臭氧聯合紫外線對GMP潔凈實驗室消毒的效果評價

陳曉燕，錢師宇，曾彩輝，盧建溪

1.中山大學附屬第三醫院生物治療中心，廣東 廣州 510000；2.暨南大學公共衛生學院，廣東 廣州 510000

環境消毒對于保障藥品生產質量管理規范（good manufactursing practice,GMP）層流實驗室生物安全，保護實驗人員健康，保證實驗正常進行至關重要[1]。GMP層流實驗室的核心是安全，采取安全、有效消毒滅菌是實驗室生物安全的重要保障[2]。GMP層流實驗室的空氣質量指標物主要是塵埃顆粒物（particulate matter,PM）浮游菌，也籠統稱之為微生物氣溶膠。全球超過20%的呼吸道感染是由微生物氣溶膠引起的，微生物氣溶膠能引起呼氣困難、頭暈、頭痛等病癥，對人體健康具有極大影響[3]。此外，進行細胞體外培養的首要條件是無菌環境，細胞在體外培養對微生物的防御能力匱乏，極易被污染，為其提供無菌的生存和操作環境是順利進行實驗的重要保證[4]。消除環境中的病原微生物、控制室內微生物含量非常重要，除了常用化學消毒液擦拭消毒的表面消毒方法，還有很多空氣消毒方式，如臭氧(O3)、紫外線、二氧化氯、過氧化氫、過濾通風、氣體 熏蒸、光催化等，其中臭氧和紫外線消毒應用于空氣和表面消毒最為廣泛[5]。本研究利用臭氧聯合紫外線對GMP層流實驗室進行消毒，并對消毒效果進行驗證觀察。報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

9 cm血瓊脂平板（江門凱林），紫外線殺菌燈（工作壓力為220 V、功率＞30 W、輻照強度≥70 μW/cm2），臭氧消毒機。

1.2 試驗方法

1.2.1 觀察場地 中山大學附屬第三醫院生物治療中心，GMP潔凈實驗室

1.2.2 觀察時間2021年1—12月GMP潔凈實驗室潔凈空調運行期間并臭氧聯合紫外線消毒，每個月月末布放一次血瓊脂平板做沉降菌檢測；2022年1月暫停潔凈空調和臭氧聯合紫外線消毒，更換初、中、高效濾芯兩周后布放一次血瓊脂平板做沉降菌檢測。

1.2.3 消毒 紫外線消毒：2021年1—12月每天兩次（中午12∶00-12∶30和晚上12∶00-12∶30），時長30 min。臭氧消毒：2021年1—12月每周3次（一、三、五晚上12∶00-凌晨1∶30），時長90 min。

1.2.4 采樣 用直徑9 cm血瓊脂平板，在室內應用自然沉降法進行采樣，平板采樣的位置為室內距墻1 m處四角，距地面1 m處。本中心GMP潔凈實驗室分為正壓潔凈室和負壓潔凈室，正壓潔凈室共計14個采樣布防點：一更、二更、緩沖室1、緩沖室2、緩沖室3、脫衣室、潔具室1、潔具室2、細胞培養室二、細胞培養室三、暫存室、儲存室、潔凈走廊二、潔凈走廊三；負壓潔凈室共計8個采樣布防點：一更、二更、緩沖室1、緩沖室2、緩沖室3、細胞培養室一、脫衣室、廢物處理室。其中細胞培養室因面積較大，需布放5個血平板，室內距墻1 m處四角和室內正中央。其他室各布放兩個血平板，共采集53份樣品。采樣時將平皿打開扣放在平板旁，暴露5 min，蓋好立即將平板置于37℃保溫箱培養48 h，計數每平板上菌落數，≤3 CFU/平板判定合格。

采樣方法和監測評價標準依據1998版藥品生產質量管理規范。

1.3 統計方法

采用Excel和Prism6對數據進行錄入、整理和繪制。

2 結果

2021年臭氧聯合紫外線對GMP層流實驗室連續消毒運行12個月，每個月月末布放一次血瓊脂平板做沉降菌檢測，經過12個周期重復試驗結果顯示（見表1），布放在負壓潔凈室的8個采樣點均未檢測到沉降菌落。布放在正壓潔凈室的14個采樣點，在2、8、9、12月個別采樣點可見1～2 CFU/平板。其中2月份，緩沖室2的平均菌落數為1 CFU/平板；細胞培養室二的平均菌落數為0.4 CFU/平板；潔凈走廊二的平均菌落數為0.4 CFU/平板。而8月份的細胞培養室二的平均菌落數為0.2 CFU/平板。9月份二更的平均菌落數為0.5；緩沖室1 CFU/平板的平均菌落數為0.5 CFU/平板。12月份的一更的平均菌落為1.5 CFU/平板；緩沖室3的平均菌落數為1 CFU/平板；脫衣室的平均菌落數為1 CFU/平板；潔具室2的平均菌落數為0.5 CFU/平板。可見菌落皆≤3 CFU/平板（見圖1），判定合格，每月采集的53份樣本合格率均為100%。

而2022年1月暫停潔凈空調和臭氧聯合紫外線消毒，更換初、中、高效濾芯兩周后布放一次血瓊脂平板做沉降菌檢測，此次布放除了正壓潔凈室的暫存室和潔凈走廊二、負壓的二更無菌落，其他各采樣點都可見菌落生長。其中，負壓潔凈室的緩沖室3平均菌落數為4 CFU/平板，負壓潔凈室的脫衣室平均菌落數為3.5 CFU/平板（見表1），可見菌落皆＞3 CFU/平板（見圖1），判定為不合格，此次布放采樣合格率為90%。

圖1 GMP潔凈實驗室各采樣點菌落數

表1 臭氧聯合紫外線對GMP潔凈實驗室每個月消毒效果（CFU/平板）

續表1

3 討論

GMP在國際上已成為藥品生產和質量管理的基本準則，是一套系統的、科學的管理制度，藥品不僅要符合質量標準，而且其生產全過程必須符合GMP規定[6]。GMP規范定義了ABCD 4個潔凈度等級，對于不同潔凈度等級，要求空氣中含有的懸浮粒子、微生物數量都是嚴格規定不同的上限數值，本實驗室根據《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》規定設立GMP層流實驗室，屬于A+B級實驗室，環境要求B級[7-8]。通過對空調、送排風系統、工作區與緩沖間的壓差嚴格要求，以及定時定點進行消毒滅菌，保證空氣潔凈度，達到GMP基本要求[9]。

紫外線是一種低能量電磁輻射，照射菌體后引起原生質變化或死亡達到消毒滅菌的作用[9]，紫外線是臨床常用的綠色、成本低的空氣消毒方法。但紫外線的照射能量僅有5 ev，穿透性差，消毒有死角、殺菌持效短，其效果還受到照射時間、消毒距離、溫度、濕度、燈管清潔等多方面因素的影響，因此其在臨床中的應用受到限制[10]。臭氧是一種強氧化劑和催化劑，能氧化分解細菌內部葡萄糖所需的酶，破壞它們的細胞器和DNA、RNA，破壞細菌新陳代謝，使細菌發生畸變、滅活死亡[10]。其對細菌繁殖體、病毒、芽孢、真菌等多種微生物，具有較強的除霉、除臭功能，殺菌起效快、持久，殺菌徹底無死角、無殘留污染，同時更廣譜，但臭氧穩定性差，具有一定毒性[11]。兩者聯合使用，既利用紫外線消毒簡便、價格便宜可多次消毒，保證每次實驗后都可以達到及時消毒滅菌，又利用臭氧廣譜殺菌、殺菌無死角等特點，提高實驗室空氣消毒的效率和質量[12]。本研究于2021年1—12月GMP潔凈實驗室潔凈空調運行期間，采用臭氧聯合紫外線消毒，于每天上、下午實驗結束，人員離開后于中午和晚上采用紫外線消毒30 min，同時每周3次每兩天晚上臭氧消毒90 min，對GMP層流實驗室空氣和實驗臺面、桌椅、器皿等表面進行徹底消毒。消毒效果評價是通過在月末定時定點布放血瓊脂平板進行沉降菌檢測驗證消毒滅菌效果，結果顯示，布放在負壓潔凈室的8個采樣點未見菌落，布放在正壓潔凈室的14個采樣點偶見菌落，但可見菌落皆≤3 CFU/平板，判定合格，合格率均達到100%，表明臭氧聯合紫外線消毒可有效滿足消毒要求。2022年1月GMP潔凈實驗室潔凈空調停止運行、消毒，更換初、中、高效過濾器兩周后，布放血瓊脂平板做沉降菌檢測，布放在負壓潔凈室的2個采樣點可見菌落＞3 CFU/平板。雖然，GMP潔凈實驗室由于更換濾芯和空調維護暫停兩周，期間有工人進出實驗室，但由于實驗室長期臭氧聯合紫外線消毒，實驗室仍然相對潔凈，僅有兩個采樣點可見菌落超標，此次布放采樣合格率為90%，可見臭氧聯合紫外線消毒功效的持久性[13]。

綜上所述，臭氧聯合紫外線消毒，操作簡單，消毒滅菌更徹底，而且避免了因擾動所產生的二次污染，對GMP層流實驗室具有很好的消毒作用，建議在實驗室空氣消毒中廣泛使用。