著絲粒蛋白T在乳腺癌中表達及其啟動子區變異的研究

畢佳欣，王曉雪，趙若晗，韓 旭，宋 潔*

(牡丹江醫學院生物學教研室，黑龍江 牡丹江157011)

著絲粒蛋白(centromere specific proteins，CENPs)是裝配在染色體DNA上的一個多蛋白大型復合體，是著絲粒組裝和功能發揮的基本組成單位。在有絲分裂過程中形成動粒，動粒-微管組成連接，為細胞有絲分裂中染色體的移動提供動力。CENPs結構異常、表達異常或與DNA作用異常，將影響著絲粒點的形成、激活、對稱性等，從而影響染色體的穩定存在和正確分離。近年來，研究表明著絲粒蛋白調節異常或功能障礙會導致非整倍性并促進癌變。目前，在人體細胞中發現了多種CENPs，最先發現的是CENP-A、CENP-B，近期發現的有CENP-I、CENP-U、CENP-T等[1]，構成了動粒核心蛋白網絡(constitutively centromere-associated network，CCAN)。目前，文獻證實CCAN中CENPs如CENP-A、CENP-E、CENPF、CENP-H、CENP-W、CENP-U在多種腫瘤中出現過表達，并與腫瘤的發生發展密切相關。而CENP-T作為著絲粒內部結構，是直接參與著絲粒染色質的構建的重要成員，對細胞的CCAN網絡構成發揮重要作用[2-3]，但CENP-T在腫瘤中的表達情況及其在腫瘤發生發展中的作用機制還未見報道。因此，本課題以組織和細胞水平實驗研究CENP-T在乳腺癌中的表達、生物學功能及機制，為闡明動粒網絡蛋白在腫瘤中的作用機制研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣本及主要試劑

收集2017年10月—2018年4月間牡丹江市腫瘤醫院外科手術切除標本，乳腺癌患者的乳腺癌組織及遠離癌組織3～5 cm的癌旁正常乳腺組織26對，液氮保存。所有患者術前均未行任何治療，采集標本均得到患者的同意，標本經術后病理證實為浸潤型乳腺導管癌和乳腺導管內癌，排除其他腫瘤。本研究所使用的人體材料通過牡丹江醫學院醫學倫理委員會批準(批準文號2017-G11)。

正常人乳腺細胞系MCF10A和乳腺癌細胞系MCF7和MDA-MB-231均購于上海生命科學研究院細胞資源中心；兔抗人CENP-T多克隆抗體購于美國Gene Tex公司；CENP-T基因序列的特異性siRNA由廣州銳博公司設計并合成，轉染試劑Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司，兔超敏二步法免疫組化檢測試劑PV-6001及DAB購于北京中杉金橋公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購于碧云天公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于BD公司。

1.2 免疫組織化學法檢測CENP-T蛋白表達

兔二步法(兔聚合物法檢測系統PV)進行IHC。石蠟切片常規脫蠟水化，以檸檬酸鈉進行抗原修復，依次滴加過氧化物酶室溫孵育10 min、正常山羊血清室溫孵育15 min，CENT-P一抗(稀釋度均為1∶300，4℃過夜)、生物素標記的二抗，室溫孵育20 min，辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15 min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，脫水透明，封片。用PBS代替一抗作陰性對照。以卵巢癌石蠟切片為陽性對照。所有切片采用雙盲法，細胞核和胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，陽性程度根據其陽性細胞的比率和染色程度進行綜合評定。

1.3 CENP-T啟動子甲基化檢測

乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織10例進行啟動子甲基化檢測，采用Methprimer及EEMB OSS/cpgplot在線工具分析CENP-T啟動子區CpG島，兩個網站的預測結果一致，共存在一個CpG島，位置在1 819 bp至2 142 bp，長度324 bp，亞硫酸氫鹽修飾后測序(bisulfite sequencing PCR，BSP)法檢測CENP-T啟動子區CpG島甲基化水平。使用2對測序引物，分別為：1F：TTTGGTTATTGATAGAGAAGG；1R：AATA AAACCTTAAAACCCC；2F：GATAGGGATAAAGTTT TT；2R：AATAAAACCTTAAAACCCC，約需1～2套巢式引物，提取組織樣本DNA，亞硫酸鹽修飾DNA，PCR擴增，回收產物，1個樣本BSP單次產物挑取10個克隆，進行TA克隆測序。

1.4 CENP-T啟動子突變檢測

乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織10例進行CENP-T啟動子突變的檢測，使用染料終止子(Bigdye terminator，BDT)反應的Sanger測序法，BDT反應：10 μL反應體系，依次加入1 μL引物、2～5 μL模板、0～3 μL dH2O和4 μL預配好的Bigdye mix。每種樣品與試劑加入的順序，按照從上到下，或者從左到右的順序依次加入，加完引物、模板、dH2O以及Bigdye mix后，需要將實驗用的反應板進行離心，1 000 r/min離心，PCR反應程序：94℃、5 min；94℃、20 s，55℃、20 s，72℃、90 s 35個循環；72℃、7 min。然后電泳回收擴增的2 000 bp條帶DNA產物，最后用3對引物1F/1R、2F/2R和3F/3R進行測序。反應引物：1F，CGACATCGCACCACA GCACT；1R，CTTTTTCTCTAGTCAGGACCGT。2F，ATATGCAGGGTCAGTGGCTTT；2R，GGGCACGTAG ATTTCAGACTT。3F，GTTATTTCAAGACCTGTAGA；3R，TATGGTCGGGAACAGGGTGA。

1.5 MCF7細胞培養及siRNA轉染

MCF7細胞用含20%胎牛血清的高糖DMEM培養液，加入100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素，置于CO2體積分數為5%、濕度95%、37℃恒溫培養箱中培養。轉染實驗的細胞：MCF7細胞按每孔2.5×105個接種于6孔板，當細胞匯合度達60%～80%時進行轉染，轉染方法參照riboFECTTM說明書進行。siRNA轉染分為3組：未轉染對照組(NC)、轉染陰性對照組(NC siRNA)和 轉 染siRNA實 驗 組(CENP-T siRNA)。轉 染siRNA實驗組設計3對序列，評估CENP-T siRNA的序列1為5′-GGAGGTATTTGCTGCTCAT-3′，序列2為5′-GGAGGTCAATGCCTTTGCT-3′，序列3為5′-GAA GTTGAGTGGCCAAACA-3′。轉染6 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉染指示劑進行的轉染，判定當前轉染條件下細胞的轉染效率，確定siRNA轉染成功。轉染后使用含20%胎牛血清無雙抗培養基繼續培養，然后進行CENP-T蛋白表達水平檢測，篩選出敲減CENP-T蛋白表達水平50%以上的特異性siRNA序列，進行細胞增殖能力，細胞周期時相分布以及細胞凋亡率的檢測。

1.6 Western blot法檢測CENP-T蛋白的表達

采用Western blot法檢測乳腺癌組織、癌旁正常乳腺組織及MCF7、MDA-MB-231細胞和轉染后細胞中CENP-T和GAPDH蛋白的表達。組織液氮研磨加入裂解液裂解勻漿，超聲破碎，4℃離心20 min取上清液，電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，CENT-P一抗4℃過夜孵育(CENP-T工作液稀釋比例均為1∶300；GAPDH為1∶5 000)。二抗(工作液稀釋比例均為1∶5 000)，室溫孵育1 h，Super ECL超敏發光液，避光作用1 min，采用Amersham Imager600系統進行顯色。

1.7 MTT法檢測細胞活力

MCF7細胞轉染24 h后，于96孔培養板中每孔加入100 μL細胞懸液，每組設3個復孔。siRNA轉染MCF7細胞系分別于24、36、48和72 h后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，室溫下培養4 h后，吸棄孔內原有培養液，每孔加100 μL DMSO，紫外分光光度計檢測490 nm波長處各孔吸光度值D(490)，以時間為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，分析細胞活力。

1.8 細胞集落形成實驗檢測細胞增殖能力

收獲轉染后48 h的CENP-T siRNA組和NC siRNA組細胞接種于6孔板中，每孔接種200個細胞，培養10～14 d，當出現肉眼可見的集落時，終止培養，PBS沖洗3次，甲醇固定15 min，Giemsa染色15 min，清水沖洗掉多余的染液，鏡下計數，計算集落形成率。集落形成率=集落數/接種細胞數×100%，每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.9 流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡率

接種2.5×104個MCF7細胞于6孔板中，每個樣本設置3個復孔，采用20%無雙抗培養基培養24 h。轉染CENP-T siRNA后的MCF7細胞系和NC siRNA組的MCF7細胞系用20%無雙抗培養基置于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中繼續培養48 h。將每組細胞制備成單細胞懸液用于檢測細胞周期；加入1 mL預冷的70%乙醇，4℃固定過夜；1 000 g離心5 min，沉淀細胞，加入1 mL預冷PBS，重懸細胞；每管樣本中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，流式細胞儀(FACS Calibur，BD)在激發光波長488 nm處檢測熒光，同時檢測光散射情況。用于檢測細胞凋亡情況的CENP-T siRNA組和NC siRNA組MCF7細胞用胰酶消化1 min，獲得單細胞懸液，用預冷的PBS洗滌細胞兩次，然后將細胞重懸于1×結合緩沖液并稀釋濃度至1×106個/mL；取100 μL溶液(1×105個細胞)轉移至5 mL培養管中，分別加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI輕輕渦旋細胞，在室溫(25℃)下避光孵育15 min；向每管中加入400 μL的1×結合緩沖液，在1 h內用流式細胞儀檢測分析。

1.10 統計學處理

數據分析采用SPSS 16.0統計軟件分析。計數資料用χ2檢驗。計量資料以xˉ±s表示，用t檢驗或方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CENP-T在乳腺癌組織中的蛋白表達水平下調

采用在線數據庫GEPIA檢測CENP-T在乳腺癌組織(n=1 085)和癌旁正常乳腺組織(n=291)中的表達，結果如圖1A和B所示：與癌旁正常乳腺組織相比，CENP-T在乳腺癌組織的表達顯著降低，差異具有統計學意義(P＜0.05，圖1G)。免疫組化的檢測結果顯示CENP-T在乳腺癌和癌旁正常乳腺組織內主要著色于胞核，高倍鏡可觀察到胞核內有棕黃色顆粒，胞漿內也有部分表達(圖1C～F)。CENP-T在26對乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織中陽性表達率分別為84.62%和92.31%，陽性表達率差異無統計學意義(χ2=0.754，P=0.385)。然而，CENP-T在乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織中的表達程度差異有統計學意義(χ2=11.346；P=0.003)(見圖1，表1)。由此可見，CENP-T在乳腺癌組織細胞和癌旁正常乳腺組織細胞中均表達，只是表達的程度有差異，乳腺癌組織中CENP-T的蛋白表達水平下調。

圖1 CENP-T蛋白在乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中的表達

表1 CENP-T蛋白在乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織中的表達情況分析(n=26)

2.2 乳腺癌組織中CENP-T基因啟動子甲基化增加且啟動子突變

數據庫預測CENP-T甲基化位點。在乳腺癌中CENP-T蛋白表達下調的組織，匹配癌旁正常乳腺組織進行CENP-T基因啟動子序列PCR產物測序和DNA片段甲基化檢測，見圖2A。CENP-T基因啟動子甲基化檢測結果顯示：乳腺癌組織CENP-T基因啟動子甲基化程度(15.34±0.01)%，癌旁正常乳腺組織CENP-T基因啟動子甲基化程度(10.26±0.016)%，乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織比，CENP-T基因啟動子甲基化程度增加，差異有統計學意義(t=4.567，P=0.002)，見圖2B。啟動子突變情況分析結果，乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織進行CENP-T啟動子序列PCR產物測序見圖3，將測序結果進行blast比對，發現在乳腺癌組織中2例出現突變，1例組織檢測出啟動子的2個位點堿基突變分別為C1545T、C1628G，另外1例乳腺癌組織啟動子區C1417T堿基突變。

圖2 Western blot和BSP檢測乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中CENP-T蛋白表達及其基因啟動子CpG島甲基化水平圖

圖3 乳腺癌組織中CENP-T基因啟動子區突變分析

2.3 敲減CENP-T可能促進乳腺癌MCF7細胞增殖能力

首先，構建CENP-T敲減細胞系：如圖4A顯示CENP-T在細胞系中的蛋白表達情況，CENP-T在正常人乳腺細胞系MCF10A中蛋白表達水平高于乳腺癌細胞系MCF7和MDA-MB-231；CENP-T在MCF7細胞系的蛋白質表達水平較高而MDA-MB-231無表達，因此以MCF7為靶細胞構建CENP-T瞬時敲減細胞系。3種siRNA常規轉染MCF7后，Western blot檢測干擾效率如下圖4B和C。siRNA均能降低CENP-T的表達，其中CENP-T siRNA1的敲減率最高為98%，干擾后CENP-T幾乎不表達，CENP-T siRNA3的敲減率77%，CENP-T siRNA2的敲減率為45%。因此，后續實驗使用CENP-T siRNA3作為干擾序列觀察表達降低程度對細胞生物學特征的影響。

圖4 CENP-T在3種細胞系的表達及siRNAs序列沉默后的Western blot檢測結果

MTT實驗檢測細胞增殖能力。為檢測CENP-T對MCF7細胞的生長的作用，將細胞接種于96孔培養板上，設立CENP-T siRNA組和陰性對照siRNA組，連續培養3 d，計數結果按實驗方法中描述的繪制生長曲線如圖5A。CENP-T siRNA組表達下調促進了MCF7細胞的增殖，統計學分析CENP-T siRNA與NC在24、36、48、72 h的時間點上(t=1.692，P=0.160；t=2.636，P=0.054；t=5.475，P=0.005；t=4.328，P=0.012)。

細胞集落形成實驗檢測細胞增殖能力。陰性對照siRNA、CENP-T siRNA細胞的增殖情況如圖5B和5C所示，CENP-T siRNA組細胞集落形成率為82%，陰性對照siRNA集落形成率為62%，CENP-T siRNA組細胞集落形成率明顯高于另外兩組，與陰性對照siRNA組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，說明，CENP-T siRNA組增殖能力高于陰性對照siRNA組(P＜0.05)。

圖5 敲減CENP-T對MCF7細胞增殖能力的影響

2.4 敲減CENP-T后乳腺癌MCF7細胞G2/M期阻滯

流式細胞儀細胞周期檢測結果見圖6，結果顯示CENP-T siRNA組的MCF7細胞G1期細胞占(56.3+0.3)%，S期和G2/M期細胞分別占(30.8+0.8)%和(12.9+0.5)%。陰性對照siRNA組的MCF7細胞G1期細胞占(59.1±1.5)%，S期和G2/M期細胞分別占(31.6±0.8)%和(9.4±0.7)%(如圖6所示)。敲減CENP-T后的G1期細胞百分率減少了2.78%，S期細胞百分率下降了0.78%，G2/M期細胞百分率增加了3.45%(P＜0.01)。與陰性對照siRNA組相比，CENP-T siRNA組細胞的G2/M期明顯延長，S期的細胞數目幾乎無變化。

圖6 流式細胞術檢測敲減CENP-T后MCF7細胞周期時相分布圖

2.5 敲減CENP-T可能抑制乳腺癌MCF7細胞凋亡

利用流式細胞術檢測48 h各組細胞凋亡率，如圖7所示，CENP-T siRNA的總凋亡率為(0.12±0.11)%，與陰性對照siRNA組相比，t=24.68，P＜0.01，發生明顯抑制。

圖7 流式細胞術檢測敲減CENP-T后MCF7細胞凋亡率

CENP-T siRNA組的早期凋亡率為(0.10±0.01)%，與陰性對照siRNA組的(0.70±0.03)%相比，凋亡率降低，兩者比較差異有統計學意義(t=30.6，P＜0.01)，CENP-T表達下調抑制細胞凋亡形成。

3 討論

著絲粒是保證染色體穩定存在，保證細胞正常分裂的基本結構和功能元件之一。著絲粒蛋白家族有很多成員，其中哺乳類細胞中著絲粒蛋白的數目預計超過100，大多數命名為著絲粒蛋白，這些蛋白有的參與構成著絲粒，有的參與著絲粒發揮功能過程中的調控[4]。

早在1980年，Fritzler等[5]首先在硬皮病患者的血漿中發現了與著絲粒上不同的蛋白結合抗體，該發現促進了著絲粒蛋白的研究。CENP-T作為著絲粒蛋白成員之一，CENP-T的研究目前集中在其正常生物學結構和功能上。人類CENP-T基因位于染色體16q22.1，共由17個外顯子組成。Hellwig等[6]用熒光顯微鏡技術分析內部動粒蛋白CENP-T在活人類細胞中動力學變化。著絲點是染色體分離所必需的，它是通過包含許多著絲點蛋白的動態過程組裝起來的。CENP-T是一種內部的著絲點蛋白，在有絲分裂期間為外部著絲點Ndc80復合物的組裝提供平臺，確保了在有絲分裂過程中精確的著絲粒組裝[7-9]。著絲點組裝是由CENP-A啟動的，它與內部著絲點組成的著絲點相關網絡(CCAN)的組成成分發生物理相互作用，CENP-T也是組裝必須的[10]。缺乏CENP-T、CENP-A引起分裂后期滯后和分離錯誤[11]。著絲粒蛋白A(CENP-A)通過組成CENP-T復合體的著絲粒相關網絡來組織功能性的著絲粒。CENP-T可以直接與Holliday連接識別蛋白(HJURP)結合，通過時間調控的HJURP-CENP-T相互作用將CENP-T組裝到著絲粒上[12]。Thakur報道[13]，亞鐵還原能力實驗揭示了CENP-T在S期與著絲粒DNA結合，CENP-T獨立連接著絲粒α衛星重復序列-171 bp到外部動粒。Rago等[14]報道在著絲粒區域，CENP-T/CENP-W是CCAN上游調控分子，直接參與的著絲粒染色質結構的構建。而Hori等[15]實驗進一步證明，CENP-A和H3-CENP-T/W著絲粒蛋白復合體在調節著絲粒的構成和動粒活動具有特異性，使細胞可以在染色質構型之間切換，從而相互支持著絲粒的復制，并將著絲粒轉化為有絲分裂的狀態[16]。敲減CENP-T增加了CDH1(FZR1)的水平，導致(APC)-CDH1復合體的活性增加，抑制CCNB1水平，最終影響減數分裂[17]。多能干細胞(PSCs維持著豐富的CENP-A、CENP-C和CENP-T，但這些重要的著絲粒成分在干細胞著絲粒上顯著減少[18]。

目前，已經報道著絲粒蛋白許多重要成員在腫瘤的發生發展中發揮重要作用，例如Athwal、Arimura等[19-20]報道CENP-A基因過表達狀態影響基因的調控，影響染色質的脆性，而致惡性腫瘤的發生。研究人員在宮頸癌、胃癌[21-22]中也發現CENP-H的高表達，且與預后相關；CENP-W在膠質瘤組織中普遍高表達，對細胞的增殖侵襲有促進作用[23]，CENP-F表達與宮頸癌鱗狀細胞癌正相關[24]，而CENP-T與腫瘤相關文獻報道僅有1篇[25]。因此我們以CENP-T為靶點，探討其在腫瘤中的作用及機制。

本實驗采用免疫組織化學法研究CENP-T在乳腺癌的表達。實驗結果顯示乳腺癌中CENP-T的蛋白水平較癌旁正常乳腺組織蛋白表達水平顯著下降(P＜0.01)。這個結果與利用在線工具http://gepia.cancerpku.cn/檢索結果一致，并且該數據庫顯示CENP-T在其他腫瘤中也有相同的表達水平下調的情況。為進一步分析CENP-T在乳腺癌低表達的原因，本研究利用RNA敲減技術構建降低CENP-T表達的細胞系，探討CENP-T對腫瘤周期，細胞增殖以及細胞凋亡的影響，與對照組MCF7細胞比較，實驗結果發現，敲減CENP-T基因表達后，G1期細胞所占比例略有降低，S期細胞所占比例不變，G2/M期細胞所占比例明顯升高(P＜0.01)，同時，CENP-T基因表達減少率為77%后，當CENP-T敲減36 h時，MCF7細胞的增殖活性出現明顯增高(P＜0.005)，集落形成能力增強(P＜0.01)；表明CENP-T表達下調可能促進乳腺癌細胞增殖能力。可見CENP-T表達下調通過干擾遺傳物質的分配促進細胞的增殖。CENP-T siRNA轉染后，細胞系中發生凋亡的細胞比例顯著低于siRNA陰性對照組細胞(P＜0.01)；說明CENP-T表達下調可抑制乳腺癌細胞發生凋亡。

以上結果與已經報道CENPs在腫瘤中過表達相悖[21-24]，可能因為CENP-T在細胞中具有其他著絲粒蛋白家族不同的特點。雖然腫瘤發生發展中存在遺傳物質的不穩定性分配，但CENPs仍然是一個完整復合結構，在出現異常表達時各種CENPs作用調控不同的信號途徑。因此，我們進一步對CENP-T啟動子區的序列測序以及甲基化水平進行檢測，發現CENP-T啟動子區甲基化水平增加49.5%，并在過表達的乳腺癌組織中發現C1417T、C1545T、C1628G，3個位點兩種形式堿基突變，進一步以生物信息學篩選出與CENP-T密切相關的轉錄因子，以解釋CENP-T表達下調的分子機制，發現1545C是轉錄因子PR B，PR A結合位點，1628C、1417C是轉錄因子C/EBP BETA為結合位點。本研究只是發現了CENP-T啟動子區甲基化水平變化及突變，要證實這個啟動子區突變和CENP-T表達水平之間存在因果關系，還需要更多的實驗來支持。

綜上所述，CENP-T在乳腺癌表達下調，下調與啟動子區的序列甲基化修飾及突變密切相關。敲減CENP-T基因表達致增殖指數增加，促進細胞分裂進行，增強乳腺癌MCF7細胞增殖能力，抑制細胞凋亡。啟動子區的改變在乳腺癌中CENP-T表達下調的促癌細胞特征，究竟是何機制，還存在哪些信號分子作用改變腫瘤細胞的生物學行為，促進癌發生有待進一步研究。