聚乙烯亞胺穩定聚吡咯納米顆粒的制備及其光熱抗菌性能研究*

王 燕，Gnanasekar Sathishkumar，Kasi Gopinath，何曉東，張 凱，徐立群

( 西南大學 材料與能源學院，重慶 400715)

0 引 言

自亞歷山大·弗萊明在1928年發現了第一種抗生素-盤尼西林以來，科學家發現了成千上萬種抗生素。抗生素對醫學持續發揮作用，并挽救無數感染者的生命。由于抗生素被人類濫用和誤用，導致了細菌產生耐藥性，制造出另其束手無策的“超級細菌”。為了減少抗生素藥物的使用和治療耐藥菌引起的細菌感染，迫切需要開發新的抗菌療法[1-]。在過去幾十年里，研究人員已經發明了一些不依賴抗生素的治療細菌感染策略，如光動力抗菌療法(aPDT)和光熱抗菌療法(aPTT)[3-4]。然而，革蘭氏陰性菌所特有的外膜屏障會削弱aPDT 產生的活性氧對其結構和功能的破壞作用，所以aPDT 對革蘭氏陰性菌的殺滅效果不是很理想[5]。不同于aPDT，aPTT主要是通過光熱劑吸收近紅外光產生的局部高溫使細胞膜破裂和蛋白質/酶變性從而致病原菌死亡[6-7]，所以其對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有很好的殺滅效果[8]。aPTT具有無創、高效等特點[9-11]，使用的近紅外光源(NIR，通常為700～1 300 nm)對組織的穿透能力可達幾厘米，并且對人體的正常組織器官影響較小[12]。目前為止，已經開發的光熱劑包括金屬基納米材料[13-14]、碳基材料[15-16]和有機高分子納米材料[17-18]等。在這些光熱劑中，共軛聚合物由于其優異的光穩定性、光熱轉換效率、生物相容性和合成方法簡便等優點而備受研究關注[18]。

Ko等[19]報道了一種由聚(3,4-亞乙二氧噻吩)：聚(苯乙烯磺酸)(PEDOT:PSS)和瓊脂糖組成的光熱納米復合材料，其在近紅外光照射2 min內幾乎可以殺滅全部的致病菌。魯雄教授課題組[20]報道了一種具有近紅外光響應性的聚多巴胺納米顆粒修飾的殼聚糖/絲素凝膠，該凝膠具有光熱殺菌效果并能促進傷口愈合。Tondro等研究發現，用808 nm近紅外光照射聚吡咯(PPy)包覆的碳納米管能夠破壞細菌膜和導致細菌死亡[21]。聚吡咯是一種常見的有機共軛聚合物，因其優異的光熱轉化效率、光穩定性和生物相容性，而被廣泛地應用在光熱療法領域[22-24]。然而，聚吡咯本身在水溶液中的分散性較差[25]，需加入穩定劑才能獲得水溶液分散的聚吡咯納米顆粒[26]。聚乙亞胺(PEI)是一種水溶性聚合物，可用作合成聚吡咯納米顆粒的穩定劑[27-28]，從而得到聚吡咯-聚乙亞胺納米顆粒(PPy-PEI NPs)。因此，本研究旨在合成水溶液分散的PPy-PEI NPs，并將其用于光熱抗菌療法以殺滅革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及耐藥菌株(圖1)。

圖1 PPy-PEI NPs的合成路線及其光熱抗菌作用過程Fig.1 Synthesis route and photothermal antibacterial action of PPy-PEI NPs

1 實 驗

1.1 實驗試劑

吡咯:上海泰坦科技股份有限公司；PEI (Mw=800)：上海 Sigma-Aldrich 有限公司；無水三氯化鐵：北京百靈威科技有限公司；聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)：道康寧Sylgard 184硅橡膠固化而成；E.coli(CMCC 44102)和P.aeruginosa(CMCC 10104)：中國醫學細菌保藏管理中心；S.aureus(ATCC 25923)和MRSA(ATCC 33592)：美國標準培養物保藏中心。

1.2 PPy-PEI NPs的制備

往100 mL去離子水中加入1.0 g PEI和400 μL蒸餾提純的吡咯單體，用稀鹽酸調節pH 值至 1，再加入2 mL濃度為 7.5 mg/mL的FeCl3溶液反應15 min，最后用去離子水透析24 h，得到PPy-PEI NPs。將吡咯單體的用量改為600和800 μL并重復上述步驟，得到不同吡咯含量的PPy-PEI NPs。將吡咯添加量為400，600和800 μL的PPy-PEI NPs分別命名為s1、s2和s3。

1.3 PPy-PEI NPs的理化和抗菌性能測試

1.3.1 表征測試儀器

馬爾文納米粒度電位儀(Nano ZS90, Malvern Instruments)：測量樣品的水合粒徑和Zeta電位；掃描電子顯微鏡(SEM，日本電子，JSM-7800F)和透射電子顯微鏡(TEM，德國蔡司，Libra 200 FE)：研究樣品的形狀和尺寸。紫外-可見分光光度計(日本島津，UV-2550)：測試樣品的紫外-可見吸收光譜。

1.3.2 光熱性能測試

采用功率密度為2 W/cm2的808 nm近紅外激光(鐳志威，LWIRL808)對不同濃度的樣品溶液光照10 min，用紅外熱像儀(福祿克，TiS55)記錄溶液溫度隨時間的變化并作圖研究PPy-PEI NPs的光熱性能。對2 mg/mL PPy-PEI NPs溶液先升溫10 min再降溫15 min，此過程循環3次以研究樣品的光熱循環性能。

1.3.3 光熱抗菌性能測試

生長曲線法：用去離子水將細菌懸液稀釋至濃度為1×105cells/mL。細菌溶液與濃度2 mg/mL的PPy-PEI NPs溶液以1∶2的體積比混合，并在37 ℃培養箱中培養1 h。培養結束后，取一半混合液用功率密度為2 W/cm2的808 nm近紅外光照射10 min，另一半不做光照處理。取100 μL的細菌樣品混合液與2 mL Mueller-Hinton肉湯(MHB)培養基混合，振蕩搖勻后往96孔板每孔中加入200 μL，置于37 ℃培養箱中培養，用酶標儀(BioTek Instruments, ELX800)記錄每個孔吸光度(OD)隨時間變化。以去離子水替代PPy-PEI NPs溶液作為空白對照。

涂布平板法：在生長曲線實驗中，取100 μL光照/未光照的樣品和細菌混合液滴加到胰酪大豆胨肉湯(TSB)瓊脂培養皿，用一次性涂布棒涂布均勻，放入37 ℃培養箱中培養過夜。對培養皿拍照比較并統計菌落數，以評價PPy-PEI NPs的光熱殺菌效果。

1.4 PPy-PEI NPs的光熱抗菌機理研究

將濃度為1.0×106cells/mL的細菌溶液與尺寸為1 cm×1 cm的PDMS片材在37 ℃培養箱共培養24 h，吸除細菌懸液并用去離子水清洗一次，加入500 μL濃度為2 mg/mL的PPy-PEI NPs水溶液，在37 ℃培養箱中再培養1 h。用功率密度為2 W/cm2的808 nm近紅外光照射24孔板中的PDMS片材10 min，再用2.5%(質量分數)戊二醛水溶液固定30 min，最后用25%,50%,75%和100%的乙醇水溶液進行梯度脫水，每個梯度脫水處理10 min。樣品自然干燥后用SEM觀察細菌的形貌。

2 結果與討論

2.1 PPy-PEI NPs的形貌和理化性質

在酸性環境中，PEI的部分氨基官能團與Fe3+離子形成絡合物，吡咯與PEI- Fe3+配合物接觸并在相應的位點發生氧化聚合反應從而形成PPy-PEI NPs。親水性PEI可以為PPy-PEI NPs提供空間保護，得到水溶液分散的聚吡咯納米顆粒[29]。圖2(a)是s1、s2和s3樣品的水合粒徑。400，600和800 μL吡咯合成的PPy-PEI NPs樣品的水合粒徑分別為(80.8±1.8)，(103.2±1.1)和(112.2±0.7)nm。實驗結果表明吡咯的用量直接影響到合成的PPy-PEI NPs大小，添加800 μL吡咯合成的s3樣品具有最大的水合粒徑。如圖2(b)所示，s1、s2和s3的Zeta電位分別為(41.2±1.9)，(40.9±1.6)和(44.2±2.1)mV。因為PPy-PEI NPs表面含有大量的氨基官能團，所以其表面電荷呈電正性。由于s3樣品中聚吡咯含量最高，接下來將重點研究其光熱效果和殺菌性能。

圖2 s1、s2和s3樣品在去離子水中的(a)水合粒徑和(b)Zeta電位Fig.2 Hydration particle sizes and Zeta potentials of the s1, s2, and s3 samples in deionized water

圖3為s1、s2和s3樣品的SEM和TEM圖像。從SEM圖像可以看出，不同吡咯含量的樣品呈現不規則球形，且存在顆粒堆積現象。由于PPy-PEI NPs樣品粒徑較小，比表面積較大，表面自由能高，所以SEM圖像中的納米顆粒發生團聚以降低自由能。從TEM圖像上看，s1、s2和s3樣品的粒徑約為20 nm。與水合粒徑相比，SEM和TEM圖像中的樣品粒徑較小。這有可能是樣品在水溶液中溶脹，而在電鏡制樣干燥過程中收縮導致粒徑減少[30]。

圖3 s1、s2和s3樣品對應的(a-c)SEM和(d-f)TEM圖像Fig.3 (a)-(c) SEM images and (d)-(f) TEM images of s1, s2 and s3 samples

圖4(a)為近紅外照射前后PPy-PEI NPs的紫外-可見吸收光譜。如圖所示，PPy-PEI NPs水溶液在283和304 nm之間有一個吸收峰，對應吡咯環的π→π*吸收峰。在424和524 nm范圍內有一個弱吸收，有可能歸因于聚吡咯的極化子或雙極化子狀態[31-32]。在近紅外照射后，PPy-PEI NPs的吸收光譜未發生明顯的變化，仍保留了原始特征峰。此外，在經歷3次光照升溫-冷卻循環后，PPy-PEI NPs水溶液的水合半徑也沒有發生明顯的改變(圖4(b))。以上結果說明PPy-PEI NPs具有很好的光穩定性。圖4(c)為在近紅外激光(808 nm, 2 W/cm2)照射下PPy-PEI NPs溶液和去離子水的升溫曲線。與單獨的去離子水相比，PPy-PEI NPs水溶液具有較明顯的溫度變化。當光照10 min后，2 mg/mL的PPy-PEI NPs水溶液溫度可達到61.8 ℃(ΔT=37.3 ℃)，而在相同條件下純水僅能升溫至26.2 ℃(ΔT=1.8 ℃)。有研究表明，當周圍環境溫度達到50 ℃時，細菌的酶或蛋白質會因變性而失去活性，從而導致細菌死亡[33]。因此，PPy-PEI NPs水溶液的光熱效應足夠殺死溶液中的細菌。經過3次光照升溫和冷卻循環后(圖4(d))，PPy-PEI NPs水溶液的升溫趨勢沒有變化，說明該光熱劑具有良好的光熱循環性能。

圖4 在近紅外照射前后PPy-PEI NPs水溶液的(a)紫外-可見吸收光譜和(b)粒徑分布；(c)在近紅外照射下不同濃度的PPy-PEI NPs水溶液的升溫曲線；(d)濃度為2 mg/mL的PPy-PEI NPs水溶液升溫降溫循環曲線Fig.4 (a) UV-visible absorption spectra and (b) hydrodynamic particle size of PPy-PEI NPs before and after NIR irradiation; (c) temperature responses of PPy-PEI NPs aqueous solutions with different concentrations upon NIR irradiation; (d) temperature profiles of 2 mg/mL PPy-PEI NPs aqueous solution during three heating and cooling cycles

2.2 PPy-PEI NPs的抗菌性能測試

因為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞膜中分別含有磷壁酸和脂多糖等帶負電化合物[34]，在中性pH環境中細菌的表面整體呈現負電荷。如圖5所示，S.aureus和E.coli的Zeta電位分別為(-23.1±0.4)和(-24.1±0.3)mV。然而，與PPy-PEI NPs混合后，S.aureus和E.coli的Zeta電位分別增至(28.7±2)和(26.3±0.8)mV。顯然，帶正電荷的PPy-PEI NPs通過靜電吸附作用與帶負電荷的細菌結合[35]。PPy-PEI NPs在細菌表面的富集有可能增強其光熱抗菌效果。

圖5 細菌、PPy-PEI NPs及其混合物的Zeta電位Fig.5 Zeta potentials of bacteria, PPy-PEI NPs, and their mixtures

用生長曲線法測定PPy-PEI NPs在光照情況下對細菌生長的抑制作用。將革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌與PPy-PEI NPs水溶液混合，接著進行近紅外光照處理，然后將細菌與PPy-PEI NPs混合液加入到MHB培養基中，最后轉移至96孔板并放入37 ℃恒溫培養箱中培養。在不同的時間間隔內，測定96孔板每孔的OD值并繪圖，結果如圖6(a)-(d)所示。在對照實驗中，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長方式相同，出現典型的滯后期、對數期和穩定期。與PPy-PEI NPs混合后，革蘭氏陽性菌的生長未受到影響，而革蘭氏陰性菌的生長受到輕微抑制。因此，表面呈電正性的PPy-PEI NPs對革蘭氏陰性菌有一定的抗菌性能。在808 nm近紅外輻照下，2 mg/mL的PPy-PEI NPs水溶液能完全抑制S.aureus和MRSA以及E.coli和P.aeruginosa的生長。在近紅外光照射下，PPy-PEI NPs對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均表現出較強的光熱抗菌效果。

圖6 在近紅外照射或不照射下(a)S. aurues、(b)MRSA、(c)E. coli和(d)P. aeruginosa與2 mg/mL的PPy-PEI NPs水溶液或去離子水共培養的生長曲線Fig.6 The growth curves of (a) S. aureus, (b) MRSA, (c) E. coli, and (d) P. aeruginosa with PPy-PEI NPs aqueous solution (2 mg/mL) or DI water (control) in the presence or absence of NIR irradiation

上述生長曲線法定性地說明了PPy-PEI NPs的抗菌性能，涂板計數法被用來定量評價PPy-PEI NPs的光熱抗菌效果。E.coli或S.aureus與PPy-PEI NPs水溶液共培養1h，再用近紅外光照射10 min，將菌液涂布于TSB瓊脂培養皿上。如圖7(a)所示，細菌與單獨的去離子水(或PPy-PEI NPs水溶液)混合物在瓊脂板上形成大量菌落。在近紅外激光輻照下，細菌與去離子水混合物接種的瓊脂板仍覆蓋著大量菌落，而細菌與PPy-PEI NPs混合溶液涂布的瓊脂板幾乎沒有菌落。從統計的菌落數量來看(圖7(b)、(c))，PPy-PEI NPs和近紅外光共同處理的E.coli和S.aureus數量與其它組別的活菌菌落數量有顯著性差異。涂板計數法實驗證明：在近紅外光照射下PPy-PEI NPs對E.coli和S.aureus具有較強的光熱抗菌效果。

圖7 (a)在808 nm近紅外照射(L+)/不照射(L-)的情況下，細菌與去離子水(或PPy-PEI NPs)混合溶液接種的TSB瓊脂培養皿；瓊脂板上(b)S. aureus和(c)E. coli的菌落數量(n=3, p<0.001)Fig.7 (a) TSB-agar plates inoculated with bacteria (S. aureus or E. coli) and deionized water (or PPy-PEI NPs) solution mixture in the absence (or presence) of 808 nm NIR irradiation; the numbers of live (b) S. aureus and (c) E. coli on the TSB-agar plates (n=3, p<0.001)

2.3 PPy-PEI NPs的抗菌機理

通過SEM觀察細菌與PPy-PEI NPs作用前后的形貌變化。如圖8所示，光照或未光照的空白組細菌結構完整。與PPy-PEI NPs溶液共培養后，PPy-PEI NPs可通過靜電作用附著在細菌表面。S.aureus仍然保持著完整的形狀，但部分E.coli的細菌膜結構已被破壞。在生長曲線實驗中，未光照的PPy-PEI NPs對E.coli具有適度的抗菌活性(圖6(c))，SEM觀察驗證了這一結論。對于PPy-PEI NPs共培養并結合光照處理的細菌，其細菌膜發生破裂，且破壞程度較高。這些結果表明，PPy-PEI NPs能夠通過破壞細菌膜結構而達到對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的廣譜光熱殺菌效果。

圖8 在808 nm近紅外照射(L+)/不照射(L-)的情況下，S. aureus和E. coli與PPy-PEI NPs(或去離子水)共培養后的SEM圖像Fig.8 SEM images of S. aureus and E. coli co-cultured with PPy-PEI NPs (or deionized water) and treated with (or without) NIR

3 結 論

以PEI為穩定劑通過氧化聚合制備了水溶液分散的聚吡咯納米顆粒。通過水合粒徑、表面電位、紫外-可見光吸收光譜、SEM和TEM等測試證明了PPy-PEI NPs被成功地合成。PPy-PEI NPs表面呈電正性，能夠通過靜電吸引與表面整體帶負電荷的細菌相互作用，為后續的光熱殺菌提供便利。此外，在808 nm近紅外光照射下，PPy-PEI NPs表現出良好的光穩定性、光熱性和可循環性。通過細菌生長曲線和涂板計數法實驗，證明PPy-PEI NPs在近紅外光照射下對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有廣譜的光熱殺菌效果。PPy-PEI NPs抗菌機理主要是由于光熱作用引起蛋白和核酸的變性以及細菌膜結構的破壞。綜上所述，PPy-PEI NPs可以作為一種良好的光熱劑，在治療細菌感染和生物膜消除等領域具有潛在的應用。