亞甲基四氫葉酸脫氫酶2與腫瘤表型關系的研究進展

黃美慧，許圳南，薛家健，杜則澎，許海雄，劉明發，*

(1．汕頭市中心醫院中心實驗室，廣東 汕頭 515031；2．汕頭市中心醫院神經外科，廣東 汕頭515031)

惡性腫瘤的發生與發展，是多基因、多種信號通路以及細胞代謝改變等多因素共同參與導致的一種病理改變，死亡率較高，嚴重威脅著人民群眾的生命健康。腫瘤細胞處于快速分裂增殖過程，對于能量的需求明顯高于正常組織，因而腫瘤細胞可以通過改變自身代謝過程來適應生存。眾所周知，一碳代謝的異常可以滿足腫瘤細胞對高增殖率和生存的需求[1]。一碳代謝包括葉酸循環和甲硫氨酸循環，可以產生一碳單位，用于核苷酸的合成、DNA甲基化反應和還原性代謝過程。

亞甲基四氫葉酸脫氫酶2(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2，MTHFD2)屬于MTHFD家族(包含MTHFD1L、MTHFD1、MTHFD2L和MTHFD2)的成員，在腹水腫瘤細胞中首次被發現，不同于胞質中以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作為輔酶的MTHFD1，MTHFD2主要依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)[2]。MTHFD2由 一 個功能性前體失去合成酶的結構域形成[3]，具有亞甲基四氫葉酸脫氫酶和甲基四氫葉酸環化水解酶的雙重酶活性，在線粒體一碳代謝途徑中，可以將亞甲基四氫葉酸氧化為10-甲酰四氫葉酸[4]。在快速增殖的細胞中，MTHFD2活性較高，與葉酸代謝等途徑中的其他分子共同表達升高，使嘌呤、三磷酸腺苷、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的含量增加，從而促進細胞的快速增殖[5]。Nilsson等[6]分析了19種癌癥(共1 981例人類腫瘤樣本)的表達譜，發現MTHFD2是1 454種代謝酶中表達上調最為穩定的酶，這些均提示了MTHFD2在惡性腫瘤中可能發揮重要的生物學功能。因此，本文就MTHFD2在腫瘤細胞增殖、遷移侵襲、死亡及其臨床意義等方面的相關研究進展進行綜述。

1 MTHFD2的結構、定位及表達

人類MTHFD2(別名NMDMC)基因定位于2p13.1染色體，基因全長16 736 bp，含9個外顯子，8個內含子。MTHFD2蛋白由350個氨基酸構成，相對分子質量約為37 kD。MTHFD2為二聚體結構，其X-射線晶體結構顯示，該蛋白由兩個長α螺旋連接兩個結構域組成，并由一個小的D2螺旋在兩結構域之間形成一個大縫隙，配體的結合位點則位于大縫隙中[7]。可結合的配體包括NAD+、無機磷酸鹽和LY345899。

MTHFD2主要定位在線粒體，在線粒體中發揮脫氫酶活性作用，為核苷酸合成和其他甲基化反應提供一碳單位[8]。而Sheppard等[9]通過亞細胞分離技術發現，MTHFD2還可以定位在細胞核，且與DNA復制位點相同；Liu等[10]同樣證實了MTHFD2可以定位于細胞核，并參與細胞周期調控，但是對于細胞核內MTHFD2發揮的更多潛在功能仍不清楚。

值得注意的是，MTHFD2在胚胎發育過程中表達，在大多數正常成人組織中很少或者不表達[4]，但MTHFD2在乳腺癌、肺癌、卵巢癌和結直腸癌等惡性腫瘤中較正常癌旁組織的表達均升高[11-14]，且與這些腫瘤的預后不良密切相關。Koufaris等[15]研究者利用放線菌酮處理細胞，驗證了MTHFD2的半衰期明顯低于其他一碳代謝酶；另外，MTHFD2可被生長因子誘導表達。所以理論上MTHFD2抑制劑的作用相比于其他一碳代謝途徑抑制劑如甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)更具有選擇性[16]，MTHFD2可能是癌癥治療的安全靶標[17]。

2 MTHFD2與腫瘤表型關系的研究

惡性腫瘤具有持續性增殖、異常信號通路激活、凋亡減弱、細胞能量異常、基因組不穩定、持續的血管生成、組織的浸潤與轉移等表型特征，其中一碳代謝的異常可顯著影響腫瘤細胞的惡性表型[1]。近年來，研究表明MTHFD2在多種腫瘤比如乳腺癌、肝癌和結直腸癌中表達上調，且在腫瘤中能夠作為獨立預后因子，與預后不良相關。此外，MTHFD2表達的缺失，可以消除腫瘤的惡性表型，如增殖、遷移、侵襲和轉移等[18]。值得探討的是，本課題組研究MTHFD2在惡性膠質瘤中的生物學功能及機制時，發現MTHFD2可能與惡性膠質瘤細胞的遷移、侵襲和增殖等生物學功能密切相關(數據待發表)。

2.1 MTHFD2與細胞增殖

腫瘤細胞的持續性增殖能力，是腫瘤惡性進展的指標之一，臨床中常用的TNM分期中的T是指腫瘤的大小。Huang等[11]利用報告基因和集落形成等實驗技術發現，乳腺癌MCF-7細胞中MTHFD2顯著過表達后，蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)活性增強進而促進MCF-7細胞的增殖和集落形成。而Lehtinen等[19]則發現，MTHFD2對乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖并不產生明顯影響。在結直腸癌細胞中，MTHFD2水平增加引起S期細胞比例增加，細胞增殖加快，反之則細胞增殖減慢[14]。在卵巢癌中，Li等[13]發現抑制MTHFD2表達導致細胞周期蛋白B1/細胞分裂周期基因2復合物活性降低，引起G2/M期阻滯，進而抑制細胞增殖。在非小細胞肺癌中，Yu等[12]通過生物信息學分析并證實了MTHFD2敲降后，細胞周期蛋白A2、微小染色體維持蛋白7和S期激酶相關蛋白2的表達水平下調，進而抑制細胞增殖。在鼻咽癌中，MTHFD2敲降后，明顯抑制HK1、HNE1和6-10B細胞的增殖和集落形成能力[20]。但是，MTHFD2對肝癌細胞的增殖和周期分布無顯著作用[21]。由此可見，MTHFD2對腫瘤細胞增殖能力的影響并不一致，而因腫瘤類型或細胞類型的不同而作用不同。

2.2 MTHFD2與細胞遷移和侵襲

上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程對于腫瘤發生轉移是必不可少的[22]。多項研究表明，MTHFD2主要通過調節EMT和/或EMT相關信號通路的變化參與調控腫瘤細胞的遷移和侵襲過程。Liu等[21]的研究顯示，肝癌細胞Huh-7和HepG2中MTHFD2的表達被抑制后，上皮標志物E-鈣黏蛋白表達水平升高，間葉標志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達水平降低，EMT過程受阻，導致細胞遷移和侵襲能力減弱。Shi等[23]在肺腺癌細胞H1299和H1975中敲降MTHFD2后，發現EMT的變化與在肝癌中的研究結果類似，即EMT過程被抑制。隨后該團隊通過基因集富集分析和Western-blot技術驗證了MTHFD2可以激活AKT/糖原合成激酶3β/β-連環蛋白信號通路進而促進肺腺癌細胞的遷移。在卵巢癌細胞SKOV3和OVCAR8中，Li等[13]利用Western-blot技術發現MTHFD2表達下調引起信號轉導及轉錄活化蛋白3誘導的EMT過程受阻，進而抑制卵巢癌細胞的惡性進展。

血管生成是指新生血管形成的過程，在腫瘤惡性進展中起著重要作用。Hitzel等[24]團隊在研究用氧化磷脂處理內皮細胞后的代謝重編程過程中，通過建立貝葉斯(Bayesian)網絡模型發現了MTHFD2這一關鍵驅動因子；后續利用體外小鼠類器官模型，發現用siRNA敲降MTHFD2后，血管形成減少，若同時加入甘氨酸處理，血管形成能力有所恢復，表明依賴于MTHFD2的甘氨酸合成是血管生成所必備的；此外，該團隊在斑馬魚胚胎中敲降MTHFD2后，斑馬魚胚胎脈管系統的形態發生異常，進一步確認了MTHFD2對血管生成的重要性。血管生成在一定程度上與腫瘤的進展、侵襲和轉移能力密切相關[25]，MTHFD2極有可能通過參與代謝的重編程影響血管的生成，從而加速腫瘤的惡性進展過程。以上研究均提示MTHFD2在腫瘤細胞遷移和侵襲方面具有較一致的促進作用，但是由于腫瘤細胞所處微環境的復雜性，MTHFD2調節細胞遷移和侵襲的機制各不相同，仍需深入研究。

2.3 MTHFD2與細胞死亡

細胞死亡如凋亡、壞死、自噬等是被周密調控的復雜過程[26]。在持續的外界或自身不良因素作用下，細胞死亡的調控被打亂，異常的細胞可能會出現增殖加快，死亡減少等現象，最后導致細胞向惡性轉變。在卵巢癌中敲降MTHFD2表達后采用凋亡檢測顯示凋亡細胞比例明顯增加[13]。在肺腺癌中，Shi等[23]在體內外，分別利用流式細胞術及TUNEL實驗證明，MTHFD2敲降后，肺腺癌細胞PC-9和H1975凋亡顯著增加。同樣地，在結直腸癌RKO和SW-480細胞中過表達MTHFD2后，與對照組比較，過表達MTHFD2組中凋亡細胞顯著減少[14]；但也有報道[21]表明，MTHFD2對肝癌細胞的凋亡并不產生顯著影響，提示MTHFD2對凋亡的影響可能跟腫瘤類型相關。然而MTHFD2對其他細胞死亡形式的作用鮮少報道，有待深入探索挖掘。

2.4 MTHFD2與腫瘤治療

因MTHFD2是一碳代謝中的主要酶之一，且其生物學功能不斷被挖掘，研究者開始致力于探索其在治療上的作用。在肝癌細胞中，Liu等[21]發現抗腫瘤代謝藥物MTX不僅能夠降低MTHFD2的表達，同時在MTHFD2敲降的細胞中用MTX處理后，細胞的增殖活性降低更顯著。Lin等[2]在腎癌細胞中做了類似的實驗，發現在MTHFD2敲降的786-O細胞中，用MTX或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)處理后，細胞增殖活性被顯著抑制。這在一定程度上表明，MTHFD2的表達與化療藥物MTX和5-FU的敏感性值得被關注。

DS18561882是一種可口服的MTHFD2特異性抑制劑，Lee等[27]將DS18561882與細胞周期檢查點激酶1抑制劑結合起來，在體內外驗證了二者協同誘導三陰乳腺癌細胞凋亡的作用。Ju等[28]構建了結直腸癌人源性異種移植小鼠模型，并使用MTHFD2抑制劑LY345899處理，發現腫瘤生長受到抑制、細胞凋亡增加、腸系膜轉移結節明顯減少。Bonagas等[29]在體內急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)動物模型上，應用強效MTHFD2小分子抑制劑TH9619，并與AML的標準治療藥物阿糖胞苷(cytosine arabinoside，AraC)的效果進行比較，發現TH9619處理的小鼠體質量未發生改變且生存時間更長，而AraC處理的小鼠體質量減輕，提示TH9619在體內的毒性更小。Yang等[30]制備了一種新型的納米平臺，以酮縮硫醇交聯的氟化聚乙烯亞胺作為基因載體，形成包含MTHFD2和谷胱甘肽過氧化酶4敲降質粒的活性氧反應納米顆粒，并利用這兩種顆粒的促凋亡和誘導鐵死亡的作用共同處理癌細胞，在理論上安全有效且毒性小。這些報道為MTHFD2作為惡性腫瘤治療靶標，將其抑制劑或敲降質粒用于惡性腫瘤的臨床治療提供了有力證據和思路。

3 小結與展望

MTHFD2作為一碳代謝途徑中至關重要的酶，其功能活躍，與核苷酸合成、NADPH產生和氧化還原防御等密切相關。MTHFD2在多種惡性腫瘤中異常表達，且與患者的預后相關，但其分子機制各不相同，甚至有個別報道表明，MTHFD2很有可能不依賴其酶活性參與到腫瘤的惡性進展中。因此，在惡性腫瘤中，MTHFD2很有可能是具有雙重功能的蛋白，在特定的腫瘤微環境通過影響著腫瘤的惡性表型，進而影響腫瘤的惡性進展。

另外，影響腫瘤代謝是抗腫瘤藥物研發的重要環節，盡管已經有MTHFD2相關抑制劑的報道，但是應用到腫瘤本身的體內外研究仍較少，MTHFD2抑制劑的發現、制備以及在MTHFD2高表達的腫瘤中對其有效性和毒性進行體內外的驗證等問題，仍需進一步深入探討。MTHFD2若真正應用到臨床，亟需解決的問題還較多。例如，MTHFD2作為一碳代謝的主要酶類，能否直接作為臨床上的靶標；了解MTHFD2酶活性缺如狀態下生物學功能改變的具體機制；以及解決MTHFD2抑制劑的臨床應用等難題。總之，以MTHFD2為靶標以及以干擾腫瘤異常代謝為目的的治療方法，勢必成為未來惡性腫瘤預防診斷以及治療的新策略，真正的完善還需要更多的研究。