178件染發類化妝品細菌回復突變試驗結果分析

江 漪，吳劍輝，朱素珍，李培寧，劉香梅*

(廣州質量監督檢測研究院，廣東 廣州511447)

染發類化妝品屬于特殊化妝品，需經國務院藥品監督管理部門注冊后方可生產、進口。按化妝品注冊和備案檢驗項目要求，氧化型染發產品需進行細菌回復突變試驗(或體外哺乳動物細胞基因突變試驗)和體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗檢測致突變性。

2021年，全國藥品監督管理部門對染發類、洗發護發類、彩妝類、防曬類等11類化妝品抽檢，其中染發類產品合格率最低，為87.6%，其他類產品合格率均達到96%以上[1]。說明在不同種類的化妝品中，染發類產品存在較高的安全風險，需要監管部門重視。2018—2020年通告的染發類不合格樣品中，不合格原因主要是染發劑檢驗結果與配方或標簽標識的染發劑成分不符、超限量使用染發劑或添加禁用染發劑[2-3]。染料組分實測值與配方值不相符、甚至實測值超限值，提示染發劑存在較高的質量與安全隱患。氧化型染發劑中的染料前體、偶合劑等成分具有不同程度的致癌、致敏和遺傳毒性[4]。本文旨在根據2021年廣州質量監督檢測研究院檢測的178件染發類化妝品細菌回復突變試驗結果，確定檢出致突變陽性較多的菌株和劑量，分析染發類化妝品的致突變原因，探索染發類化妝品的安全風險因素。

1 材料與方法

1.1 材料

178件染發類化妝品為2021年企業送廣州質量監督檢測研究院檢測的產品，涵蓋33個品牌。試驗前按產品使用說明書將1劑染發膏和2劑雙氧奶按比例混合均勻后，用滅菌水配制12.5、25、50、100、200 mg/mL的受試物溶液備用。預設染發劑的最高劑量為20 mg/皿(+S9)、10 mg/皿(-S9)，以下按2倍梯度分別設3個劑量組。根據抑菌情況和受試物沉淀情況，調整劑量。

1.2 試驗菌株

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株，購自美國MOLTOX公司。試驗前，5種菌株均經過本實驗室鑒定，菌株的生物特性符合試驗要求。

1.3 主要試劑

疊氮鈉和2-氨基芴購于美國Sigma Aldrich公司，敵克松購于美國ChemService公司，1,8-二羥基蒽醌購于阿拉丁試劑有限公司，2-氨基蒽購于日本TCI公司，S9購于江蘇齊氏生物科技有限公司，輔酶Ⅱ購于上海源葉生物科技有限公司，6-磷酸葡萄糖購于阿拉丁試劑有限公司。

1.4 代謝物活化系統

S9加相應的輔助因子(6-磷酸葡萄糖、輔酶Ⅱ)配制成含10% S9的混合液(S9mix)，作為體外代謝活化系統。臨用時配制，保存于冰浴中，備用。

1.5 主要儀器

全自動Ames試驗儀購于北京慧榮和科技有限公司；菌落計數儀購于杭州迅數科技有限公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌器購于日本Hirayama公司；SHEL LAB生化培養箱購于美國SHEL LAB公司；SBS40振蕩水浴購于英國BIBBY STUART公司。

1.6 方法

依據《化妝品安全技術規范》(2015年版)[5]細菌回復突變試驗，檢測178件染發類化妝品的致突變性。

1.6.1 增菌培養分別于TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535主平板取生長良好的單個菌落接種于營養肉湯培養基中，混勻，37℃振蕩(100 r/min)培養10 h。

1.6.2 平板摻入法采用全自動Ames試驗儀，將頂層瓊脂培養基2.0 mL加入試管中，然后每管依次加入0.1 mL受試物溶液、0.1 mL試驗菌株增菌液和0.5 mL磷酸鹽緩沖液或者0.5 mL S9混合液(需代謝活化時)，充分混勻，迅速傾入底層培養基平板上，轉動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培養箱里培養48 h，記錄每皿回變菌落數。

試驗在加和不加S9混合液的條件下進行，除設受試物各劑量組外，同時設空白對照組、溶劑對照組、陽性對照組和無菌對照組。每個劑量均做3個平行平板。

1.6.3 數據處理計算各菌株各劑量3個平板回變菌落數的均值和標準差。

1.6.4 結果評價受試物誘發的TA97a、TA98、TA100、TA102回變菌落數是溶劑對照組的2倍或2倍以上，受試物誘發的TA1535的回變菌落數是溶劑對照組的3倍或3倍以上，并出現以下情形之一，則該染發劑判定為致突變陽性：①呈劑量-反應關系；②任何一個劑量條件下，出現陽性反應并有可重復性。染發劑經上述5個試驗菌株測定后，只要有1個試驗菌株，無論在加S9或不加S9條件下為陽性，均可報告該染發劑細菌回復突變試驗為致突變陽性。如果染發劑經5個試驗菌株檢測后，無論加S9和不加S9均為陰性，則可報告該染發劑為致突變陰性。

1.6.5 數據分析錄入染發類化妝品信息(名稱、品牌、加或不加S9、最高劑量、陽性菌株、陽性劑量)，采用Microsoft Excel進行數據整理分析。

2 結果

2.1 178件染發類化妝品細菌回復突變試驗的最高劑量

178件染發類化妝品中，在加S9條件下，無細菌毒性、最高劑量為20 mg/皿的有99件，占比55.62%，平皿中無抑菌、沉淀輕微可見。有細菌毒性、最高劑量為10 mg/皿的有72件，占比40.45%。在不加S9條件下，20 mg/皿會產生細菌毒性，最高的劑量為10 mg/皿，占比9.55%；最高劑量5 mg/皿占比最高，為60.67%，有108件。最高劑量的分布情況見表1。

表1 178件染發類化妝品細菌回復突變試驗最高劑量的分布

2.2 178件染發類化妝品細菌回復突變試驗的陽性率

178件染發類化妝品中，在加S9的條件下，細菌回復突變試驗陽性的樣品數為35件，這35件中的7件，不加S9的條件下，致突變性亦為陽性。剩下的143件染發類化妝品，在加S9和不加S9條件下均為致突變陰性。因此，178件染發類化妝品中致突變陽性的有35件，陽性率為19.67%。

2.3 5種試驗菌株測定細菌回復突變試驗的陽性結果

35件致突變陽性的染發類化妝品中，5個菌株的陽性檢出數量分別為：TA98 35件，TA97a 15件，TA100 2件，TA102 0件，TA1535 2件。TA97a、TA100、TA1535致突變性陽性的樣品，TA98致突變性也為陽性。

2.4 5種試驗菌株陽性結果的劑量分布情況

致突變陽性的染發類化妝品，隨著劑量的升高，回變菌落數升高，陽性反應出現在高劑量組。35件致突變陽性的染發類化妝品中，加S9的條件下，TA97a出現陽性反應最多的劑量為10 mg/皿，TA98出現陽性反應最多的劑量為5 mg/皿；不加S9的條件下，TA98出現陽性反應最多的劑量為2.5 mg/皿。結果見表2。

表2 35件細菌回復突變試驗陽性的染發類化妝品陽性劑量分布(件)

2.5 不同品牌細菌回復突變試驗致突變陽性結果的分布情況

33個品牌178件染發類化妝品的陽性檢出結果如表3。不同品牌染發類化妝品細菌回復突變試驗陽性檢出率差異較大，最低的為0，最高的達60%。

表3 不同品牌染發類化妝品細菌回復突變試驗陽性結果分布

3 討論

染發劑最高劑量由溶解度和細菌毒性決定，178件染發類化妝品細菌回復突變試驗最高劑量的結果顯示，在加S9的條件下，96.07%的染發類化妝品最高劑量為20或10 mg/皿；在不加S9的條件下，60.67%的染發類化妝品最高劑量為5 mg/皿。此數據可為染發劑的劑量設計提供參考。加S9后，染發類化妝品細菌毒性降低，說明S9中的生物轉化酶作用染發類化妝品后對細菌產生減毒作用。

178件染發類化妝品細菌回復突變試驗致突變陽性率為19.67%(35件)，且均在加S9下致突變陽性，說明染發類化妝品中具有致突變性的多為需要代謝活化的染料組分。在35件致突變陽性的染發類化妝品中，TA98、TA97a的陽性檢出數量較高，陽性劑量多出現在10和5 mg/皿。TA97a和TA98能檢測移碼突變，說明致突變陽性的染發類化妝品中含有同時導致TA97a、TA98突變的染料組分，且TA98能檢測出更多需要代謝活化的致突變物。有研究表明在S9的參與下，經由過氧化氫處理后，染發劑配方中鄰苯二胺、對-氯-鄰苯二胺、間苯二胺、對-甲氧基-間苯二胺的致突變活性明顯增加[6-7]。還有相關研究表示，氧化型染發劑染料前體被過氧化氫氧化后，其氧化產物經代謝活化后對TA98具有較強的回復致突變作用[8]。本次研究結果與該結論一致。

送檢的13個品牌(送檢染發類化妝品數量不小于5件)致突變陽性檢出率差異較大，范圍涵蓋0～60%，分析可能與染發劑配方中染料前體的含量有較大關聯。因此，在染發劑的配方開發中，需加強對著色劑成分含量與組合的研究，在保證染色效果的情況下，提高染發劑的安全性。