檢測特征性標志蛋白ALIX、CD63、CD81 及來源細胞上的標志物。不同的鑒定方法不能同時對物理性質及生物化學性質進行鑒定，因此需要多種方式結合進行鑒定[9-10]。

1.2 外泌體的結構

外泌體是由來自供體細胞的外泌體膜以及其內包含的脂質、核酸和蛋白質構成的囊泡。外泌體膜由類似于細胞質膜的雙層脂質組成，但與細胞膜不同的是，外泌體富含鞘磷脂、不飽和脂質與膽固醇，相對于細胞膜，外泌體脂質雙層的剛性更大，使外泌體作為各種生物分子的載體以及抵抗降解等方面，具有一定的穩(wěn)定性[11]。此外，外泌體膜中含有更多的磷脂酰絲氨酸，有助于被受體細胞內化，在特定的細胞間靶向交流中發(fā)揮一定的作用[12]。

1.3 外泌體的內含物成分

外泌體內含有來自供體細胞的脂質、核酸和蛋白質[13]。外泌體內高比例的膽固醇和鞘磷脂及有關脂質代謝的酶都參與了改變受體細胞狀態(tài)的過程。外泌體中也存在多種類型的RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA、miRNA、siRNA 和長鏈非編碼RNA（lncRNA，cirRNA）等，且不同細胞來源的外泌體內RNA 含量不同，其可以傳遞信息到靶細胞，并誘導受體細胞產(chǎn)生一系列的生理變化。盡管有證據(jù)表明外泌體內含有可以轉運的DNA，但是這種內容物功能的重要性仍然未知[4]。

外泌體內還含有多種蛋白質，普遍存在的有：與外泌體合成有關的蛋白（ESCRT 蛋白、Alix、TSG101 和分子伴侶等）、主要組織相容性復合體Ⅱ類分子及四跨膜蛋白等，不論外泌體起源的細胞類型，這些蛋白普遍存在，因此可作為通用的外泌體標志物。同時外泌體內釋放出的多種酶，也可以起到改變細胞外環(huán)境的作用[14-15]。這些外泌體的內容物作為信使轉運出供體細胞，在受體細胞內發(fā)揮著重要的功能。

1.4 外泌體的作用途徑

外泌體在細胞間的交流中起到關鍵作用，其主要通過三種途徑調節(jié)受體細胞的功能。首先，外泌體通過配體作用與下游靶細胞膜接觸，以激活細胞中的信號轉導通路。其次，外泌體能與細胞的胞膜相結合，從而使靶細胞獲得新的黏附性能。同時，受體細胞還可以發(fā)揮內吞作用吞噬外泌體，之后外泌體的內容物（脂質、核酸和蛋白質）進入受體細胞內，部分mRNA 在進入細胞后被翻譯表達，部分miRNA 則參與調控受體基因的表達[16]。

2 不同細胞來源的外泌體對OA發(fā)病的影響

多種細胞來源的外泌體參與了OA 的發(fā)病，主要包括軟骨細胞、軟骨下骨細胞、關節(jié)滑液、滑膜細胞、破骨細胞等。其外泌體內含有大量的脂質、核酸（mRNA、miRNA 和一些小的非編碼RNA）、代謝產(chǎn)物、蛋白質等，通過外泌體介導的細胞間的交流，其生物活性內容物可以調節(jié)靶細胞基因的表達，改變受體細胞的生理或病理過程以及下游功能，在OA 疾病發(fā)展進程中起到重要作用。

2.1 軟骨細胞來源外泌體

健康軟骨內包含有大量的細胞外基質及軟骨細胞，軟骨細胞外基質主要由蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白等組成，起到了維持軟骨組織的作用。而來源于OA 患者軟骨細胞內的外泌體通過其內部高表達的miRNA，作用于關節(jié)組織內，影響軟骨細胞內基因表達，介導相關信號轉導通路，產(chǎn)生炎癥細胞因子，同時改變細胞外基質內主要成分，破壞細胞外基質的穩(wěn)態(tài)，對OA 的發(fā)生、發(fā)展起破壞性調控作用。

NI 等[17]通過對OA 軟骨細胞來源的外泌體進行分離與鑒定，發(fā)現(xiàn)降解區(qū)域軟骨中外泌體含量大于未降解區(qū)域的軟骨。來自OA 患者軟骨細胞的外泌體進入關節(jié)滑膜組織中的巨噬細胞后，對其進行miRNA 測序，并結合ATG4B mRNA 3′UTR 與miRNA 結合位點的生物信息學分析篩選出miR-449a-5p，其參與了經(jīng)白細胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）（OA 的關鍵致病因子）預處理后人原代軟骨細胞的外泌體介導的ATG4B 表達水平的降低，導致抑制巨噬細胞自噬。巨噬細胞自噬減少的同時促進了mitoROS 和IL-1β 的產(chǎn)生，最終加劇滑膜炎癥并促進OA 的發(fā)展。而利用miR-449a-5p 的抑制劑，可以部分逆轉ChCILpre-exos 介導的IL-1β 的產(chǎn)生，再次證實了外泌體內的miRNA 在OA 中的破壞性調控作用。

2.2 軟骨下骨細胞來源外泌體

miRNA 是短的非編碼RNA，其通過促進mRNA降解和與靶mRNA 的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）中特定結合位點相結合，抑制mRNA 翻譯，從而調節(jié)基因表達。每個miRNA 都可以靶向數(shù)百個基因，每個靶轉錄包含許多不同的miRNA 結合位點，從而形成1個復雜的miRNA 基因靶相互作用網(wǎng)絡。由于來源于軟骨下骨外泌體內含有大量的不同種類的miRNA，可在OA 的發(fā)生、發(fā)展中起到多種作用，影響著軟骨基質的代謝以及細胞的分化、凋亡和自噬等過程。PRASADAM 等[18]提取OA 患者的硬化性和非硬化性軟骨下骨中miRNA，與OA 發(fā)病機制中軟骨下骨的硬化狀態(tài)相關的miRNA 進行鑒定，以及對膝關節(jié)OA 大鼠關節(jié)中miRNA 變化的情況進行分析后得出：miR-33b-5p 與miR-590-5p 都在硬化性軟骨下骨中上調，同時miR-211-5p 可抑制細胞分化為成骨細胞，表明miRNA 參與了OA 軟骨下成骨細胞礦化狀態(tài)改變，進而影響OA 的病理進程。

外泌體作為重要的運輸途徑，將miRNA 運送至靶細胞，對不同的基因進行調控，通過影響靶細胞相關基因表達，進而影響疾病的發(fā)展進程。WU 等[19]發(fā)現(xiàn)miR-210-5p 在OA 硬化性軟骨下骨中的表達始終呈上調趨勢，且在共培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)OA 硬化性軟骨下骨的存在顯著影響了軟骨細胞的合成、代謝及分解代謝標志物的基因表達。因此將miR-210-5p 模擬物轉染至軟骨細胞內觸發(fā)了關節(jié)軟骨細胞的肥大和分解代謝相關基因的表達，加速了OA 的進展。

2.3 關節(jié)滑液來源外泌體

KOLHE 等[20]用來自OA 患者關節(jié)滑液內的外泌體處理健康女性的關節(jié)軟骨細胞，發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶MMPs（MMP-2 和MMP-9）基因表達顯著增加，細胞外基質蛋白基因表達下降，炎癥因子（IL-6，TNFα 等）基因表達顯著增加，同時軟骨細胞的存活率顯著降低。總體來說，用來源于OA 患者關節(jié)滑液的外泌體處理的關節(jié)軟骨細胞，降低了合成基因的表達，提高了分解代謝基因和炎癥基因的表達，通過對不同基因進行調控，使其在疾病發(fā)展中起著至關重要的作用。

還有許多研究表明關節(jié)滑液來源的外泌體可通過募集炎癥細胞，促進多種細胞因子的釋放并抑制軟骨增殖，從而促進關節(jié)退化。DOMENIS 等[21]對OA 患者關節(jié)滑液內的外泌體進行純化和分析，發(fā)現(xiàn)外泌體可以顯著刺激人外周血單核細胞分化的M1巨噬細胞釋放多種炎癥細胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶，例如：IL-1β、MMP-12、MMP-7、CCL8、CCL15 以及CCL20 等。在轉錄水平上，滑液內外泌體刺激的M1 巨噬細胞IL-1β 的mRNA 表達顯著上調，而其他細胞因子TNFα、IL-10 和IL-6 的mRNA水平則沒有明顯改變。證明了滑液內的外泌體在刺激M1 巨噬細胞釋放促炎因子的能力方面具有一定的功能活性，這一作用將促使炎癥發(fā)生，進而導致軟骨降解。GAO 等[22]通過收集不同階段膝OA 患者關節(jié)滑液中的外泌體，并對其中的細胞因子進行鑒定，同時與滑液內的游離細胞因子含量進行比較，發(fā)現(xiàn)了來自終末期膝OA 患者滑液衍生的外泌體內含有更高水平的細胞因子（尤其是趨化因子），且募集炎癥細胞并抑制軟骨增殖。進而證明了外泌體不僅促使周圍環(huán)境內細胞釋放更多的細胞因子，其本身也含有的大量細胞因子，這兩種途徑均在關節(jié)退化中起著重要作用。

2.4 滑膜成纖維細胞來源外泌體

滑膜細胞來源的外泌體一方面可以通過金屬蛋白酶的作用分解蛋白多糖，另一方面可通過下調Ⅱ型膠原蛋白的表達，減少膠原蛋白含量，吸收軟骨細胞外基質，加重軟骨組織的破壞[23-26]。TOMOHIRO 等[27]將IL-1β 處理的滑膜成纖維細胞的外泌體作用于正常關節(jié)軟骨細胞，結果顯示其顯著上調MMP-13 和 ADAMTS-5 的表達（MMP-13 與ADAMTS-5 是公認的導致基質降解的重要的蛋白酶），并下調關節(jié)軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白A1 和ACAN 的表達，證明了來自OA 患者滑膜的外泌體可以通過刺激蛋白酶的產(chǎn)生，影響細胞外基質的成分，參與OA 的進展。

雖然成人軟骨在生理上是無血管組織，但在OA 的關節(jié)組織內的血管生成增加，血管生長在骨軟骨連接處向軟骨內延伸，最終導致骨贅形成和關節(jié)軟骨化，因此血管生成是OA 發(fā)病機制中的重要過程[28]。有研究表明，顳下頜關節(jié)OA 患者滑膜細胞高表達血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF），通過激活雙向HIF-1-VEGF-Notch 信號通路誘導新生血管的形成[29-30]。TOMOHIRO 等[27]通過來源于滑膜成纖維細胞的外泌體作用于人臍靜脈內皮細胞實驗，發(fā)現(xiàn)IL-1β 刺激的滑膜成纖維細胞的外泌體誘導VEGF 的表達，使人臍靜脈內皮細胞中的促血管生成活性增加，且單獨的IL-1β 不會誘導人臍靜脈內皮細胞促血管生成活性增加。從而證明了滑膜來源的外泌體在促進關節(jié)組織中新生血管的形成中起著重要作用。

2.5 破骨細胞來源外泌體

破骨細胞來源外泌體內miRNA 在調節(jié)破骨細胞和成骨細胞功能方面具有關鍵作用。LI 等[31]通過復制miR-214-3p 過表達的破骨細胞特異性外泌體的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)骨形成減少，而通過破骨細胞靶向Antagomir-214-3p 治療則可促進成骨細胞骨形成。之后進行了外泌體示蹤實驗，用CMV-GFPCD63 轉染破骨細胞以標記破骨細胞內的外泌體，發(fā)現(xiàn)成骨細胞中檢測到了GFP 蛋白陽性顆粒，進一步證明了破骨細胞來源外泌體內miR-214-3p 被轉移到成骨細胞內，抑制了成骨細胞活性并減少骨形成。總體來說，破骨細胞來源外泌體轉移到成骨細胞以抑制骨形成，而針對此機制，抑制破骨細胞外泌體可能是治療骨形成減少的骨骼疾病的一種策略。

DAI 等[32]通過分離破骨細胞內的外泌體并對其內部miRNA 進行檢測，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)let-7a-5p 表達顯著增加，此外外泌體內高表達的let-7a-5p 通過抑制Smad2 以減少轉化生長因子-β 誘導的軟骨細胞肥大，證明了破骨細胞衍生的外泌體在促進軟骨細胞的肥大分化。

3 外泌體對OA的治療作用

針對早期輕度OA 患者，目前治療主要使用非甾體抗炎藥、關節(jié)腔內注射等緩解OA 的癥狀[33]，但上述治療方式不能長期緩解疾病及其癥狀，并且還具有許多副作用，而對于重癥OA 患者則需采用關節(jié)重建術等，但是外科治療風險大，技術要求高[34]，因此基于外泌體尋找新的可能靶點是OA治療的新策略。

3.1 針對致/促病作用外泌體的診療

近年來許多研究表明，雖然部分來自OA 患者軟骨、滑膜、滑液等組織的外泌體對OA 的發(fā)生、發(fā)展具有促進作用，但反之也為減緩OA 的疾病進展提供了新的診斷和治療干預思路[35]。一方面可以通過選擇性外泌體抑制劑的應用，減少促進疾病進展的外泌體的產(chǎn)生、釋放、攝取，降低部分miRNA 的表達，進而調節(jié)下游靶細胞促炎因子與細胞外基質的改變。另一方面，可通過特異性靶向其成分對外泌體作用途徑中的特殊靶點進行調控，抑制外泌體介導的靶細胞信號轉導，從而促進骨關節(jié)內穩(wěn)態(tài)的維持。有研究通過前期研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β 預處理的人原代軟骨細胞的外泌體內高表達miR-449a-5p，因此通過轉染miR-449a-5p 抑制劑進行實驗，出現(xiàn)了巨噬細胞自噬增加的同時減少了mitoROS 和IL-1β 的產(chǎn)生，證明了特異性抑制劑應用于OA 的治療的可能性[17]。

此外，對來自體液（血液、尿液）的外泌體進行分離，并對其內容物進行鑒定，可作為生物化學標志物預測軟骨退化，評估相關關節(jié)疾病的進展。有研究對OA 患者的滑液外泌體進行提取，并對其內含的miRNA 進行RNA 測序分析，發(fā)現(xiàn)miR-210-5p 顯著上調[19]，且隨著進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在早期、晚期OA 患者的滑液樣本中明顯上調，并且與VEGF 水平呈正相關。這些發(fā)現(xiàn)表明滑液中miR-210 的上調可能發(fā)生在OA 的早期階段，因此有預測易感個體發(fā)展為OA 的無創(chuàng)和早期快速診斷工具的潛力[36]。

3.2 干細胞外泌體在OA治療中的應用

目前大多數(shù)關于外泌體治療OA 的研究主要集中在干細胞外泌體的治療潛力，特別是間充質干細胞來源的外泌體，包括：骨髓間充質干細胞、滑膜間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、胚胎間充質干細胞等。許多研究表明，MSC 來源的外泌體中包含的miR-8485、 miR-92a-3p、 miR-320c、miR-140-5p、miR-26a-5p 等生物活性物質通過誘導MMP、組蛋白去乙酰化酶2、環(huán)氧合酶2 等靶向蛋白的表達，從而調控Wnt/β-catenin、RANKLRANK-TRAF6 等不同通路以減少炎癥反應，維持細胞外基質的穩(wěn)定，減少OA 軟骨細胞凋亡，促進OA 軟骨細胞增殖與遷移，減輕對關節(jié)的破壞[37-44]。OA 的進展還與關節(jié)軟骨內的免疫反應相關，有研究結果表明，MSC 來源的外泌體具有抑制T 淋巴細胞、激活B 淋巴細胞的免疫調節(jié)特性，因此MSC 來源外泌體的免疫調節(jié)功能也成為未來研究的主要方向[45]。

3.3 外泌體作為藥物載體的治療作用

干細胞來源的外泌體的生物學效應與完整的干細胞本身之間有許多相似之處，相對于細胞本身，外泌體具有許多優(yōu)勢，如：體積小，具有一定的穩(wěn)定性、特異性和靶向性，內含物具有直接的生物活性，免疫原性低等。同時還有研究表明，外泌體具有良好的藥物代謝動力學特性，能夠穿透合成藥物遞送載體無法滲透的生理屏障。這些特點使其在關節(jié)疾病的治療中成為一種天然且高效的傳遞系統(tǒng)。因此，外泌體可以作為藥物遞送和靶向治療的工具，進行軟骨再生的非細胞性治療，將生物活性物質直接作用于OA 部位，減輕軟骨破壞和基質降解，保護關節(jié)免受損傷，在軟骨修復中具有一定有效性[37,46-48]。Kartogenin 是一種小分子，已被發(fā)現(xiàn)可在體外和體內誘導SF-MSC 向軟骨細胞分化，然而其臨床應用受到低水溶性的限制。XU 等[49]將MSC 結合肽E7 與外泌體膜蛋白Lamp 2b 融合，產(chǎn)生了具有滑液來源的間充質干細胞（SF-MSC）靶向能力的展示E7 肽的外泌體（E7-Exo），研究發(fā)現(xiàn)與單獨的人卵巢顆粒細胞（KGN）或不含E7 的外泌體遞送的KGN 相比，E7-Exo 遞送的KGN 能有效地進入SF-MSC 并誘導更高程度的軟骨分化，證明了外泌體作為載體發(fā)揮了較好的治療作用。但是當外泌體作為運載體時，其產(chǎn)量受到被運載物的影響而降低，雖然有研究表明細胞納米穿孔法可大規(guī)模生成內含mRNA 的外泌體[50]，但其純化和大規(guī)模生產(chǎn)還需進一步的探索。

4 總結與展望

OA 的發(fā)病機制較為復雜，而外泌體在其中發(fā)揮了重要調控作用，不僅作為重要轉運載體轉運物質，也通過其內容物miRNA 等對靶細胞的基因進行調控，進而促進炎癥因子的產(chǎn)生，以及影響細胞外基質的成分變化，最終促進骨關節(jié)疾病的發(fā)生、發(fā)展進程。但外泌體作為一種天然的運載體，內含有多種不同生物活性物質，包括多種miRNA、蛋白質等，因此可以針對不同內容物進行靶向藥物的研究，為OA 的精準治療提供思路，但必須繼續(xù)進行大量研究以證明外泌體在預防和治療OA 中的有效性和可行性。