釓塞酸二鈉增強MRI T1 mapping定量參數與肝細胞癌Ki-67表達的相關性研究

劉子蔚，楊少民，陳海雄，郭保亮，張榕，周翠銣，李曉虹，胡秋根*

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是肝臟最常見的原發性惡性腫瘤，發病率逐年上升，是導致全球癌癥主要死亡的原因之一。目前HCC在我國常見的惡性腫瘤中居于第4位，在癌癥導致死亡病因中居于第2位[1]。手術切除是HCC國內外公認的早期根治性的治療方式，但手術切除術后5年的復發率高達60%～70%，術后高復發率是影響HCC患者術后遠期生存狀況的重要因素[2-3]。Ki-67是一種與細胞增殖活性有關的核抗原，它是反映細胞增殖水平的常用指標，一些學者認為Ki-67是評估HCC患者術后復發及不良預后的重要生物學標志物[4-5]。目前Ki-67檢測依賴于病理學檢查，穿刺活檢是獲取病理組織的常用方法，但它是一種侵入性的檢查，具有一定的局限性[6-7]。術前使用無創的定量方法來評估Ki-67的表達對術前臨床治療方案的制訂具有積極作用。肝臟特異性對比劑釓塞酸二鈉（gadolinium-ethoxybenzyl-diethylenetriamine pentaacetic acid, Gd-EOB-DTPA）能被正常肝細胞攝取，越來越被應用于肝臟疾病的診斷及評估。既往研究表明信號強度（signal intensity, SI）可以定量評估HCC 的腫瘤特性[8-10]，然而SI 常受到掃描參數的影響且與Gd-EOB-DTPA 濃度不成比例[11-12]。T1 mapping 技術是一種無創的定量分析組織T1 值的方法，它能夠與Gd-EOB-DTPA良好結合，更準確、客觀地提供攜帶功能信息的MRI定量圖像。兩者結合能夠定量反映HCC 攝取有機陰離子轉運蛋白多肽（organic anion transporting polypeptide, OATP）的能力，從而反映HCC的腫瘤特征。既往研究在評估HCC的病理分化[13]、微血管侵犯[14]、切除復發[15]等方面取得了一定的研究成果。這為術前精準無創地評估Ki-67表達提供了依據。迄今，國內利用Gd-EOB-DTPA 增強MRI T1 mapping 定量參數評估HCC Ki-67 表達相關性的研究報道少見。本研究旨在探討Gd-EOB-DTPA增強MRI T1 mapping定量參數與HCC Ki-67表達的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本研究屬于回顧性研究，經南方醫科大學順德醫院（佛山市順德區第一人民醫院）倫理委員會批準，免除受試者知情同意，批準文號：科研倫審20201124。本研究回顧性分析2019年7月至2020年12 月南方醫科大學順德醫院（佛山市順德區第一人民醫院）因單發HCC行根治性手術的患者資料。納入標準：（1）術后病理診斷為單發HCC并行根治性手術；（2）術前2 周內行Gd-EOB-DTPA 增強MRI T1 mapping檢查；（3）病理標本均行Ki-67 免疫組化染色。排除標準：（1）術后病理診斷為其他肝臟腫瘤或多發性（＞2 個）HCC；（2）各種原因導致的MRI 圖像存在嚴重偽影不適合診斷；（3）術前接受任何腫瘤治療。

1.2 MRI檢查方法

所有患者均使用3.0 T MRI（西門子，Skyra 3.0 T MR）掃描儀、腹部專用線圈（體部相控陣線圈，18 通道），采用膈肌導航技術進行掃描，檢查范圍自肝臟上緣至肝臟下緣。先行軸位T1WI容積內插法體部檢查（volume interpolated body examination, VIBE）序列及軸位T1 mapping平掃，接著采用Gd-EOB-DTPA進行軸位增強掃描，注射對比劑后20～30 s行動脈期掃描，60 s、150 s分別行門脈期、平衡期掃描，再行軸位T2WI 刀鋒（BLADE）序列掃描，20 min 后行軸位肝膽期成像及軸位T1 mapping 掃描。增強掃描使用Gd-EOB-DTPA（Primo-vist; Bayer Schering Pharma AG, Berlin, Germany）對比劑，采用高壓注射器自肘靜脈注入，劑量0.1 mL/kg，流速1.0 mL/s，然后以相同速率注射30 mL 生理鹽水沖管。T1 mapping采用T1Map-雙翻轉角VIBE 序列，并進行B1 mapping 勻場校正，序列掃描完后自動生成mapping 圖像，主要參數：TR 5.01 ms，TE 2.3 ms，層厚4 mm，雙翻轉角3°、15°，視野（field of view, FOV）380 mm×285 mm，矩陣224×168；T1WI-VIBE 序列主要參數：TR 4.00 ms，TE 1.29、2.52 ms，層厚3 mm，FOV 380 mm×380 mm，矩陣320×240。

1.3 圖像分析與數據測量

將患者的影像數據從PACS 中以DICOM 格式導出，應用RadiAnt DICOM Viewer 2020.2（https://www.radiantviewer.com）軟件進行閱片。由2名分別有12年和15年腹部專業診斷經驗的放射科副主任醫師在不知曉患者臨床資料的前提下測量數據，測量前先進行培訓。感興趣區（region of interest, ROI）勾畫盡可能選取最大層面，盡可能保持各序列同一層面，ROI應盡可能放置在病變動脈期強化區域，如果腫瘤較大（＞5 cm），則采用多個ROI取平均值的方法，避開出血、壞死液化、血管，采用復制、粘貼方法確保各序列ROI面積的一致性。設定測量正常肝組織及病灶選取的ROI面積范圍約為0.5～2.0 cm2，每個ROI測量3次后取平均值，用2名醫師測量結果的平均值作為最終測量值。測量以下數據：（1）平掃（pre-enhancement, pre）、動脈期（arterial phase, AP）、門脈期（the portal venous phase, PP）、平衡期（equilibrium phase, EP）及肝膽期（hepatobiliary phases, HBP）的腫瘤與同一肝段的正常肝組織的SI，計算腫瘤-正常肝實質信號強度比[16-17]（tumor to liver contrast ratio, TLR）及對比強化比（contrast enhancement ratio, CER），TLR=SI腫瘤/SI肝臟，CER=（TLR增強后-TLR平掃）/TLR平掃。（2）在T1 mapping 測量病灶平掃T1 弛豫時間（T1 relaxation time, T1rt-Pre）、肝膽期T1弛豫時間（T1 relaxation time, T1rt-20min），計算T1 弛豫時間減低率（reduction rate of T1 relaxation time, rrT1rt），rrT1rt-20min=[（T1rt-Pre）-（T1rt-20min）]/T1rt-Pre。

1.4 病理分析

所有組織標本均在我院病理科進行切片、蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining, HE）以及免疫組化Ki-67 特殊染色。在不知道影像學征象的情況下，由兩名高年資病理科醫師獨立觀察，病理結果有異議時協商達成一致意見。對Ki-67的判定：在高倍顯微鏡（×400）下取5 個FOV，每個FOV 計數100 個細胞，并計數腫瘤內的熱點區域[細胞核出現棕褐（黃）色顆粒]，Ki-67 認定為陽性細胞占總細胞的百分比，取其平均值。由于Ki-67的表達多為同質性，故以陽性染色細胞的百分比進行評分[18-19]，并分為兩組：≤25%為Ki-67 低表達組、＞25%為Ki-67 高表達組。

1.5 統計學分析

使用Windows 的SPSS 22.0 版進行統計學分析，采用Kolmogorov-Smirnov 方法檢測樣本是否符合正態分布。符合正態分布的計量資料以（xˉ±s）表示，不符合正態分布的計量資料用中位數（四分位間距）表示。采用組內相關系數（inter-class correlation coefficient, ICC）評價2 名醫師測量結果的一致性（ICC＞0.75認為具有良好的一致性，0.65～0.75認為一致性一般，ICC＜0.65則認為一致性差）。MRI各定量參數與Ki-67 之間相關性比較采用Spearman 相關系數。Ki-67高、低表達組間比較采用獨立樣本t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。根據受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線下面積（area under the curve, AUC），敏感度、特異度、Youden指數（特異度+敏感度-1）、臨界值（cut-off值）評估各參數在Ki-67高、低表達組間的診斷效能。采用DeLong 檢驗比較各參數曲線下面積AUC 值的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病例入組及分組

最終納入74 例患者病例，男65 例、女9 例，年齡30～84（59.69±10.57）歲。Ki-67≤25%組男33 例，女7 例，年齡（60.9±11.2）歲，肝功能Child-Pugh 評分A 級36 例、B 級4 例；Ki-67＞25%組男32 例，女2例，年齡（58.2±9.7）歲，肝功能Child-Pugh評分中A 級32 例，B 級2 例。本研究中性別、年齡、肝功能Child-Pugh評分在兩組間的差異無統計學意義（P值分別為0.166、0.278、0.518）。

2.2 2名醫師測量結果的一致性

2 名 醫 師 測 量T1rt-Pre、T1rt-20min、TLR-Pre、TLR-AP、TLR-PP、TLR-EP、TLR-HBP 的ICC 分別為0.839（95%CI：0.717～0.912）、0.849（95%CI：0.732～0.917）、0.817（95%CI：0.681～0.899）、0.781（95%CI：0.623～0.878）、0.796（95%CI：0.647～0.887）、0.831（95%CI：0.702～0.907）、0.807（95%CI：0.662～0.887）。2名醫師測量間的一致性較好。

2.3 Gd-EOB-DTPA 增強MRI 定量參數與Ki-67 的相關性分析

T1rt-Pre、T1rt-20min 與Ki-67 呈 強 正 相 關[r=0.668（95%CI：0.515～0.780），r=0.659（95%CI：0.494～0.784），P均＜0.001]（圖1）；TLR-Pre、TLR-HBP與Ki-67呈中等程度負相關[r=-0.495（95%CI：-0.647～-0.300），r=-0.497（95%CI：-0.670～-0.288），P均＜0.001]；TLR-PP、TLR-EP與Ki-67呈弱負相關[r=-0.272（95%CI：-0.483～-0.035）,P=0.019；r=-0.362（95%CI：-0.568～-0.142），P=0.002]。其余參數差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

圖1 T1 弛豫時間（T1rt-Pre、T1rt-20min）與Ki-67 相關性散點圖。 圖2 男，48 歲，肝細胞癌（2 級），Ki-67 低表達。2A：T1rt-Pre 橫斷面，T1rt-Pre=（958.0±43.5）ms；2B：T1rt-20min 橫斷面，T1rt-20min=（513.3±21.4）ms；2C：Ki-67 免疫組化染色（×400），Ki-67 約為10%。 圖3 男，47 歲，肝細胞癌（3 級），Ki-67 高表達。3A：T1rt-Pre 橫斷面，T1rt-Pre=（1504.6±90.5）ms；3B：T1rt-20min 橫斷面，T1rt-20min=（854.9±36.6）ms；3C：Ki-67 免疫組化染色（×400），Ki-67約為50%。T1rt-Pre：MRI T1 mapping平掃T1弛豫時間；T1rt-20min：釓塞酸二鈉增強MRI T1 mapping肝膽期T1弛豫時間。Fig. 1 Scatter plot of correlation between T1 relaxation time (T1rt-Pre, T1rt-20min) and Ki-67. Fig. 2 Male, 48-year-old, hepatocellular carcinoma grade 2, low expression of Ki-67. 2A: Cross section of T1rt-Pre, T1rt-Pre=(958.0±43.5) ms; 2B: Cross section of T1rt-20min, T1rt-20min=(513.3±21.4) ms; 2C: Pathological immunohistochemical Ki-67 (×400), Ki-67 was about 10%. Fig. 3 Male, 47-year-old, hepatocellular carcinoma grade 3, high expression of Ki-67. 3A: Cross section of T1rt-Pre,T1rt-Pre=(1504.6±90.5)ms;3B:Cross section of T1rt-20min,T1rt-20min=(854.9±36.6)ms;3C:Pathological immunohistochemical Ki-67(×400), Ki-67 was about 50%. T1rt-Pre: T1 relaxation time of unenhanced MRI T1 mapping; T1rt-20min: T1 relaxation time in the hepatobiliary phase with Gd-EOB-DTPA enhanced MRI T1 mapping.

表1 釓塞酸二鈉增強MRI定量參數與Ki-67相關性Tab.1 Correlation between quantitative parameters of Gd-EOB-DTPA MRI and Ki-67

2.4 Ki-67低、高表達組間比較及診斷效能分析

本研究中Ki-67 低、高表達組間T1rt-Pre、T1rt-20min、TLR-Pre、TLR-AP、TLR-EP、TLR-HBP 差異均具有統計學意義（P均＜0.05），其他參數差異無統計學意義（P均＞0.05）（表2）。研究所示Ki-67低表達組表現為較小的T1rt-Pre、T1rt-20min（圖2），Ki-67 高表達組表現為較大的T1rt-Pre、T1rt-20min（圖3）。T1rt-Pre、T1rt-20min、TLR-Pre、TLR-AP、TLR-EP、TLR-HBP的AUC值分別為0.868（95%CI：0.769～0.936）、0.890（95%CI：0.795～0.951）、0.717（95%CI：0.670～0.869）、0.646（95%CI：0.527～0.754）、0.680（95%CI：0.561～0.784）、0.782（95%CI：0.670～0.869）（P均＜0.05）（表3）。結果表明T1rt-Pre、T1rt-20min具有較高的診斷效能，臨界值分別為1278.73、724.5 ms（圖4），利用DeLong檢驗兩兩比較結果表明T1rt-Pre、T1rt-20min 分別與TLR-Pre、TLR-AP、TLR-EP的AUC值差異具有統計學意義（P均＜0.05），而與TLR-HBP 差異無統計學意義（P＞0.05）（表4）。

圖4 T1rt-Pre、T1rt-20min、TLR-Pre、TLR-AP、TLR-EP、TLR-HBP 的ROC曲線。T1rt-Pre：MRI T1 mapping平掃T1弛豫時間；T1rt-20min：釓塞酸二鈉增強MRI T1 mapping肝膽期T1弛豫時間；TLR：腫瘤-正常肝實質信號強度比；Pre：平掃；AP：動脈期；EP：平衡期；HBP：肝膽期。Fig.4 ROC curves of T1rt-Pre,T1rt-20min,TLR-Pre,TLR-AP,TLR-EP,TLR-HBP. T1rt-Pre: T1 relaxation time of unenhanced MRI T1 mapping;T1rt-20min: T1 relaxation time in the hepatobiliary phase with Gd-EOB-DTPA enhanced MRI T1 mapping; TLR: tumor to liver contrast ratio; Pre: pre-enhancement; AP: arterial phase; EP: equilibrium phase;HBP:hepatobiliary phases.

表2 兩組間定量參數比較分析Tab.2 Comparative analysis of quantitative parameters between two groups

表3 兩組間定量參數診斷效能分析Tab.3 Analysis of diagnostic efficacy of quantitative parameters between two groups

表4 各參數間AUC值兩兩比較（Z/P值）Tab.4 Pairwise comparison of AUC values between parameters(Z/P value)

3 討論

本研究探討了Gd-EOB-DTPA T1 mapping 定量參數與Ki-67的相關性，并將Ki-67為分高、低表達組進行組間比較，分析各參數的診斷效能及曲線下面積的差異。研究表明Gd-EOB-DTPA 增強MRI T1 mapping所測的T1rt-Pre、T1rt-20min與HCC Ki-67表達具有較強的正相關性，且T1rt-Pre、T1rt-20min 對HCC Ki-67 表達具有較高的評估價值，要優于基于信號強度比的定量參數。本研究結果證明T1 mapping具有術前無創地預測Ki-67表達的潛在價值，能為HCC患者術前手術方案的制訂起到積極的作用。

3.1 各定量參數與Ki-67的相關性

本研究結果表明T1rt-Pre、T1rt-20min與Ki-67具有較強的正相關性，TLR-Pre、TLR-HBP 與Ki-67 呈中等程度負相關，TLR-PP、TLR-EP 與Ki-67 呈弱負相關，而CER 參數差異無統計學意義。Chen等[20]研究結果中的T1rt-Pre、T1rt-20min與Ki-67相關性與本研究結果相一致，但其研究結果中的SI-Pre、SI-HBP與Ki-67相關性高于本研究的TLR-Pre、TLR-HBP。為了使所測數值相對準確，本研究采用TLR=SI腫瘤/SI肝臟的方法測量，該方法可以降低肝臟背景的干擾，因此，本研究結果更具可靠性。而且，T1 mpping反映的是組織的固定特征，不受掃描序列參數限制，且與組織中的釓對比劑的濃度成正性相關[21-22]。而SI 是相對數值，機器與掃描參數的不同均會影響SI的大小，且與對比劑濃度不呈線性關系。因此，T1 mapping 值比信號強度比值更加準確[23-24]。

3.2 Ki-67高、低表達組間比較及診斷效能分析

本研究多期增強掃描得出的TLR-Pre、TLR-AP、TLR-EP組間比較差異具有統計學意義，但診斷效能偏低，而肝膽期TLR-HBP診斷效能相對較高。該結果與既往相關研究結果相一致。姜虹等[25]研究表明基于動脈期得出的SI的診斷效能偏低，而肝膽期得出的信號強度增強比診斷效能較高。同樣，Ye等[16]研究也表明肝膽期的TLR具有較高的診斷效能。胡夢潔等[26]的研究也得出肝膽期的信號強度比是Ki-67高表達的獨立預測因子。導致這一現象的可能原因在于Gd-EOB-DTPA是一種肝膽特異性MRI對比劑，可通過OATP途徑被肝細胞吸收，具有雙重的細胞外和肝膽特性，可以提供功能性和結構性的肝膽期信息[27-29]。不同于上述研究，本研究還發現，Gd-EOB-DTPA 結合T1 mapping（T1rt-Pre、T1rt-20min）具有更高的診斷價值，其AUC值與TLR-Pre、TLR-AP、TLR-EP差異具有統計學意義，其中T1rt-20min診斷效能最高，AUC 值與TLR-HBP 差異雖然無統計學意義，但其特異度有明顯的提高。T1rt-Pre 的診斷效能與T1rt-20min 相仿，同樣具有較高的敏感度及特異度，可見Ki-67 高表達的HCC 組織中具有更長的T1弛豫時間[16,20]。導致這一結果的可能原因在于：其一，當腫瘤細胞增殖越活躍，其單位體積內腫瘤細胞排列更緊密，從而導致T1rt-Pre 值越大；其二，當腫瘤細胞增殖越活躍，腫瘤中含有的正常肝細胞比例越低，那么Gd-EOB-DTPA 吸收也隨之減少，從而導致T1rt-20min值越大。

3.3 本研究的局限性

本研究具有一些局限性。（1）本研究為回顧性研究且樣本量相對較少，可能存在選擇性偏倚；（2）目前Ki-67 分組仍未有統一標準，各研究存在差異，故需要多中心大樣本研究不同分組的差異，比較不同分組的診斷效能；（3）ROI 為手動勾畫，可能存在測量誤差；（4）本研究未考慮肝內多發病灶的影像圖像與病理圖像一一對應，而多發性肝癌臨床并不少見，因此，在后續前瞻性研究中，我們將聯合肝膽外科、病理科進一步精準匹配病理影像結果。

綜上所述，本研究表明Gd-EOB-DTPA 增強MRI T1 mapping 所測的T1rt-Pre、T1rt-20min 與HCC Ki-67 表達具有較強的正相關性，且T1rt-Pre、T1rt-20min 在Ki-67高、低表達組間的診斷效能較高，對HCC Ki-67表達具有較好的評估能力。

作者利益沖突聲明：全部作者均聲明無利益沖突。